Các axit béo trong dầu hạt thực vật.
93Tạp chí Hóa học, T. 40, số ĐB, Tr. 93 - 99, 2002 Các axit béo cyclopropenoic trong dầu hạt thực vật Việt nam: Hibiscus Sabdariffa Lin. và Gnetum Latifolium Blume Đến Tòa soạn 1-7-2002 Phạm Quốc Long1, Đon Lan Phơng1, K.Vosmann2, K. Aitzetmuller21Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên Trung tâm KHTN&CNQG 2Viện nghiên cứu Hóa - Lý chất béo, Muenster - CHLB Đức Summary Cyclopropenoic fatty acids ( CPEFA ): malvalic acid and sterculic acid have been found in seed oil of Hibiscus Sabdariffa Lin. and Gnetum Latifolium Blume of Vietnam by GC with AgNO3/ MeOH rearrangement derivatization. The contents of CPEFA were in Hibiscus Sabdariffa Lin. (18:CE 1.33%; 19:CE 0.50%) and Gnetum Latifolium Blume (18:CE 32.50%; 19:CE 8.86%). Structure of malvalic acid and sterculic acid were confirmed by GC-MS of their ether rearrangement products and discussed also. I - Mở Đầu Các axit béo cyclopropenoic (CPEFA) luôn có mặt trong dầu các hạt thực vật bậc cao, v( đ*đ+ợc phát hiện từ hơn 30 năm nay [1, 2]. Các t(i liệu đ* chỉ ra rằng có 2 dạng CPEFA th+ờng gặp trong thực tế l(: axit sterculic (9,10 - methylene-9-octadecenoic) v( axit malvalic (8,9-methylene-8-heptadecanoic), ngo(i ra những axit hay tìm thấy cùng có mặt với các CPEFA trong nhiều loại hạt thực vật khác l(:dihydrosterculic v( dihydromalvalic [3, 4]. Những axit loại n(y đều có một vòng nhỏ tồn tại trong mạch d(i cácbon l( cấu trúc phân tử của axit béo, chính chúng l( nguyên nhân kìm h*m h(ng loạt các enzym quyết định của các quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể sống, v( có nhiều bằng chứng cho thấy chúng l( độc v( có thể l( tác nhân gây ung th+ cho động vật bậc cao [5, 6]. Đ* có nhiều ph+ơng pháp nghiên cứu v(nhận dạng các CPEFA: từ các ph+ơng pháp cơ bản của Durbetaki [7], ph+ơng pháp phản ứng hóa học của Halphen [8, 9], ph+ơng pháp phân tích bởi cộng h+ởng từ hạt nhân (NMR) [10], v( ph+ơng pháp phân tích bằng sắc kí khí (GC) của các dẫn xuất CPEFA sau khi phản ứng với AgNO3/ MeOH [11 - 13]. Trong thời gian gần đây, nhờ có sự phát triển v+ợt bậc của các kĩ thuật phân tích sắc kí khí mao quản có kết hợp với phổ khối l+ợng (GC-MS), nên việc phân tích v( nhận dạng các CPEFA đ* dễ d(ng, nhanh v( chính xác hơn rất nhiều [14]. Theo các t(i liệu đ* công bố ở trên, các CPEFA phổ biến hay có mặt trong dầu hạt các họ thực vật: Malvaceae (ng(nh Angiospermae) v( Gnetaceae (ng(nh Gymnospermae). B(i báo n(y đề cập đến các kết quả phân tích về các CPEFA có trong dầu hạt 2 cây: Hibiscus Sabdariffa Lin. (Họ Malvaceae) v( Gnetum Latifolium Blume (Họ Gnetaceae) của Việt Nam có sử dụng các kĩ thuật phân tích hiện đại GC v( GC-MS đ* nêu ở trên [14]. 94II - Nguyên liệu v phơng pháp 1. Nguyên liệu Mẫu hạt thực vật đ+ợc thu thập tại Việt nam v( đ+ợc các nh( sinh vật học phân loại, định tên khoa học: hạt Dâm bụt dấm Hibiscus Sabdariffa Lin. (thu 6/1999 tại Hòa Bình), v(hạt Gắm núi đá Gnetum Latifolium Blume (thu 11/2000 tại Yên Bái). Các mẫu hạt sau khi đ+ợc chọn lọc, bảo quản ở điều kiện tiêu chuẩn (4oC, độ ẩm không đổi), v( đ+ợc mang sang Viện nghiên cứu Hóa - Lý chất béo CHLB Đức để phân tích. 2. Phân tích sắc kí khí (GC) Chiết xuất dầu béo từ các mẫu hạt thực vật đ+ợc thực hiện theo ph+ơng pháp tiêu chuẩn ISO/DIS 659: 1988. Nhận dạng các CPEFA tr+ớc v( sau phản ứng với AgNO3/ MeOH đ+ợcxác định d+ới dạng metyleste của các axit béo trên sắc kí khí (GC) theo ph+ơng pháp tiêu chuẩn ISO/FDIS 5590 : 1998. Trong thực nghiệm 10 mg dầu béo đ+ợc hòa tan với 1 ml Petrol ete trong lọ nhỏ nút kín, bổ sung 25 àldung dịch natri metanolat trong metanol (2 mol/l ) v( lắc kĩ trong 1 phút. Thêm v(o 20 mg monohidrat sunphat hiđrônatri loại sạch, lắc kĩ v( đem li tâm ở chế độ 5000 v/phút trong 1 phút. Dịch trong, sạch ở pha trên thu đ+ợc l(dạng methylester của các CPEFA tr+ớc phản ứng với AgNO3/MeOH đ+ợc tách riêng v( đem phân tích trên máy sắc kí khí HEWLETT PACKARD 5890 Series II theo chế độ: Cột mao quản CP- Sil 88, 100 m/0,25ID/ 0,2 àm, ch+ơng trình nhiệt độ: 155oC - 220oC(1,5oC/phút), Injector 250oC, detector 250oC, khí mang H2. Tiếp theo điều chế dạng methylester CPEFA sau phản ứng với AgNO3/MeOH: 5 mg metyleste CPEFA tr+ớc phản ứng đem hòa tan trong 0,5 ml AgNO3b*o hòa trong MeOH khan, phản ứng đ+ợc giữ ở 30oCtrong 2 giờ, sau đó xử lí với 1 ml H2O, chiết 2 lần bằng với 0,5 ml petrol ete-l(m khan thu đ+ợc hỗn hợp dẫn xuất các metyleste CPEFA sau phản ứng với AgNO3/MeOH v( đem phân tích trên sắc kí khí, điều kiện nh+ đ* mô tả ở trên có so sánh với hệ chất chuẩn. 3. Phân tích GC-MS Các dẫn xuất của metyleste các CPEFA sau phản ứng với AgNO3/MeOH đ+ợc phân tích để chứng minh cấu trúc trên máy GC-MS của h*ng HEWLETT- PACKARD Model 5890 Series II/5989 A (Palo Alto.CA), cột mao quản OV-1 Fused silica (30 m/0,25ID/ 0,25 àm, Macherey-Nagel, Duren- Germany ), EI : 70 eV, khí mang He tốc độ 1,0 ml/phút, chạy ch+ơng trình 140oC/5 phút , 140oC - 260oC tốc độ: 4oC/phút, 260oC/5 phút, Split 1: 20, Injector 280oC. Sử dụng phổ dữ liệu chất chuẩn. Sơ đồ phân tích các CPEFA đ+ợc biểu diễn trên hình 1: Mẫu dầu hạt Tổng metyleste của các axit béo bình th+ờng+ CPEFA tr+ớc phản ứng với AgNO3/ MeOH Phân tích sắc kí khí (GC) So sánh Tổng metyleste của các axit béo bình th+ờng Phân tích sắc kí khí (GC) + CPEFA dẫn xuất sau phản ứng với AgNO3/MeOH Phân tích cấu trúc các dẫn xuất CPEFA bằng GC-MS Hình 1: Sơ đồ tiến h(nh công việc phân tích các CPEFA 95Để phân lập v( nhận dạng các CPEFA đ*có nhiều t(i liệu đề cập đến nhiều ph+ơng pháp khác nhau nh+: ph+ơng pháp phân lập hóa học, phản ứng ôxi hóa với các tác nhân khác nhau, phản ứng no hóa nối đôi bằng xúc tác, phản ứng đặc hiệu (Halphen test), phản ứng với axít, phản ứng với mercaptans, cũng nh+ sử dụng các ph+ơng pháp phổ khác nhau nh+: IR NMR,MS .[15]. Trong tr+ờng hợp ở đây CPEFA l( 2 chất: Steculic v( Malvalic axit có trong th(nh phần dầu 2 loại hạt: Hibiscus Sabdariffa Lin. (Họ Malvaceae) v( Gnetum Latifolium Blume (Họ Gnetaceae) của Việt Nam, đ+ợc tiến h(nh phân tích v( nhận dạng bởi ph+ơng pháp rất có hiệu quả m( hay đ+ợc sử dụng gần đây l(: phản ứng của các methyl CPEFA với AgNO3b*o hòa trong MeOH có kết hợp kĩ thuật phân tích bởi GC v( GC-MS [14, 15]. Khi đó đối với mỗi chất sẽ có 2 sản phẩm dẫn xuất metoxy ete v( 2 sản phẩm dẫn xuất isomers enonic t+ơng ứng nh+: từ metyl mavalate 18 : CE sẽ tạo 2 sản phẩm metoxy ether (18: CM1+ 18: CM2) v( 2 sản phẩm dẫn xuất isomers enonic (18: CC1+ 18: CC2), t+ơng tự từ metyl sterculat 19: CE sẽ tạo 2 sản phẩm metoxy ete (19: CM1+ 19: CM2) v( 2 sản phẩm dẫn xuất isomers enonic (19: CC1+ 19: CC2) [13], sơ đồ phản ứng tạo các chất dẫn xuất của CPEFA khi phản ứng với AgNO3/MeOH đ+ợc trình b(y trên hình 2. Hình 2: Sơ đồ tạo các dẫn xuất của CPEFA III - Kết quả v thảo luận Hình 1 l( sắc kí đồ (GC) tổng metyleste của các axit béo bình th+ờng+CPEFA tr+ớc phản ứng với AgNO3/MeOH (a) v( tổng metyleste của các axit béo bình th+ờng+CPEFA dẫn xuất sau phản ứng với AgNO3/MeOH (b) v( các số liệu so sánh chi tiết (bảng 1) của 2 mẫu hạt phân tích. Qua kết quả phân tích trên sắc kí khí (GC)-CH3(CH2)7C C(CH2)6COOCH3OMetyl malvalat 18: CEAgNO3/MeOHCH3(CH2)7C C(CH2)7COOCH3OMetyl sterculat 198: CEAgNO3/MeOHCH3(CH2)7C CH(CH2)6COOCH3CH2OCH3CH3(CH2)7CH C(CH2)6COOCH3CH2OCH3CH3(CH2)7C CH(CH2)7COOCH3CH2OCH3CH3(CH2)7CH C(CH2)7COOCH3CH2OCH318: CM1v& 18: CM219: CM1v& 19: CM2Metoxy eteCH3(CH2)7C C(CH2)6COOCH3CH218: CC1v& 18: CC219: CC1v& 19: CC2Enoic isomeOCH3(CH2)7C C(CH2)6COOCH3H2COCH3(CH2)7C C(CH2)7COOCH3CH2OCH3(CH2)7C C(CH2)7COOCH3H2CO 96Hình 1: Phổ sắc kí đồ (GC) dạng metyleste của dầu hạt Hibiscus Sabdariffa Lin. v( Gnetum Latifolium Blume tr+ớc v( sau phản ứng với AgNO3/MeOH, pic đánh dấu (*) dự đoán l( dẫn xuất ketone của axit béo số liệu chỉ ra ở bảng 1, ta thấy rõ r(ng h(ml+ợng của hầu hết các axit béo bình th+ờng tr+ớc v( sau phản ứng không thay đổi - trừ các CPEFA. Cụ thể mẫu hạt Hibiscus Sabdariffa Lin. có h(m l+ợng Malvalic 18: CE tr+ớc phản ứng l( 1,33%, sau phản ứng đ* không còn nữa m( chuyển th(nh 2 dạng sản phẩm metoxy ete (18: CM1+ 18: CM2) l( 1,29%; v( h(ml+ợng Sterculic 19: CE tr+ớc phản ứng l( 0,5%, sau phản ứng đ* chuyển th(nh 2 dạng dẫn xuất (19: CM1+ 19: CM2) l( 0,59%. T+ơng tự đối với mẫu hạt: Gnetum Latifolium Blume,tr+ớc phản ứng h(m l+ợng Malvalic 18: CE l(32,50%, sau phản ứng đ* chuyển hết th(nh 2dạng sản phẩm metoxy ete (18: CM1+ 18: CM2)l( 28,62%; còn h(m l+ợng Sterculic 19: CE tr+ớc phản ứng l( 8,86 %, sau phản ứng đ*chuyển th(nh 2 dạng dẫn xuất (19: CM1+ 19: CM2) l( 8,14%. Các kết quả trên đều phù hợp với sự giải thích quá trình phân mảnh tạo các dẫn xuất sản phẩm dạng metoxy ete của các CPEFA đ* nêu ra ở trên [13, 14]. Để đối chứng, ta có thể khảo sát thêm các kết quả đ* đ+ợc phân tích nhận dạng các CPEFA có h(m l+ợng cao ở mẫu hạt Welwitschia mirabilis (Châu Phi) [8], với cùng ph+ơng pháp phản ứng với AgNO3/MeOH v( phân tích trên GC v( GC-MS nh+ trên. Kết quả cũng đ* đ+ợc chỉ ra trên bảng 1 cho thấy h(m l+ợng 18: CE v( 19: CE tr+ớcphản ứng của mẫu hạt Welwitschia mirabilis l(:18: CE 6,0% v( 19: CE 0,6%, sau phản ứng cũng chuyển hóa th(nh các dẫn xuất CPEFA đúng nh+ dự kiến nh+: (18: CM1+ 18: CM2)l( 5,6%; (19: CM1+ 19: CM2) l( 0,6%. Nói chung các isomer enonic tạo th(nh của mẫu dầu các hạt phân tích l( rất thấp trong phản ứng với AgNO3/MeOH ở trên, ví dụ nh+ chỉ có 0,6% dạng (18: CC1+ 18: CC2) đ+ợc tạo th(nh ở hạt Gnetum Latifolium Blume, v( có 0,12% dạng (19: CC1+ 19: CC2) đ+ợc tạo th(nh ở hạt Hibiscus Sabdariffa Lin., còn ở hạt Welwitschia mirabilis không có sản phẩm dạng n(y. Các phân tích khác về h(m l+ợng các CPEFA có trong các mẫu hạt: Hibiscus Sabdariffa Lin.(Họ Malvaceae) v( Gnetum Latifolium Blume (Họ Gnetaceae) ở các địa điểm khác nhau trên 97thế giới trong h(ng loạt các t(i liệu [11, 12, 13, 14, 15] cũng cho kết quả t+ơng đối phù hợp với kết quả phân tích nhận đ+ợc ở trong b(i báo n(y.Bảng 1: H(m l+ợng metyleste axit béo + CPEFA tr+ớc v( sau phản ứngvới AgNO3/MeOH Hibiscus Sabdariffa Lin.Gnetum Latifolium Blume Welwitschia mirabilis [ 8 ]Các axit béo a b a b a bH(m l+ợng dầu hạt (% TL) 16,86 (cả vỏ) 3,17 (nhân) 18,2 (cả vỏ) 14:0 0,15 0,15 0,12 0,14 0,2 0,2 15:0 0,01 0,01 0,30 0,25 0,1 0,1 16:0 17,01 16,62 8,01 7,49 21,4 21,3 16:1n7 0,46 0,48 0,11 0,16 0,7 0,7 17:0 0,11 0,13 0,43 0,41 0,6 0,6 17:1n7 0,09 0,09 0,43 0,27 - - 18:0 2,76 2,73 9,22 8,77 2,7 2,7 Malvalic 18: CE 1,33 - 32,50 - 6,0 -18:1n9 27,39 27,19 16,27 15,42 11,1 11,0 18:2n6 42,65 42,11 3,79 3,58 15,1 15,0 Sterculic 19: CE 0,50 - 8,86 - 0,6 -*Unknown 2,06 2,25 2,70 2,50 - - 18:3n3 0,29 0,29 3,74 3,41 33,5 33,6 20:0 0,41 0,42 1,79 1,92 0,2 0,2 20:1n9 0,06 0,05 0,50 0,51 0,1 0,1 18: CM1+18: CM2- 1,29 - 28,62 - 5,619: CM1+19: CM2- 0,59 - 8,14 - 0,622:0 0,30 0,46 1,06 1,07 0,2 - 18: CC1+18: CC2- - - 0,60 - -22:1n9 0,04 0,08 0,36 0,63 - - 19: CC1+19: CC2- 0,12 - - - -Epoxy? 2,73 2,57 - - - 0,5 24:0 0,19 0,20 0,52 0,53 0,3 0,3 a. H(m l+ợng axit béo bình th+ờng + CPEFA tr+ớc phản ứng với AgNO3/MeOH b. H(m l+ợng axit béo bình th+ờng + dẫn xuất CPEFA sau phản ứng với AgNO3/MeOH [8] số liệu đối chứng kết quả phân tích trên dầu hạt Welwitschia mirabilis (Gymnosperm)Cấu trúc của axit malvalic v( axit sterculic đ+ợc xác nhận trên phổ GC-MS d+ới dạng phân mảnh các sản phẩm ete của chúng. Phổ khối MS các dạng phân mảnh của các sản phẩm 98ether của axit malvalic v( axit sterculic thể hiện trên hình 2 đ* đ+ợc khảo sát chi tiết trong các t(i liệu [12, 13]. Chúng có pic cơ sở l(: m/z 85 v( các pic tăng c+ờng ở m/z 55, 71, 81, 95. Ngo(i ra pic ion phân tử ở m/z 326 (axit malvalic) v( m/z 340 (axit sterculic), tự chúng đ+ợc xác nhận bởi sự bổ sung thêm metanol v(o CPEFA metyl este của chúng. ở đây cũng có mảnh đặc tr+ng của mảnh gốc mẹ trừ đi khối l+ợng 32 đơn vị đ+ợc giới thiệu trong phổ l(:m/z 294 (axit malvalic) v( m/z 308 (axit sterculic), nó chỉ thị sự mất đi của metanol từ ion phân tử. Một trong những dẫn xuất keton đ+ợc dự đoán th+ờng xảy ra ở mức độ thấp [12], thể hiện ở pic đánh dấu (*) trong hình 1 v(bảng 1, nh+ng không thể đ+ợc xác nhận củng cố bởi phổ GC-MS bởi vì pic chuẩn đoán quan trọng đ* biết có thể không có mặt trong phổ MScủa chúng. IV - Kết luận Đ* khảo sát h(m l+ợng 2 chất: axit steculic v( axit malvalic thuộc nhóm các CPEFA có mặt trong th(nh phần dầu 2 loại hạt: Hibiscus Sabdariffa Lin. (Họ Malvaceae) v( Gnetum Latifolium Blume (Họ Gnetaceae) của Việt Nam. Sử dụng ph+ơng pháp phân tích nhanh rất có hiệu quả l( phản ứng của các metyl CPEFA với AgNO3b*o hòa trong MeOH có kết hợp kĩ thuật phân tích bởi GC để nhận dạng các dẫn xuất metyl este của các CPEFA (axit malvalic v( axit sterculic) sau phản ứng với AgNO3/MeOH. Cấu trúc của chúng cũng đ+ợc xác nhận trên phổ GC-MS. Hình 2: Phổ GC-MS của dẫn xuất metyleste của CPEFA sau phản ứng với AgNO3/MeOHLời cám ơn: DRới sự tUi trợ tUi chính của DAAD cho chuyến đi công tác khoa học, công việc đRợc hoUn thUnh tại Phòng thí nghiệm dầu thực vật, Viện nghiên cứu Hóa - Lí chất béo, Muenster - CHLB Đức, tác giả cũng chân thUnhcám ơn sự giúp đỡ tận tình của CN Nguyễn Hữu Phú trong thu thập vU định tên mẫu hạt thực vật, Dr. B. Matthaus vU Dr. L. Bruhl trong quá trình tiến hUnh công việc tại CHLB Đức. Ti liệu tham khảo 1. C. R. Smith. Jr. Progress in the Chemistry of Fats and other Lipids, Pergamon Press: 99NewYork, Vol. XI, Part I, P. 139 - 177 (1970). 2. W. W. Christic. In Topics in Lipids Chemistry, Gunstone F.D., Ed: Logos Press, London, Vol. 1, P. 1 - 50 (1970). 3. M. B. Bohannon, et al. Lipids, Vol. 13, P. 270 - 273 (1978). 4. J. R. Vickery. J. Am. Oil Chem Soc., Vol. 57, P. 87 - 91 (1980). 5. R. A. Phelps, et al. J. Food Sci. Vol. 44, P. 358 - 394 (1964). 6. Lª D. J et al, Cancer Res., Vol. 31, P. 960 -963 (1971). 7. Durbetaki A., J. Anal. Chem. Vol. 28, P. 2000 - 2001 (1956). 8. G. Halphen. J. Pharmacol , Vol. 6, P. 390 -392 (1987). 9. E. C. Colemanl. J. Assoc. off. Anal. Chem., Vol. 53, P. 1209 - 1213 (1970). 10. N. E. Pawlowski, et al. J. Am. Oil Chem. Soc., Vol. 49, P. 387 - 392 (1972). 11. E. L. Schneider, et al. J. Am. Oil chem. Soc., Vol. 45, P. 585 - 590 (1968). 12. M. S. Ahmhad, et al. J. A. Chem. Phys. Lipids, Vol. 25, P. 29 - 38 (1979). 13. Bianchini J. P. et al. Anal. Chem. Vol. 53, P. 2194 - 2201 (1981). 14. K. Aitzetmuller et al. JAOSC, Vol. 75, No. 12, P. 1761 - 1765 (1998). 15. W. C. William. Topics in Lipid Chemitry, Vol. 1, F.D (1969). . I - Mở Đầu Các axit béo cyclopropenoic (CPEFA) luôn có mặt trong dầu các hạt thực vật bậc cao, v( đ*đ+ợc phát hiện từ hơn 30 năm nay [1, 2]. Các t(i liệu. 93Tạp chí Hóa học, T. 40, số ĐB, Tr. 93 - 99, 2002 Các axit béo cyclopropenoic trong dầu hạt thực vật Việt nam: Hibiscus Sabdariffa Lin. và Gnetum Latifolium