Kết quả trong bảng 2 cho thấy hàm lượng ức chế tối thiểu đ ối với các chủng nấm mốc khác nhau là khác nhau, có những chủng với hàm lượng α- bromcinnamaldehyde là 1mg đ ã có tác dụng [r]
(1)Nghiên cứu khoa học công nghệ
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO SẢN PHẨM CHỐNG NẤM MỐC
CHO GIÀY DA QUÂN NHU TỪ NGUYÊN LIỆU QUẾ
VÕ THỊ HOÀI THU, NGUYỄN TRỌNG DÂN, ĐINH THỊ THU TRANG, NGUYỄN TRƯỜNG GIANG, ĐỖ THỊ THÚY
1
Đ
Ặ
T V
Ấ
N
Đ
Ề
Trong
đ
iều kiện khí hậu nhiệtđ
ới ẩm nước ta, sản phẩm giày da quân nhu
bảo quản cấp phát thường hay bị mốc, làm giảm chất lượng sản phẩm Hiện giày da quân nhuđ
ược chống nấm mốc túi hút ẩm
silicagel Tuy nhiên, sau thời gian ngắnđ
ể khơng khí ẩm silicagel
bão hịa nước, làm tác dụng hút ẩm, nên nấm mốc tiếp tục phát triển Xuất phát từ thực tiễnđ
ó, nhóm tác giả lựa chọn giải pháp dùng chất chống nấm mốc cho giày da quân nhuTrong số chất có hoạt tính chống nấm mốc, α-brom cinnamaldehyde có tác dụng chống nấm mốc phổ rộng [1, 3, 4, 5, 6]
đ
ược tổng hợp từ cinnamaldehyde
với hiệu suất 68÷91% [6, 7] Trong nghiên cứu nhóm tác giả sử dụng tinh dầu quế Việt Namđ
ể làm nguyên liệu tổng hợp
α-brom cinnamaldehyde từ
đ
ó chế tạo sản phẩm chống nấm mốc cho giày da quân nhu2 V
Ậ
T LI
Ệ
U VÀ PH
ƯƠ
NG PHÁP NGHIÊN C
Ứ
U
Tinh dầu quế bán thị trường
đ
ược phân tích có hàm lượng
cinnamaldehyde 85%, chất mang silicagel 60, 0,04÷0,06 mm hãng ScharlauĐ
iểm nóng chảyđ
ược
đ
o máy Bansted Electrothermal 9100 (Anh), tốcđ
ộ gia
nhiệt 1oC/phút Hàm lượng chấtđ
ược
đ
o máy UV-VIS 8453 (AGILENT, Mỹ) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13Cđ
ược
đ
o máy ADVANCE Spectrometer (BRUCKER, Germany) tần số 500 MHz 125MHz, dung môi DMSO-d6, phổ IRđ
ược
đ
o máyFTIR Affinity-1S Các loại phổđ
ều
đ
ược
đ
o Trung tâm Các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam Giày da quân nhu nhiễm nấm mốc thu thập từ kho bảo quản thuộc Viện Nghiên cứu ứng dụng quân nhu Các chủng nấm mốcđ
ược phân lập thử
nghiệm Phân viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm Nhiệtđ
ới Việt - Nga
Đ
ịnh
danh dựa hình thái khuẩn lạc tế bào tiến hành Viện 69, Bộ Tư lệnh Lă
ng2.1 Chuy
ể
n hóa tinh d
ầ
u qu
ế
thành
α
-brom cinnamaldehyde
(2)Nghiên cứu khoa học công nghệ
Cân 61,1 g tinh dầu quế (tương ứng với 0,394 mol cinnamaldehyde) vào bình cầu ba cổ 500 ml, thêm 150 ml axit axetic b
ă
ngĐ
ặt bình cầu bếp từ có nồi cách
thủy có sinh hàn hồi lưu Bật máy khuấy từ, nhỏ từ từ 21 ml brom(0,395 mol) khoảng 15 phút, sauđ
ó khuấy hỗn hợp phản ứng thêm 10 phút (kết thúc phản ứng 1) Tiến hành gia nhiệt hỗn hợp lên 80oC, thêm 32,47 g natri axetat (0,4 mol), khuấy mạnh hỗn hợp phản ứng (kết thúc phản ứng 2) Sauđ
óđ
ổ hỗn hợp vào
500 gđ
á, lọc sản phẩm phễu lọc Buchner, rửa lần x 200 ml nước cất, kết tinh lại toàn sản phẩm 250 ml etanol 96%đ
ể tủ 4
oC khoảng 12 giờ, lọc sản phẩm rửa lần x 30 ml etanol 96% lạnh Làm khô sản phẩm 50oC thuđ
ược 68,2 g α-brom cinnamaldehyde, hiệu suất tính theo cinnamaldehyde
82%, Tnc = 71,2÷72,3oCĐ
ộ tinh khiết 99,1% theo phương pháp phân tích UV-VIS
2.2 Phân l
ậ
p m
ẫ
u giày da quân nhu b
ị
nhi
ễ
m n
ấ
m m
ố
c
Mẫu giày da quân nhu
đ
ược xác
đ
ịnh vùng bị nhiễm nấm, dùng t
ă
mđ
ã khử trùng quết lên bề mặt giày bên bên sauđ
ó cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lýđ
ã khử trùng Tiến hành pha loãngđ
ến nồng
đ
ộ
thích hợp Hút 0,1 ml dung dịch nồngđ
ộ pha loãng lựa chọn cho vào
đ
ĩa petri
chứa môi trường Czapekđ
ã khử trùng Dùng que trang dànđ
ều dịch bề mặt
thạch Ni cấy nhiệtđ
ộ 30
oC, thời gian 48÷72 Quan sát phát triển nấm mốc, chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy sangđ
ĩa thạch khác
đ
ể thu chủng nấm
khiết mangđ
ịnh danh
2.3 Xác
đ
ị
nh hàm l
ượ
ng
ứ
c ch
ế
t
ố
i thi
ể
u c
ủ
a
α
-brom cinnamaldehyde
đ
ố
i
v
ớ
i ch
ủ
ng n
ấ
m m
ố
c phân l
ậ
p
đ
ượ
c
Sử dụng chủng nấm mốc phân lập
đ
ược với chủng Aspergillus niger
đ
ược sử dụng
đ
ể nghiên cứu thu dịch bào tử Phun
đ
ều dịch chứa bào tử nấm mốc
đ
ã chuẩn bị lênđ
ĩa môi trường PDA, dùng que trang trải
đ
ều, chủng lặp lại lần
ở nồng
đ
ộ nghiên cứu Các
đ
ĩa thí nghiệm
đ
ược
đ
ặt vào hộp nhựa thể tích lít
(tươngđ
ương với thể tích hộp
đ
ựng giày da quân nhu) có treo giấy
đ
ã tẩm chấtức chế nấm mốc α-brom cinnamaldehyde với hàm lượng mg; mg; mg mg,
bổ sung nướcđ
ể ổn
đ
ịnh
đ
ộ ẩm
Đ
ặt nuôi
đ
iều kiện môi trường tiến hànhđ
ánh giá sau 28 ngày2.4 Ch
ế
t
ạ
o s
ả
n ph
ẩ
m ch
ố
ng n
ấ
m m
ố
c
đ
ánh giá hàm l
ượ
ng c
ủ
a
α
-brom cinnamaldehyde
theo th
ờ
i gian
2.4.1 Ch
ế
t
ạ
o s
ả
n ph
ẩ
m ch
ố
ng n
ấ
m m
ố
c ch
ấ
t mang silicagel
(3)Nghiên cứu khoa học công nghệ
2.4.2
Đ
ánh giá hàm l
ượ
ng
α
-brom cinnamaldehyde c
ủ
a s
ả
n ph
ẩ
m theo th
ờ
i gian
Các mẫu sản phẩm mục 2.4.1đ
ược
đ
ặt vào hộp giày da quân nhu thể
tích 5,3 lít,đ
ậy kín nắp hộp (
đ
úng với tình trạngđ
ựng giày)
Đ
ể phịng nhiệt
đ
ộ 28÷33
oCĐ
ịnh kỳ phân tích hàm lượng
α-brom cinnamaldehyde lại
mẫu sản phẩm theo thời gian phương pháp UV-VIS, từđ
ó rút quy luật tốcđ
ộ bay α-brom cinnamaldehyde
trong sản phẩm theo thời gian2.5 Th
ử
nghi
ệ
m gia t
ố
c
đ
ánh giá kh
ả
n
ă
ng
ứ
c ch
ế
n
ấ
m m
ố
c c
ủ
a s
ả
n ph
ẩ
m
trên giày da quân nhu
Chuẩn bị dịch bào tử tiến hành tương tự mục 2.3 Mẫu thí nghiệm khác với mẫu
đ
ối chứng
đ
ược
đ
ặt kèm túi mẫu sản phẩm chứa chất chống nấm mốc Các
mẫu giày sauđ
ược phun bào tử
đ
ược
đ
ặt vào hộp trì
đ
ộ ẩm khoảng 90%
đ
ặt vào thiết bị ổn nhiệt nhiệt
đ
ộ 30
oC Sau 7, 14 28 ngày quan sátđ
ánh giá phát triển nấm mốc bề mặt giày thí nghiệmđ
ối chứng
3 K
Ế
T QU
Ả
VÀ TH
Ả
O LU
Ậ
N
3.1 Chuy
ể
n hóa tinh d
ầ
u qu
ế
thành
α
-brom cinnamaldehyde
Trong quy trình (mục 2.1) α-brom cinnamaldehyde
đ
ược tổng hợp trực tiếp từ
tinh dầu quế Việt Nam, dung môi axit axetic, chất bazơ natri axetat Hiệu suất tổng hợp 82%,đ
ộ tinh khiết 99,1% theo phương pháp phân tích UV-VIS bước
sóng 298 nm, nhiệtđ
ộ nóng sản phẩm 71,2÷72,3
oC Theo [6] hiệu suất tổng hợp 69÷86%, nhiệtđ
ộ nóng chảy sản phẩm 70÷72
oC Theo [7] hiệu suất tổng hợp 91%, nhiệtđ
ộ nóng chảy sản phẩm 69÷71
oC Nhưđ
iểm chảy sản phẩm phù hợp vớiđ
iểm chảy α-brom cinnamaldehyde theo tài liệuđ
ã cơng bốCấu trúc hóa học sản phẩm tổng hợp
đ
ược xác nhận thông qua phổ:
Ph
ổ
IR (KBr),
ῡ
(cm
-1):
761(C-Br); 1570; 1487; 1446(C=C benzen); 1602(C=C anken); 1689(C=O, strong); 3053(CH=C).Ph
ổ
1H-NMR (DMSO-d
6, 500 MHz),
δ
H(ppm), J(Hz):
7,56(dd, 3H, J=2,5; 5); 8,03(dd, 2H, J=2; 6,25); 8,43(s, 1H);9,41(d, 1H, J=2,5)
Ph
ổ
13C-NMR (DMSO-d
6, 125 MHz),
δ
C(ppm):
123,9; 128,8;130,6; 131,5; 132,9; 150,4; 188,1 Như vậy, số liệu phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR sản phẩm phù hợp với cấu trúc
α-brom cinnamaldehyde
Đ
iều khẳngđ
ịnh α-brom cinnamaldehyde
đ
ãđ
ược tổng hợp từ tinh dầu quế
(4)Nghiên cứu khoa học công nghệ
3.2 Phân l
ậ
p n
ấ
m m
ố
c giày da quân nhu
Từ mẫu giày nhiễm nấm mốc, phân lập khiết
đ
ược chủng nấm
mốc vớiđ
ặc
đ
iểm màu sắc hình dạng khuẩn lạc khác Bằng phương pháp phân loại dựa hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc cấu trúc cuống sinh bào tử, chủng nấm mốc phân lậpđ
ãđ
ược
đ
ịnh tên (bảng 1)
B
ả
ng 1.
Thành phần loài chủng nấm mốc phân lậpđ
ược giày da quân nhu
TT
Tên lồi
Mơ t
ả
1
Aspergillus sulphureus
Khuẩn lạc mơi trường Czapek có màu trắngđ
ến kem
đ
ến màu vàng nhạt có
sinh nhiều hạch nấm tạo thành lớp dày vùng trung tâm khuẩn lạc Cuống sinh bào tử thường dài có kích thước 500÷600 x6.0÷8.0μm, thành dàyđ
ến 1.0 μm, nhẵn
đ
ến ráp.
2
Aspergillus candidus
Khuẩn lạc mơi trường mỏng, hệ sợi chìm, cấu trúc sinh bào tử sinh trực tiếp từ hệ sợi từ sợi khí sinh, màu trắng kem; cuống sinh bào tử kích thước thayđ
ổi không màu, nhẵn.
Aspergillus sydowi
Khuẩn lạc môi trường Czapek mọc nhanh Bề mặt dạng nhung, mịn xốp nhẹ
đ
ược sinh từ
đ
ám cuốngđ
ầu sinh bào tử trần, có màu lục lơ
đ
ến xanh
đ
ậm Giọt tiết thường nhiều, màu vàng rơm
đ
ến nâu
đ
ỏ.
Paecilomyces variotii
Khuẩn lạc bao gồm cuống sinh bào tử tạo thành lớp dày dạng phấn bề mặt khuẩn lạc, có màu nâu vàngđ
ến màu cát
Cuống sinh bào tử gồm nhiều lớp tạo thành nhánh, nhánh mang 2÷7 thể bìnhAspergillus versicolor
Khuẩn lạc môi trường Czapek phát triển chậm màu trắng xámđ
ến lục xám nhạt; hệ
sợi nấm màu trắng; mặt trái màu vàng nhạtđ
ến màu nâu kem; cuống sinh bào tử có kích
thước 100÷700 x 4.0÷8.5μm, màu nâu nhạt, thành nhẵn6
Aspergillus asperescens
Khuẩn lạc môi trường Czapek màu lục vàng xámđ
ến oliu xám; hệ sợi nấm màu
trắng, nâu nhạtđ
ến màu da; mặt trái màu
vàng nhạtđ
ến
đ
ỏ san hơ; cuống sinh bào tử
có kích thước 80÷700 x 4.0÷9.5μm, màu nâu vàng nhạt, thành dày, nhẵn (5)Nghiên cứu khoa học công nghệ
3.3 Hàm l
ượ
ng
ứ
c ch
ế
t
ố
i thi
ể
u c
ủ
a
α
-brom cinnamicaldehyde v
ớ
i
ch
ủ
ng n
ấ
m m
ố
c phân l
ậ
p
đ
ượ
c
Sau 28 ngày thử nghiệm theo mục 2.3 thu
đ
ược kết thử nghiệm bảng
B
ả
ng 2.
Hàm lượng ức chế tối thiểu α-brom cinnamaldehyde với số chủng nấm nấm mốc phân lậpđ
ược giày sau 28 ngày
Tên ch
ủ
ng
Hàm l
thi
ượ
ể
u (mg/5l)
ng
ứ
c ch
ế
t
ố
i
Hình
ả
nh thí nghi
ệ
m
Aspergillus
candidus
Aspergillus
sydowi
Aspergillus
sulphureus
Aspergillus
asperescens
Aspergillus
versicolor
Paecilomyces
variotii
Aspergillus
niger
(6)Nghiên cứu khoa học công nghệ
Kết bảng cho thấy hàm lượng ức chế tối thiểu
đ
ối với chủng
nấm mốc khác khác nhau, có chủng với hàm lượng α-bromcinnamaldehyde 1mgđ
ã có tác dụng ức chế hoàn toàn phát triển nấm mốc mơi trường thạch (Aspergillus candidus, Aspergillus sydowi), song có chủng với hàm lượng chất chống nấm mốc lênđ
ến mg cịn có
tượng nấm mốc phát triển mạnhđ
ĩa thạch (Paecilomyces variotii, Aspergillus
niger) Từ kết lựa chọn hàm lượngức chế tối thiểu chung cho tập hợp
chủng nấm mốc dùng cho thử nghiệm mg3.4 Hàm l
ượ
ng
α
-brom cinnamaldehyde s
ả
n ph
ẩ
m theo th
ờ
i gian
Kết hàm lượng
α-brom cinnamaldehyde lại sản phẩm theo
thời gian thử nghiệm theo mục 2.4.2đ
ược thể bảng
B
ả
ng
Hàm lượng α-brom cinnamaldehyde sản phẩm theo thời gianSTT
Th
ờ
i gian th
ử
nghi
ệ
m
(tháng)
Hàm l
ượ
ng
α
-brom cinnamaldehyde
(mg)
1 200 150 100
2 190 139 92
3 181 126 81
4 170 115 73
5 158 110 66
Dựa vào kết bảng kết thử nghiệm từ mục 3.3 ngoại suy cách gần
đ
úng thời gian chống nấm mốc sản phẩm với giày da quân nhu theo bảngB
ả
ng 4.
Thời gian chống nấm nấm mốc sản phẩmSTT
S
ả
n ph
ẩ
m t
ươ
ng
ứ
ng v
ớ
i
α
-brom cinnamaldehyde (mg)
Th
ờ
i gian ch
ố
ng n
ấ
m m
ố
c
(tháng)
1 200 18,8
2 150 13,8
3 100 10,9
(7)Nghiên cứu khoa học công nghệ
3.5 K
ế
t qu
ả
th
ử
nghi
ệ
m gia t
ố
c
đ
ánh giá kh
ả
n
ă
ng
ứ
c ch
ế
n
ấ
m m
ố
c
giày da quân nhu c
ủ
a s
ả
n ph
ẩ
m
Kết cho thấy trình thử nghiệm theo mục 2.5, chủng nấm mốc
đ
ều khơng sinh trưởng
đ
iều kiện có α-brom cinnamaldehydeCác kết thử nghiệm giày da quân nhu
đ
iều kiện gia tốc cho thấy sau ngàyđ
ặt thí nghiệm chưa thấy xuất nấm mốc mẫu
đ
ối
chứng mẫu thí nghiệm Nhưng sau 14 ngày, mẫuđ
ối chứng
đ
ã thấy rõ phát triển hệ sợi nấm mốc lácđ
ác bề mặt giày sau 28 ngày nấm mốc phát triển mạnh toàn bề mặt giày,đ
ặc biệt
đ
ường may,
đ
ó mẫu thí nghiệm chưa thấy xuất nấm mốcĐ
iều cho thấy hiệuức chế mạnh hợp chất
α-brom cinnamaldehyde tới phát triển nấm mốc
giày da quân nhu4 K
Ế
T LU
Ậ
N
-
Đ
ã tổng hợpđ
ược
α-brom cinnamaldehyde từ tinh dầu quế với hiệu suất
khoảng 82%,đ
ộ tinh khiết
đ
ạt 99,1% Cấu trúc
đ
ược xác nhận
phương pháp phổ IR, NMR- Phân lập
đ
ịnh tên
đ
ược chủng nấm mốc từ mẫu giày da quân nhu
nhiễm nấm mốc: Aspergillus sulphureus, Aspergillus candidus, Aspergillus sydowi, Paecilomyces variotii, Aspergillus versicolor, Aspergillus asperescens- Chế tạo sản phẩm chống nấm mốc chất mang silicagel dạng túi bột có khối lượng 1g, hàm lượng
α-brom cinnamaldehyde sản phẩm 200 mg
Kết thử nghiệm gia tốc sản phẩm cho thấy hiệu ức chế mạnh hợp chấtα-brom cinnamaldehyde tới phát triển nấm mốc mẫu giày da quân nhu
TÀI LI
Ệ
U THAM KH
Ả
O
1 Bùi Xuân
Đ
ồng, Hà Huy Kế,
Nấm nấm mốc phương pháp phòng chống, Nxb Khoa học Kỹ thuật, 19992 Ngô V
ă
n Thu, Bài giảng dược liệu, tậ
p 1, Trườ
ngĐ
ạ
i họ
c Dượ
c Hà Nộ
i, 20113 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn
Đ
ình Tiến, Phạm Vă
n Ty, Vi sinh vật học, Nxb Giaos dục, 20004 Trần Danh
Đ
áng, Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chống nấm nấm mốc áp dụng sản xuất lưu thông loại giày vải, giày da xuất khẩu, Báo cáođ
ề tài KC.06.16.CN, Công ty Da giày Hà Nội, 2005
5 Rosmoore H W., Handbook of biocide and preservative use, Springer, Sience and Business media, 1995