thu nhận và tinh chế enzyme

LOGO 11/24/13 I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ III. TINH SẠCH ENZYME IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYEM V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME VII. TỔNG KẾT 2  Trước thế kỷ XVII, người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế.  Nữa đầu thế kỷ XIX, các nhà khoa học thấy được vai trò qua trọng của enzyme trong chuyển hoá các chất của quá trình lên men.  Đến nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển trên qui mô công nghiệp. hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD.  Chế phẩm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất. Do vậy, quá trình thu nhận và tinh sạch protein/enzyme giữ vai trò cực kỳ quan trọng và không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất để phụ vụ cho con người. 3 I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 1. Định nghĩa • Enzyme (E) là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. E có tất cả trong tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. (CNSH Enzyme và Ứng Dụng - Phạm Thị Trân Châu,Phan Tuấn Nghiã) • Có trên 4000 phản ứng sinh hoá được xúc tác bởi enzym • Enzym = Apoenzym + Coenzym  Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác của E, quyết định tính đặc hiệu.  Coenzym: Phần không phải protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp 4 2. Tính chất của enzyme 1. Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số E có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn. 2. Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong ete và các dung môi không phân cực. 3. Không bền dưới tác dụng của nhiệt, nhiệt độ cao E bị biến tính. Môi trường axít hay bazơ cũng làm E mất khả năng hoạt động. 4. Enzym có tính lưỡng tính: Tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay trung hòa điện. 5. Enzym chia làm hai nhóm: E một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase . và các E hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein) I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 5 Các bước chính trong quá trình thu nhận và tinh chế enzyme 6 • Tủa • Thẩm tách • Sắc ký • Chất hấp phụ II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế E  Nhiệt độ thấp từ 0 o C 5 o C. E không bền nhiệt -5 o C -20 o C Bảng 1: Hỗn hợp làm lạnh Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được Nước đá : muối 100:33 (3:1) -21,3 o C Nước đá : H 2 SO 4 đậm đặc 100:25 (4:1) -20,0 o C 7  pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7+ 2)  Các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh đều dễ gây biến tính E  Bổ sung các yếu tố làm bền (như CaCl 2 hay MgCl 2 với nồng độ 2-5mM, glycerol 10-20% .), chất chống oxy hoá (β-mercaptoethanol hay dithiothreitol 1-5mM…)  Chất ức chế của E proteolytic Gồm 4 lớp tương ứng với proteolytic chúng ức chế 1. Protease serin 2. Protease cystein 3. Protease acid 4. Protease chứa kim loại 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế E 8 Bảng 2: Một số chất ức chế E proteolytic thường dùng trong tách chiết, tinh sạch protein/E Chất ức chế Nồng độ và thời gian hiệu quả Dung môi pha dung dịch gốc và nồng độ chất ức chế Điều kiện và thời gian bảo quản ở dạng dung dịch gốc E proteolytic bị ức chế Phenyle methyl sulphonyl fluoride (PMSF) 0,1-1mM vài giờ 100mM trong ethanol hoặc isopropanol 2-3 tháng ở nhiệt độ phòng Protease serine Leupeptin 10-100μM 10mM trong H 2 O 1 tuần ở 4 o C hoặc 1 tháng ở -20 o C Protease kiểu trypsin và một số kiểu protease cystein Iodoacetic acid hay iodoacetate (IAA) 10-100μM vài giờ 100mM trong H 2 O Chỉ chuẩn bị trước khi dùng Protease cystein Pepstain A 1μM vài giờ 1mM trong tanol 3-4 tháng ở -20 o C Một số protease acid Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) 1-2mM, lâu dài 500mM pH 8,0 6-12 tháng ở nhiệt độ phòng Protease chứa kim loại (trừ loại chứa Ca 2+ thì phải dùng EGTA) 9 2. Thu nhận enzyme a . Chọn nguồn nguyên liệu Có 3 nguồn nguyên liệu sinh học:  Động vật: Tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim…dùng để tách E rất thuận lợi. Ví dụ: Renin tách từ dạ dày bê nghé làm đông sữa trong sản xuất fomat.  Thực vật: Thông thường E có mặt nhiều ở cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều E chuyển hoá chất ấy. Ví dụ: hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu nành có nhiều E urease, papain thu từ nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ các bộ phận cây dứa, fixin tách từ dịch ép của thân và lá cây Ficus… II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ 10 . I. GIỚI THI U CHUNG VỀ ENZYME II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ III. TINH SẠCH ENZYME IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYEM V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME VI protein) I. GIỚI THI U CHUNG VỀ ENZYME 5 Các bước chính trong quá trình thu nhận và tinh chế enzyme 6 • Tủa • Thẩm tách • Sắc ký • Chất hấp phụ II. THU NHẬN