Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận và tinh chế Isoflavone từ đậu nành và bã đậu nành

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT oOo BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ TINH CHẾ ISOFLAVONE TỪ ĐẬU NÀNH VÀ BÃ ĐẬU NÀNH Mã số: B2017-ĐN06-07 Chủ nhiệm đề tài: ThS Trần Thị Ngọc Thư Đà Nẵng, 8/ 2019 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP Thành viên tham gia nghiên cứu đề tài Họ tên PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh TT TS Vững Bùi Xuân ThS Lê Thị Tuyết Anh Đơn vị công tác lĩnh vực chuyên môn - Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Hóa-Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng Chun ngành Cơng nghệ Thực phẩm - Bộ mơn Hóa phân tích, Khoa Hóa-Trường ĐH Sư phạm Đà Nẵng Chun ngành Hóa phân tích - Bộ mơn Hóa phân tích, Khoa Hóa-Trường ĐH Sư phạm Đà Nẵng Chun ngành Cơng nghệ Thực phẩm Đơn vị phối hợp TT Tên đơn vị nước Nội dung phối hợp nghiên cứu Họ tên người đại diện Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm –Đại học Bách Khoa Hà Nội Hỗ trợ kỹ thuật xây dựng mơ hình thực nghiệm chiết tách isoflavone PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Đậu nành Vinasoy Hỗ trợ kỹ thuật phân tích hàm lượng isoflavone HPLC Huỳnh Sơn Hải II MỤC LỤC MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT V THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VI INFORMATION ON RESEARCH RESULTS VII MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết vấn đề nghiên cứu Những đóng góp khoa học đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Phạm vi nghiên cứu 3 Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu 3.1 Cách tiếp cận 3.2 Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Đặc điểm cấu trúc tính chất isoflavone 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc 1.1.2 Đặc tính hóa học isoflavones 1.2 Tác dụng sinh học isoflavone 1.3 Tổng quan hạt nhựa D101macroporous 1.4 Tổng quan nghiên cứu thu nhận isoflavones 1.4.1 Tình hình nghiên cứu isoflavone giới 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 III 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Hóa chất 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp khảo sát 2.2.3 Phương pháp phân tích 10 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu: 10 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11 3.1 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ hạt đậu nành bã đậu nành phương pháp chiết khuấy 11 3.1.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết trình chiết khuấy 11 3.1.2 Khảo sát thực nghiệm đa yếu tố điều kiện chiết quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 13 3.1.3 Tối ưu hóa quy trình chiết thí nghiệm leo dốc theo mơ hình Box-Wilson 13 3.1.4 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết khuấy 13 3.2 So sánh hiệu chiết phương pháp chiết khuấy thông thường chiết hỗ trợ siêu âm 14 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian mức lượng siêu âm đến hàm lượng isoflavone thu nhận 14 3.2.2 So sánh ảnh hưởng chiết siêu âm chiết khuấy thông thường đến hiệu chiết isoflavone hạt đậu nành 14 3.3 Khảo sát điều kiện tinh isoflavone phương pháp trích ly lỏng-rắn 15 3.4 Khảo sát điều kiện tinh dịch chiết isoflavone từ đậu nành bã đậu nành hạt nhựa macroporous D101 15 3.4.1 Đánh giá khả hấp phụ hạt nhựa D101 theo mơ hình hấp phụ Langmuir 15 3.4.2 Khảo sát khả giải hấp ethanol 15 ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 IV 3.4.3 Khảo sát động học trình hấp phụ isoflavones lên hạt nhựa D101 15 3.4.4 Đánh giá chất lượng cao tinh chế từ hạt đậu nành bã đậu nành nhựa D101 16 3.5 Khảo sát điều kiện thủy phân dịch chiết isoflavone từ đậu nành chế phẩm enzyme celluclast 1,5L 16 3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồ ng đô ̣ enzyme celluclast 1,5L đế n quá triǹ h thủy phân isoflavone glycoside 16 3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đế n quá triǹ h thủy phân nâng cao hàm lươ ̣ng isoflavone aglycone 16 3.6 Đề xuất quy trình trích ly tinh chế isoflavone từ đậu nành bã đậu nành 16 1.Kết luận 18 Kiến nghị 18 ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 V MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt tiếng Việt NLSA : Năng lượng siêu âm VSV: Vi sinh vật Chữ viết tắt tiếng Anh HPLC: High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) DMSO: Dimethyl sulfoxit (CH3)2SO PTFE: Polytetrafloetylen (nhựa teflon) AOAC: Association of Official Analytical Chemists có nghĩa Hiệp hội nhà hố phân tích thống EtOH: Ethanol Thể tích cột BV: MeOH: Methanol Standard (dung dịch chuẩn) STD: Standard deviation (độ lệch chuẩn) SD: Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương đối) RSD: Limit of Detector (Giới hạn phát hiện) LOD: Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng) LOQ: ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 VI ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung - Tên đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận tinh chế isoflavone từ đậu nành bã đậu nành - Mã số: B2017-DN06-07 - Chủ nhiệm đề tài: ThS Trần Thị Ngọc Thư - Tổ chức chủ trì: Đại học Đà Nẵng - Thời gian thực hiện: từ 12/2017 đến 05 /2019 Mục tiêu - Xác định điều kiện trích ly isoflavone thu nhận đậu nành bã đậu nành địa bàn miền Trung – Tây nguyên theo dạng isoflavone có giá trị daidzein, glycitein genistein thuộc nhóm aglycone, daidzin, glycitin genistin thuộc nhóm -glycoside từ phương pháp điều kiện nhiệt độ, thời gian, nồng độ dung môi trích ly - Tinh isoflavone lựa chọn điều kiện thủy phân -glycoside Xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận tinh isoflavone Tính sáng tạo - Xây dựng quy trình trích ly isoflavone từ đậu nành bã đậu nành địa phương phương pháp chiết khuấy sử dụng dung môi ethanol, dung môi thu hồi tái sử dụng phương pháp cô quay chân không - Tinh hạt nhựa macroporous D101 Sử dụng enzyme celluclast 1,5L-một loại endoglucanase để thủy phân -glycoside và, gia tăng hàm lượng isoflavone cao tinh chế Kết nghiên cứu - Tối ưu hóa quy trình trích ly isoflavone từ đậu nành bã đậu nành địa phương phương pháp chiết khuấy - Khảo sát điều kiện sử dụng enzyme endoglucanase để thủy phân -glycoside, làm giàu cấu tử aglycone - Tinh dịch trích ly isoflavone từ nguyên liệu hạt nhựa macroporous D101, gia tăng hàm lượng isoflavone cao tinh chế ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 VII ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 VIII INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information - Project title: Study on extraction and purification isoflavone from soybean seed (Glycine Max L Merr) and residure soybean (okara) - Code number: B2017-DN06-07 - Coordinator: Tran Thi Ngoc Thu - Implementing institution: The University of Danang - Duration: from 12/2017 to 05/2019 Objective - Studying on the conditions of isoflavone extraction from soybean seed and soybean residues (okara) in the Central region with isoflavone compounds (daidzein, glycitein and genistein of aglycone, daidzin, glycitin and genistin of glycosides) - Purification isoflavone using macroporous resin D101 and hydrolysis isoflavone glycosides with enzyme in order to increase the antioxidant activity, - Develop a processing of extraction and purification of isoflavones in a large scale Creativeness and innovativeness - Develop a processing of extraction and purification of isoflavones in a large scale - Purification isoflavone using macroporous resin D101 and hydrolysis isoflavone glycosides with enzyme endoglucane in order to increase the antioxidant activity of isoflavone Research results - Optimization of isoflavones extraction from soybeans and okara using full factorial design - Purification isoflavone extracts from soybean and okara using macroporous D101 - Hydrolysis isoflavone glycosides with enzyme endoglucane Products 5.1 Scientific publications There are 02 published papers: - International journal: 01 ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 theo kết đo hàm lượng isoflavone theo hợp chất isoflavone nêu Tối ưu hóa q trình chiết isoflavone từ đậu nành bã đậu nành - Khảo sát phương pháp thủy phân isoflavone từ dịch chiết: lựa chọn điều kiện nhiệt độ, thời gian, nồng độ acid HCl để thủy phân dịch chiết isoflavone - Khảo sát phương pháp tinh isoflavone từ dịch chiết: khảo sát phuong pháp tinh chế, điều kiện tinh chế dịch thủy phân isoflavone - Các phương pháp phân tích: - Phân tích thành phần hóa học nguyên liệu tinh bột, đường, xơ thô, tro, đường, protein - Phân tích hàm lượng isoflavone tổng số có dịch chiết phương pháp HPLC thơng qua dạng isoflavone - Đánh giá chất lượng isoflavone tinh chế: Khảo sát tính an tồn thực phẩm (hàm lượng kim loại nặng, độc tính cấp diễn theo Litchfield – Wilcoxon, Tổng số VSVHK…); Khảo sát hoạt tính sinh học isoflavone tinh chế: Xác định hoạt tính chống oxy hóa loại bỏ gốc tự do, xác định hoạt tính nội tiết kiểu oestrogen) - Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm thực lần, kết trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Các số liệu xử lý phương pháp phân tích phương sai ANOVA, so sánh khác có nghĩa mức P0,05 Tính tốn phương sai ANOVA mơ hình quy hoạch thực nghiệm phần mềm Minitab 18 ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 CHƯƠNG TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Đặc điểm cấu trúc tính chất isoflavone 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc Xét theo cấu trúc, isoflavones có cấu trúc gồm vòng benzen (A B) nối với cầu ba carbon tạo thành dị vòng pyran(C), thuộc phân nhánh nhóm flavonoid Trong cấu trúc isoflavone, vòng benzen B nối vị trí thứ thay vị trí số dị vòng C flavonoid khác [1][2][3].Trong đậu nành sản phẩm từ đậu nành, isoflavone có 12 dạng chia làm nhóm : aglycone, glycoside dạng este glycoside malonyl acetyl glycoside Do ưu điểm có hàm lượng isoflavones cao, thành phần hợp chất isoflavones dược tính chúng quan tâm nghiên cứu suốt nhiều thập kỷ qua, thân nguồn nguyên liệu an tồn, sẵn có isoflavone đậu nành lựa chọn số người tiêu dùng [4] 1.1.2 Đặc tính hóa học isoflavones Độ hấp thụ xạ vùng tử ngoại: Do chúng có vòng phenol nên có khả hấp thụ ánh sáng tử ngoại Độ phân cực: Glycoside isoflavones phân cực có nhiều gốc -OH dạng aglycones phân cực yếu Điều ảnh hưởng đến khả hòa tan chúng số dung mơi Độ hòa tan dung mơi: Theo Jie-Ping Fan cộng cho thấy khả hòa tan của daidzin genistin dung môi, cụ thể độ tan genistin giảm dần từ acetone> tetrahydrofuran> methanol> ethanol> isopropanol> n-butyl alcohol> acetonitrile Ethyl acetate> cyclohexane n-hexane> chloroform Tính ổn định isoflavone: Isoflavone nhạy cảm với chiếu xạ (tia cực tím UV) Sự thối hóa isoflavone phát cách giảm độ hấp thụ mức hấp thụ tối đa (khoảng 250 nm) thay đổi phát xạ huỳnh quang Các dạng liên hợp malonyl bền nhiệt, dễ thủy phân thành acetyl môi trường kiềm[6][7][8][9] 1.2 Tác dụng sinh học isoflavone Hoạt tính nội tiết tố: Isoflavone lại có cấu trúc tương tự 17 βoestradiol-một estrogen mạnh động vật có xương sống, liên kết với ER Với đặc tính cấu trúc chuyển hóa isoflavone thể, cho tác dụng tích cực làm giảm triệu chứng ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 tiền mãn kinh làm giảm tần suất nóng bừng, ngăn ngừa loãng xương giảm nguy ung thư Hoạt tính chống oxi hóa: Các hợp chất isoflavone có khả chống oxi hóa thơng qua kỹ thuật kiểm tra bắt gốc tự 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), đánh giá lực chống oxi hóa thơng qua khả biến dạng Fe3+-TPTZ thành dạng Fe2+ (phương pháp FRAP) [10], [11] 1.3 Tổng quan hạt nhựa D101macroporous Nhựa D101 macroporous thuộc nhựa hấp phụ macroporous khơng có đính ion từ trình trùng hợp polyme sử dụng styrene có bổ sung divinylbenzen, có dạng hình cầu, có cấu trúc xốp với lỗ lớn bề mặt, có cấu trúc mạng diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Nhựa D101 macroporous ứng dụng rộng rãi lĩnh vực chiết xuất, phân lập tinh chế hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên flavonoid, glycosid, saponin, carotenoid… [12][13][14] ưu điểm tăng đáng kể nồng độ thành phần hoạt chất, không cần sử dụng đến dung môi hữu độc hại; tái sử dụng, chi phí thấp, phù hợp cho sản xuất công nghiệp [15] 1.4 Tổng quan nghiên cứu thu nhận isoflavones 1.4.1 Tình hình nghiên cứu isoflavone giới Hiện nhà sản xuất sử dụng nguồn nguyên liệu đậu nành,một số từ cỏ ba đỏ, cỏ linh lăng, củ sắn dây hướng đến nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ nhà máy chế biến sản phẩm đậu nành, tinh bột sắn dây chứa isoflavone Để lựa chọn điều kiện chiết xuất tinh isoflavone phù hợp, số phương pháp giới áp dụng khảo sát phòng thí nghiệm Elizabeth JZ cộng [16] trích ly tinh isoflavone từ bột đậu nành sử dụng phương pháp khuấy nhiệt độ 80oC-8h, tỉ lệ dung mơi/ngun liệu=3/1 để trích ly isoflavon Q trình thủy phân nhiệt độ 80oC-6h, sử dụng HCl đạt hiệu suất cao thực tinh phương pháp kết tinh aglycone, có khả thu hồi đến 83%genistein 65% daidzein Seung Yong Cho cộng [17] trích ly isoflavone từ mầm đậu nành với nhiệt độ trích ly 85oC, thời gian 95 phút, tỉ lệ dung mơi etanol/ngun liệu=10/1 Q trình thủy phân thực điều kiện nhiệt độ 95oC-60 phút HCl, thực chiết lỏnglỏng diethyl ether để tách aglycone, sấy khô thu hàm lượng isoflavone dịch chiết từ 2,2mg/g dịch chiết ban đầu lên 220mg/g ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 dịch chiết sau tinh chế Nhựa D101 báo cáo dùng để tinh isoflavone từ Semen sojae praeparatum- sản phẩm lên men truyền thống Trung Quốc từ hạt đậu nành trước đưa qua kỹ thuật phân lập HPLC điều chế [18] Phương pháp sử dụng nhựa hấp phụ Qing-Feng Zhang cộng [19]sử dụng chiết isoflavone từ củ sắn dây Các phương pháp trích ly đại sử dụng chiết tách isoflavone : Kỹ thuật trích ly sóng siêu âm (UAE), Kỹ thuật trích ly vi sóng, Kỹ thuật chiết lỏng cao áp (PLE), Kỹ thuật trích ly siêu tới hạn (SFE) nhằm nâng cao hiệu suất khai thác isoflavone 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước Theo Đỗ Thị Hoa Viên sử dụng hạt đậu nành nảy mầm tách béo để chiết isoflavone nhiệt độ 40oC- 90 phút ethanol 60%, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu=10/1 pH 10, cho hàm lượng isoflavone tổng 3827,16mg/100g nguyên liệu, tăng hàm lượng isoflavone cao lên 3,8% Lê Hùng Dũng, Lê Thị Hồng Hảo (2007) có báo cáo kết nghiên cứu kết phân tích hàm lượng daidzein genistein đậu nành sữa đậu nành phương pháp HPLC [25] Nguyễn Mạnh Thắng, Nguyễn Công Khẩn (2012) nghiên cứu nâng cao hoạt tính sinh học isoflavone đậu nành nảy mầm, cách chuyển hóa glycoside sang dạng aglycone suốt thời gian nảy mầm, cao 36h [26] Trương Hương Lan cộng (2012) nghiên cứu nhận thấy chuyển hóa dạng glycoside sang dạng aglycone nhờ hoạt tính enzyme -glucosidase nội bào đậu nành, gia tăng hàm lượng aglycone từ 6,1 mg/100g lên 15,4mg/100g [27] Lê Bảo Nguyên, Lê Văn Tố (2012) xây dựng quy trình định lượng hợp chất daidzin củ sắn dây (Pueraria montana) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao-HPLC Kết sở để xây dựng quy trình vừa thu nhận daidzin vừa thu nhận tinh bột sắn dây [28] Xu hướng ngành cơng nghiệp chiết xuất isoflavones nói riêng hợp chất thiên nhiên nói chung tuân theo kỹ thuật chiết xuất “xanh” nên định hướng thực đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách, tinh isoflavone từ thực vật phụ phẩm đậu nành đảm bảo điều kiện ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu Hạt đậu nành: Hạt đậu nành thu hoạch nhà vườn khu vực huyện Đại Lộc-Quảng Nam, làm để loại bỏ hạt hỏng, tạp chất ngoại lai, sấy khô nhiệt độ 60oC, xay mịn (độ ẩm đạt 9,042±0,036%), bảo quản hộp kín nhiệt độ -20±2oC Bã đậu nành: Bã đậu nành thu nhận trực tiếp sở chế biến đậu phụ, sữa đậu nành địa bàn thành phố Đà Nẵng, trộn (đạt độ ẩm 85,743±1,704%) sấy khô nhiệt độ 60 oC (đạt độ ẩm 4,146±0,010%), xay mịn, bảo quản hộp kín nhiệt độ 20±2oC 2.1.2 Hóa chất Hóa chất chiết: sử dụng số loại dung môi ethanol tuyệt đối, aceton, methanol, dichloroform cổ phần Bột giặt Hóa chất Đức Giang Lào Cai (Việt Nam), NaOH khan, HCl đậm đặc (Trung Quốc).Thuốc thử: hóa chất xác định hoạt tính sinh học 2,2′-diphenyl1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma, USA) Hóa chất phân tích HPLC: Các chất chuẩn genistin, glycitin, daidzin, genistein, glycitein, daidzein (HPLC, USP), dung môi acetonitrile nước đề ion theo chuẩn HPLC Hạt nhựa Macroporous D101 : Hạt nhựa Macroporous D101 hãng Donghong Chemical Co.,Ltd, Trung Quốc, xử lý hạt nhựa trước thực nghiên cứu Chế phẩm enzyme: Chế phẩ m enzyme thương ma ̣i Celluclast 1,5L của hañ g Novozymes có hoạt độ >_ 700 ( EGU/G) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp khảo sát 2.2.1.1 Khảo sát q trình trích ly isoflavone (1) Khảo sát q trình trích ly isoflavone phương pháp chiết khuấy (a) Khảo sát q trình trích ly isoflavone từ hạt đậu nành phương pháp chiết khuấy Trong phầ n nghiên cứu thực khảo sát ảnh hưởng ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 yếu tố đến q trình trích ly sau:  Phương pháp khảo sát ảnh hưởng đơn biến Thực khảo sát ảnh hưởng đơn biến tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, pH, nhiệt độ, nồng độ dung mơi thời gian trích ly đến hiệu suất thu nhận isoflavone từ hạt đậu nành  Phương pháp khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố Chọn phương án quy hoạch trực giao cấp TYT 23 thiết kế ma trận thí nghiệm, dùng phương pháp QHTN tính tốn phương trình hồi qui theo dạng [29][30]: Ỹ=bo+b1x1+b2x2+b3x3+b12x1x2+b23x2x3+b13x1x3+b123x1x2x3 (1) Tiến hành tính tốn lựa chọn giá trị bj cho phương trình tuyến tính tương thích với thực nghiệm  Phương pháp leo dốc Box-Wilson để tìm điều kiện tối ưu (b)Phương pháp khảo sát q trình trích ly isoflavone từ bã đậu nành phương pháp chiết khuấy Khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung mơi/ngun liệu đến hiệu trích ly isoflavone từ bã đậu nành mục (1) (2) Phương pháp khảo sát ảnh hưởng đồng thời thời gian mức lượng siêu âm đến đến hiệu suất thu nhận isoflavone glycoside từ hạt đậu nành Khảo sát ảnh hưởng thời gian mức lượng siêu âm (NLSA) đến hàm lượng aglycone, glycoside isoflavone tổng số thu nhận (3) Phương pháp đánh giá ảnh hưởng chiết siêu âm chiết khuấy thông thường đến hiệu chiết isoflavone hạt đậu nành So sánh hiệu chiết isoflavone phương pháp siêu âm so với phương pháp chiết khuấy thông thường, phương pháp siêu âm-chiết khuấy kết hợp thông qua đánh giá hàm lượng isoflavone, hiệu quét gốc tự DPPH ảnh chụp SEM mẫu nguyên liệu sau chiết 2.2.2.2 Khảo sát trình tinh thủy phân dịch trích isoflavone (1) Khảo sát q trình tinh cao isoflavone thơ phương pháp trích ly rắn lỏng (2) Khảo sát q trình tinh dịch trích isoflavone nhựa macroporous D101 (a) Phương pháp xác định khả hấp phụ giải hấp phụ hợp chất isoflavone nhựa macroporous D101 theo điều kiện hấp ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 10 phụ tĩnh - Khảo sát khả hấp phụ theo điều kiện hấp phụ tĩnh theo mơ hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir - Khảo sát hiệu suất giải hấp hạt nhựa D101 sử dụng ethanol (b) Phương pháp khảo sát trình hấp phụ giải hấp isoflavone nhựa D101 mơ hình cột động (c) Xác định khả làm giàu isoflavone cột động (3) Khảo sát bước đầu khả thủy phân dịch trích isoflavone từ hạt đậu nành enzyme celluclast 1,5L - Khảo sát hàm lượng enzyme sử dụng thời gian thủy phân dịch trích isoflavone từ hạt đậu nành enzyme celluclast 1,5L 2.2.3 Phương pháp phân tích Phương pháp xác định hàm lượng isoflavone mẫu kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu cao HPLC : Sử dụng máy HPLC (Aligent 1200, USA) có gắn detector DAD; cột C18 pha đảo (Lichrospher100, 4.6mm x 250nm x 5µm); phận tiêm mẫu tự động, bước sóng 260 nm Hàm lượng Xi(g/g) hợp chất isoflavone khối lượng chất khô mẫu nguyên liệu ban đầu Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa thơng qua phản ứng bao vây gốc tự (DPPH) Phương pháp chụp ảnh vi cấu trúc bề mặt kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope-SEM) Phương pháp phân tích tiêu hóa lý: Độ ẩm hạt đậu nành xác định phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5613-1991; Hàm lượng protein thô theo Kjeldahl;Hàm lượng lipid thô theo phương pháp Shoxlet; Hàm lượng xơ thô phương pháp thủy phân axit kiềm mạnh; Hàm lượng tro phương pháp nung; Hàm lượng tinh bột phương pháp thủy phân axit, xác định đường khử phương pháp DNS 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm thực lần, kết trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, xử lý phương pháp phân tích phương sai ANOVA, so sánh khác có nghĩa mức P0,05 thể chữ số a,b,c,d,e đầu cột, cột có giống chữ thể khơng có khác có nghĩa mức 0.05 Sử dụng phần mềm Minitab 18 để xử lý số liệu phân tích ANOVA chiều ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 11 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa điều kiện chiết isoflavone từ hạt đậu nành bã đậu nành phương pháp chiết khuấy 3.1.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết trình chiết khuấy 3.1.1.1 Ảnh hưởng pH môi trường chiết Bảng Hàm lượng isoflavone thành phần mẫu chiết(*) Isoflavone Hàm lượng thành phần isoflavone (g/g) IsF pH TT IsF pH 2,5 IsF pH Daidzein Aglycon 129,0±4.2 126,7±2.8 124,7±4.7 Glycitein 9,7±1.2 9,0±0,9 9,3±1.2 Genistein 133.3±3,8 130,3±1.4 128,3±2.8 272,0±9.4 Tổng 266,0±5,2 262,3±9,0 Daidzin Glycoside 515,0±4.2 515.3±4.7 504,3±4.2 Glycitin 67,7±1.9 67.0±2.8 66,3±1.3 Genistin 578,0±2.8 574.3±3.9 567,0±3.8 Tổng 1160,7±5.2 1156,6±11.3 1137,6±9.3 a a Isoflavone tổng số 1432,7 ±14.6 1422,6 ±16.5 1399,9a±18.9 IsF pH TT: hàm lượng isoflavones dịch chiết pH trung tính; IsF pH 2,5: hàm lượng isoflavones dịch chiết pH 2,5; IsF pH 9: hàm lượng isoflavones dịch chiết pH So sánh mẫu chiết, hàm lượng khơng có chênh lệch lớn thành phần hàm lượng isoflavone tổng số mẫu, mẫu chiết pH trung tính cho hàm lượng isoflavone cao nhất, yếu tố pH khơng ảnh hưởng có nghĩa đến hiệu chiết isoflavones chúng tơi chọn mơi trường chiết pH trung tính để thực nghiên cứu 3.1.1.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol Hàm lượng aglycone glycoside tăng lên nồng độ ethanol tăng từ 60% đến 80% tăng tiếp nồng độ ethanol lên đến 100% làm giảm hàm lượng glycoside, đặc biệt giảm mạnh nồng độ ethanol 100%, hàm lượng aglycones khơng có khác biệt có nghĩa Nồng độ ethanol 80% hài hòa lượng cồn lượng nước để thành phần hòa tan tốt Do đó, nồng độ ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Mã số: B2017-ĐN06-07 12 ethanol 80% chọn cho nghiên cứu [31] Hình 3.1 Ảnh hưởng trình chiết đến hiệu chiết isoflavones a) Ảnh hưởng nồng độ, b) Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/đậu nành, c) ảnh hưởng nhiệt độ, d) ảnh hưởng thời gian 3.1.1.3 Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu Lượng dung môi ethanol so với lượng nguyên liệu cao hàm lượng isoflavone thu tăng tăng tốc độ truyền khối, đạt giá trị cao tỉ lệ dung môi/nguyên liệu=30/1 khơng có khác có nghĩa hàm lượng isoflavone thu nhận tỉ lệ kề Chúng chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu từ15/1 đến 25/1 cho bước khảo sát quy hoach thực nghiệm 3.1.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết Kết khảo sát cho thấy tăng nhiệt độ chiết hàm lượng isoflavone thu nhận tăng đạt giá trị cực đại 70 oC tăng gần đến giá trị nhiệt độ sơi dung mơi (78,8oC) gây thất dung mơi, cháy cục nguyên liệu gây phân hủy glycoside [32] Vì nhiệt độ chiết lựa chọn thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm 50 đến 70oC 3.1.1.5 Ảnh hưởng thời gian chiết Thời gian chiết có tác dụng đáng kể (p