- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney) - Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney - Tế [r]
(1)Công nghệ DNA tái tổ hợp
Nguyễn Vũ Phong
Lịch sử hình thành
• 1972 – 1973:DNA tái tổhợpin vitro từ3 nguồn vật liệu di truyền khác (Berg, Boyer Cohen)
• 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen, Henlinski, Boyer)
Tên gọi:
• Kỹthuật DNA tái tổhợp (DNA recombinant technology)
• Kỹthuật gene (Gene engineering) hay cơng nghệgene (Genetic technology)
• Thao tác gene (Gene manipulation) • Tạo dịng phân tử(Molecular cloning)
• Kỹthuật di truyền(Genetic engineering): thao tác với phần lớn bộgene
QUY TRÌNH TIẾN HÀNH
• Bước 1: Ni tếbào chủvà tếbào cho • Bước 2: Tách DNA plasmid DNA tế
bào cho
• Bước 3: Cắt DNA plasmid DNA mục tiêu loại enzyme cắt giới hạn • Bước 4: Trộn nối loại DNA
enzyme nối tạo DNA tái tổhợp hoàn chỉnh
• Bước 5: Chuyển DNA tái tổhợp vào tế
bào nhận (E coli, nấm men)
• Bước 6: Chọn lọc nhân dòng tếbào mang gene tái tổhợp
• Bước 7: Nghiên cứuđiều kiệnđểgene biểu sản phẩm
1 Enzyme
1.1 Enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease enzyme, RE)
- 1962: hạn chếsựsinh sản phage tếbào vi khuẩn
- Hệthống hạn chế- biếnđổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ
tếbào khỏi sựxâm nhập DNA lạ
Restriction enzyme.swf
1 Enzyme
1.1 Restriction endonuclease enzyme (RE)
- Trình tựnhận biết: gồm 4-6 cặp nuđối xứngđảo ngược(palindrom)
- Cắt tạo thànhđầu so le (sticky end) hayđầu (cohesive end)
- Khoảng 3000 RE với 230 trình tựnhận biết khác
- EcoRI: EscherichiacoliR: dịng vi khuẩnI: thứtựtìm (I:đầu tiên)
1 Enzyme 1.2 Enzyme nối (Ligase) Hình thành cầu phosphodiester
(2)1 Enzyme
1.3 Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) • Tổng hợpsợi DNA bổsung
c-DNA (complementary DNA) từ sợi mRNA từ polyribonucleotide tổng hợp
• c-DNA tổng hợp thành c-DNA kép (c-DNA
duplex) nhờ DNA
polymerase c-DNA kép dùng việc tạo dòng c-DNA
cDNA.swf
1.4 Các enzyme khác
Enzyme Chức năng
DNaseI Phân hủy DNA mạch kép phảnứng thủy phân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease) Nuclase BAL31 Phân hủy đầu mút 3’ 5’ DNA (Exon
nuclease) S1 nuclease Cắt DNA mạchđơn
Đoạn Klenow DNA polymerase cịn hoạt tính exonuclease 3’-5’
Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus
1 Enzyme
2 Các vector chuyển gene
Plasmid: - DNA vòng tròn
- Sao chép độc lập tế bào - Có khả mang số gene
có khả biểu thành protein
Vector:
- Phân tử DNA có khả tự tái - Tồn độc lập tế bào - Mang gene mong muốn
Yêu cầu tối thiểu vector chuyển gene
- Có trình tựkhởiđầu chép (ori) đểtựsao chép mà tồn tạiđộc lập - Trình tựnhận biết cho RE tạo vết
cắtđểchèn gene lạ
- Trình tự điều hịa (promoter) tạo điều kiện thuận lợi phiên mã gene lạ
- Đảm bảo di truyền bền vững DNA tái tổhợp
- Có geneđánh dấu (marker)đểdễ dàng nhận biết gene lạ 2 Các vector chuyển gene
2 Các vector chuyển gene Các loại vector chuyển gene
Vector Đặcđiểm Khảnăng chèn
Ứng dụng
Plasmid Dạng vòng 0,1 – 10kb Procaryote
Phageλ Tự động xâm nhiễm sinh
sản TB vi khuẩn
15 – 23 Kb Lập ngân hàng gene
Cosmid Plasmid + đoạn cos phage λ
45kb Lập thưviện gene
Phage M13
DNA mạchđơn Xácđịnh trình tựnu
Sản xuất mẫu dò Gâyđột biếnđiểm
định hướng
BAC NST nhân tạo vi khuẩn 50 – 300kb
YAC Vòng tròn micrometre cải
tiến
100-2000kb
MAC NST nhân tạođộng vật có vú >2000kb
2 Các vector chuyển gene
Ứng dụng vector chuyển gene
- Tạo dòng khuyếchđại trình tựDNA (nhiều sao) - Nghiên cứu sựbiểu củađoạn DNA
- Chuyển gene - Sản xuất RNA
- Sản xuất protein từgeneđược tạo dòng
(3)Plasmid Ti - 200Kb
- Agrobacterium tumefaciens - Chuyển gen thực vật
- Chuyển gắn ngẫu nhiên vào gene tế bào
2 Các vector chuyển gene 3 Hệ thống tế bào chủ
(Host) Mục đích:
- Nhân ni tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dịng - Biểu gene, đặc biệt Eukaryote
- Sản xuất protein tái tổ hợp
3.1 Escherichia coli (E.coli)
- Dễ ni cấy nhân dịng
- Dễ chấp nhận loại vector khác - Vi khuẩn Gram-, hình que,
- Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base 3 Hệ thống tế bào chủ
(Host)
3.2 Saccharomyces cerevisiae
- Eukaryoteđơn bào
- Dễdàng nuôi cấy thu sinh khối
- Phân lậpđược nhiều promotor hoạtđộng mạnh - Thực biếnđổi sau dịch mã tạo protein có
đủhoạt tính sinh học
- Sản xuất protein tái tổhợp dễdàng - Sinh vật an toàn
3.3 Hệ thống tế bào thực vật 3.4 Hệ thống tế bào động vật
- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Tế bào thận chuột đồng (BHK- Baby hamster kidney) - Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney - Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary) - Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều protein người - Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans
3 Hệ thống tế bào chủ (Host)
1 Lai nucleic acid
Đặc tínhbiến tínhvàhồi tínhcó thểlai DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
Kỹ thuật phương pháp căn bản
Southern Blot.swf
2 Thu nhận gene
- Thu nhận DNA từbộ gene
* Shotgun: toàn DNA sinh vật cắt đoạn nhỏ cơhọc hay RE gắn vào vector tạo dòng
*Ngân hàng/thưviện
DNA bộ gene
(Bank/Library of genomic DNA)
(4)2 Thu nhận gene
- Tổng hợp gene phương pháp hóa học
Kỹ thuật phương pháp căn bản
2 Thu nhận gene
- Lậpngân hàng c-DNA * Tạo gene từ mRNA thông tin nhờenzyme phiên mã ngược
Ưuđiểm
- Chứa trình tựmã hóa liên tục gene (không chứađoạn intron)
Kỹ thuật phương pháp căn bản
3 Tạo plasmid tái tổ hợp
a) Dùng đầu so le
Kỹ thuật phương pháp căn bản
3 Tạo plasmid tái tổ hợp
a) Dùng đầu so le
b) Dùng cácđoạn nối (linkers)
Kỹ thuật phương pháp căn bản
3 Tạo plasmid tái tổ hợp
a) Dùng đầu so le
b) Dùng cácđoạn nối (linkers) c) Dùng enzyme terminal transferase
Kỹ thuật phương pháp căn bản
4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
a) Hóa biến nạp
(5)4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
b) Điện biến nạp
Kỹ thuật phương pháp căn bản
4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
c) Vi tiêm
Kỹ thuật phương pháp căn bản
4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
d) Bắn gene
Kỹ thuật phương pháp căn bản
DNA coated golden particles
Gene gun
Cell division
A plant cell with
the new gene
Transgenic plant
Plant cell Cell’s DNA
Tạo chuyển gene
5 Chọn lọc, tạo dòng sự biểu hiện gene a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp
Kỹ thuật phương pháp căn bản
Screening.swf
5 Chọn lọc, tạo dòng sự biểu hiện gene b) Sự biểu gene thành protein
(6)Phản ứng tạo chuỗi nucleotide (Polymerase Chain Reaction, PCR) 1985, Kary Mullis
1 Nguyên tắc
PCR.swf
PCR dựa bướcởnhiệtđộkhác
1 Biến tính: tạo dâyđơn DNA với nhiệtđộ94oC
2 Bắt cặp: lai primers DNAđơn Nhiệtđộkhoảng 50oC
3 Kéo dài : tạo dây DNA bổsung với tácđộng polymerase dNTPs: 72oC.
Lặp lại chu kỳkhoảng 30-40 lần sẽtạo sốlượng DNA cần khuếchđạiđủquan sát gel qua trìnhđiện di
Polymerase Chain Reaction, PCR
2 Thành phần phản ứng - Primer
- Polymerase chịu nhiệt - dNTP
- Dung dịch đệm
- Mẫu
- Dung dịch đệm
Sequencing
1 Phương pháp hóa học Maxam Gilbert
Sequencing
1 Phương pháp hóa học Maxam Gilbert Phương pháp didesoxy F Sanger
Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA gene 1.1 Genomics:
- Xác định trình tự nucleotide gene chức chúng - Phát hiện, bảo tồn đa dạng sinh học, sử dụng chúng 1.2 Proteomics
- Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), biến đổi (modification), tương tác (interactions), chức (function)
- Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh 1.3 Human Genome Projet
1.4 Các ngành học khác - Cellomics - Metabolomics - Ionomics
Ứng dụng công nghệ gene Công nghệ protein tái tổ hợp -Sản xuất r-protein
STT Sản phẩm Các bệnh điều trị Năm hết patent
1 Insulin Tiểu đường 2001
2 Interferon alpha Viêm gan siêu vi B, ung
thư,
2002
3 Interferon beta Xơ cứng 2003
4 Hormon tăng tưởng người Thiểu tăng trưởng 2003
5 Erythropoetin Thiếu máu 2004
6 T-PA (tissu plasminogen activator)
Nhồi máu tim 2005
7 G-CSF (granulocyte –
COLONY Stimulating Factor
Chemotherapy-induced neutropenia
(7)Ứng dụng công nghệ gene Chẩn đoán phân tử
- Dựa phương pháp lai DNA: đặc hiệu, nhạy, xác, đơn giản - DNA marker: chuỗi DNA dùng để phân biệt cá thể, dòng
hoặc giống khác - Biomarker: dấu chuẩn sinh học - DNA fingerprinting: dấu vân tay di truyền - Microarray Biochips:
Ứng dụng công nghệ gene Vi sinh vật chuyển gene
- Genomics vi sinh vật: giải trình tự 200 loài vsv - Sản xuất hợp chất sơ cấp thứ cấp - Công nghệ bề mặt tế bào nấm men
Ứng dụng công nghệ gene Thực vật chuyển gene
- Cải thiện giống trồng: kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh, - Tạo giống chống chịu điều kiện khí hậu bất lợi, già hóa - Tạo sắc tố thực vật chuyển gene
- Biến đổi chất lượng thực phẩm trồng - Thực vật sản xuất vaccine, protein trị liệu - Sản xuất dầu nhờn công nghiệp - Sản xuất plastid
Ứng dụng công nghệ gene Động vật chuyển gene
- Động vật mang gene người làm mơ hình thí nghiệm (bệnh di truyền, ung thư,, thối hóa cơ, viêm khớp,…)
- Sản xuất protein tái tổ hợp - Chăn nuôi gene (gene farming)
7 Công nghệ gene sức khỏe người Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism) * Thiết kế thuốc cho bệnh nhân
* Nhận dạng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị Pharmacogenomics: (Dược học gene)
Cung cấp cách chữa bệnh an toàn hiệu cho cá nhân Gene therapy:
* Chuyển gen lành thay gene sai hỏng * Thay gene