Bài giảng Công nghệ sinh học: Công nghệ DNA tổ hợp - Nguyễn Vũ Phong - Trường Đại Học Quốc Tế Hồng Bàng

- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney) - Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney - Tế [r]

Công ngh

ệ

DNA tái t

ổ

h

ợ

p

Nguy

ễ

n V

ũ

Phong

L

ị

ch s

ử

hình thành

• 1972 – 1973:DNA tái tổhợpin vitro từ3 nguồn vật liệu di truyền khác (Berg, Boyer Cohen)

• 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen, Henlinski, Boyer)

Tên gọi:

• Kỹthuật DNA tái tổhợp (DNA recombinant technology)

• Kỹthuật gene (Gene engineering) hay cơng nghệgene (Genetic technology)

• Thao tác gene (Gene manipulation) • Tạo dịng phân tử(Molecular cloning)

• Kỹthuật di truyền(Genetic engineering): thao tác với phần lớn bộgene

QUY TRÌNH TI

Ế

N HÀNH

• Bước 1: Ni tếbào chủvà tếbào cho • Bước 2: Tách DNA plasmid DNA tế

bào cho

• Bước 3: Cắt DNA plasmid DNA mục tiêu loại enzyme cắt giới hạn • Bước 4: Trộn nối loại DNA

enzyme nối tạo DNA tái tổhợp hoàn chỉnh

• Bước 5: Chuyển DNA tái tổhợp vào tế

bào nhận (E coli, nấm men)

• Bước 6: Chọn lọc nhân dòng tếbào mang gene tái tổhợp

• Bước 7: Nghiên cứuđiều kiệnđểgene biểu sản phẩm

1 Enzyme

1.1 Enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease enzyme, RE)

- 1962: hạn chếsựsinh sản phage tếbào vi khuẩn

- Hệthống hạn chế- biếnđổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ

tếbào khỏi sựxâm nhập DNA lạ

Restriction enzyme.swf

1 Enzyme

1.1 Restriction endonuclease enzyme (RE)

- Trình tựnhận biết: gồm 4-6 cặp nuđối xứngđảo ngược(palindrom)

- Cắt tạo thànhđầu so le (sticky end) hayđầu (cohesive end)

- Khoảng 3000 RE với 230 trình tựnhận biết khác

- EcoRI: EscherichiacoliR: dịng vi khuẩnI: thứtựtìm (I:đầu tiên)

1 Enzyme

1.2 Enzyme nối (Ligase) Hình thành cầu phosphodiester

1 Enzyme

1.3 Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) • Tổng hợpsợi DNA bổsung

c-DNA (complementary DNA) từ sợi mRNA từ polyribonucleotide tổng hợp

• c-DNA tổng hợp thành c-DNA kép (c-DNA

duplex) nhờ DNA

polymerase c-DNA kép dùng việc tạo dòng c-DNA

cDNA.swf

1.4 Các enzyme khác

Enzyme Chức năng

DNaseI Phân hủy DNA mạch kép phảnứng thủy phân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease) Nuclase BAL31 Phân hủy đầu mút 3’ 5’ DNA (Exon

nuclease) S1 nuclease Cắt DNA mạchđơn

Đoạn Klenow DNA polymerase cịn hoạt tính exonuclease 3’-5’

Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus

1 Enzyme

2 Các vector chuy

ể

n gene

Plasmid: - DNA vòng tròn

- Sao chép độc lập tế bào - Có khả mang số gene

có khả biểu thành protein

Vector:

- Phân tử DNA có khả tự tái - Tồn độc lập tế bào - Mang gene mong muốn

Yêu cầu tối thiểu vector chuyển gene

- Có trình tựkhởiđầu chép (ori) đểtựsao chép mà tồn tạiđộc lập - Trình tựnhận biết cho RE tạo vết

cắtđểchèn gene lạ

- Trình tự điều hịa (promoter) tạo điều kiện thuận lợi phiên mã gene lạ

- Đảm bảo di truyền bền vững DNA tái tổhợp

- Có geneđánh dấu (marker)đểdễ dàng nhận biết gene lạ

2 Các vector chuy

ể

n gene

2 Các vector chuy

ể

n gene

Các loại vector chuyển gene

Vector Đặcđiểm Khảnăng chèn

Ứng dụng

Plasmid Dạng vòng 0,1 – 10kb Procaryote

Phageλ Tự động xâm nhiễm sinh

sản TB vi khuẩn

15 – 23 Kb Lập ngân hàng gene

Cosmid Plasmid + đoạn cos phage λ

45kb Lập thưviện gene

Phage M13

DNA mạchđơn Xácđịnh trình tựnu

Sản xuất mẫu dò Gâyđột biếnđiểm

định hướng

BAC NST nhân tạo vi khuẩn 50 – 300kb

YAC Vòng tròn micrometre cải

tiến

100-2000kb

MAC NST nhân tạođộng vật có vú >2000kb

2 Các vector chuy

ể

n gene

Ứng dụng vector chuyển gene

- Tạo dòng khuyếchđại trình tựDNA (nhiều sao) - Nghiên cứu sựbiểu củađoạn DNA

- Chuyển gene - Sản xuất RNA

- Sản xuất protein từgeneđược tạo dòng

Plasmid Ti - 200Kb

- Agrobacterium tumefaciens - Chuyển gen thực vật

- Chuyển gắn ngẫu nhiên vào gene tế bào

2 Các vector chuy

ể

n gene

3 H

ệ

th

ố

ng t

ế

bào ch

ủ

(Host)

Mục đích:

- Nhân ni tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dịng - Biểu gene, đặc biệt Eukaryote

- Sản xuất protein tái tổ hợp

3.1 Escherichia coli (E.coli)

- Dễ ni cấy nhân dịng

- Dễ chấp nhận loại vector khác - Vi khuẩn Gram-, hình que,

- Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base

3 H

ệ

th

ố

ng t

ế

bào ch

ủ

(Host)

3.2 Saccharomyces cerevisiae

- Eukaryoteđơn bào

- Dễdàng nuôi cấy thu sinh khối

- Phân lậpđược nhiều promotor hoạtđộng mạnh - Thực biếnđổi sau dịch mã tạo protein có

đủhoạt tính sinh học

- Sản xuất protein tái tổhợp dễdàng - Sinh vật an toàn

3.3 Hệ thống tế bào thực vật 3.4 Hệ thống tế bào động vật

- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Tế bào thận chuột đồng (BHK- Baby hamster kidney) - Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney - Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary) - Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều protein người - Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans

3 H

ệ

th

ố

ng t

ế

bào ch

ủ

(Host)

1 Lai nucleic acid

Đ

ặc tínhbiến tínhvàhồi tínhcó thểlai DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

Southern Blot.swf

2 Thu nh

ậ

n gene

- Thu nhận DNA từbộ gene

* Shotgun: toàn DNA sinh vật cắt đoạn nhỏ cơhọc hay RE gắn vào vector tạo dòng

*Ngân hàng/thưviện

DNA bộ gene

(Bank/Library of genomic DNA)

2 Thu nh

ậ

n gene

- Tổng hợp gene phương pháp hóa học

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

2 Thu nh

ậ

n gene

- Lậpngân hàng c-DNA * Tạo gene từ mRNA thông tin nhờenzyme phiên mã ngược

Ưuđiểm

- Chứa trình tựmã hóa liên tục gene (không chứađoạn intron)

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

3 T

ạ

o plasmid tái t

ổ

h

ợ

p

a) Dùng đầu so le

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

3 T

ạ

o plasmid tái t

ổ

h

ợ

p

a) Dùng đầu so le

b) Dùng cácđoạn nối (linkers)

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

3 T

ạ

o plasmid tái t

ổ

h

ợ

p

a) Dùng đầu so le

b) Dùng cácđoạn nối (linkers) c) Dùng enzyme terminal transferase

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

4 Bi

ế

n n

ạ

p DNA tái t

ổ

h

ợ

p vào t

ế

bào

a)

Hóa bi

ế

n n

ạ

p

4 Bi

ế

n n

ạ

p DNA tái t

ổ

h

ợ

p vào t

ế

bào

b)

Đ

i

ệ

n bi

ế

n n

ạ

p

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

4 Bi

ế

n n

ạ

p DNA tái t

ổ

h

ợ

p vào t

ế

bào

c) Vi tiêm

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

4 Bi

ế

n n

ạ

p DNA tái t

ổ

h

ợ

p vào t

ế

bào

d) B

ắ

n gene

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

DNA coated golden particles

Gene gun

Cell division

A plant cell with

the new gene

Transgenic plant

Plant cell Cell’s DNA

T

ạ

o chuy

ể

n gene

5 Ch

ọ

n l

ọ

c, t

ạ

o dòng s

ự

bi

ể

u hi

ệ

n gene

a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp

K

ỹ

thu

ậ

t ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

Screening.swf

5 Ch

ọ

n l

ọ

c, t

ạ

o dòng s

ự

bi

ể

u hi

ệ

n gene

b) Sự biểu gene thành protein

Ph

ả

n

ứ

ng t

ạ

o chu

ỗ

i nucleotide

(Polymerase Chain Reaction, PCR)

1985, Kary Mullis

1 Nguyên tắc

PCR.swf

PCR dựa bướcởnhiệtđộkhác

1 Biến tính: tạo dâyđơn DNA với nhiệtđộ94oC

2 Bắt cặp: lai primers DNAđơn Nhiệtđộkhoảng 50oC

3 Kéo dài : tạo dây DNA bổsung với tácđộng polymerase dNTPs: 72oC.

Lặp lại chu kỳkhoảng 30-40 lần sẽtạo sốlượng DNA cần khuếchđạiđủquan sát gel qua trìnhđiện di

Polymerase Chain Reaction, PCR

2 Thành phần phản ứng - Primer

- Polymerase chịu nhiệt - dNTP

- Dung dịch đệm

- Mẫu

- Dung dịch đệm

Sequencing

1 Phương pháp hóa học Maxam Gilbert

Sequencing

1 Phương pháp hóa học Maxam Gilbert Phương pháp didesoxy F Sanger

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

Khai thác DNA gene 1.1 Genomics:

- Xác định trình tự nucleotide gene chức chúng - Phát hiện, bảo tồn đa dạng sinh học, sử dụng chúng 1.2 Proteomics

- Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), biến đổi (modification), tương tác (interactions), chức (function)

- Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh 1.3 Human Genome Projet

1.4 Các ngành học khác - Cellomics - Metabolomics - Ionomics

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

Công nghệ protein tái tổ hợp -Sản xuất r-protein

STT Sản phẩm Các bệnh điều trị Năm hết patent

1 Insulin Tiểu đường 2001

2 Interferon alpha Viêm gan siêu vi B, ung

thư,

2002

3 Interferon beta Xơ cứng 2003

4 Hormon tăng tưởng người Thiểu tăng trưởng 2003

5 Erythropoetin Thiếu máu 2004

6 T-PA (tissu plasminogen activator)

Nhồi máu tim 2005

7 G-CSF (granulocyte –

COLONY Stimulating Factor

Chemotherapy-induced neutropenia

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

Chẩn đoán phân tử

- Dựa phương pháp lai DNA: đặc hiệu, nhạy, xác, đơn giản - DNA marker: chuỗi DNA dùng để phân biệt cá thể, dòng

hoặc giống khác - Biomarker: dấu chuẩn sinh học - DNA fingerprinting: dấu vân tay di truyền - Microarray Biochips:

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

Vi sinh vật chuyển gene

- Genomics vi sinh vật: giải trình tự 200 loài vsv - Sản xuất hợp chất sơ cấp thứ cấp - Công nghệ bề mặt tế bào nấm men

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

Thực vật chuyển gene

- Cải thiện giống trồng: kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh, - Tạo giống chống chịu điều kiện khí hậu bất lợi, già hóa - Tạo sắc tố thực vật chuyển gene

- Biến đổi chất lượng thực phẩm trồng - Thực vật sản xuất vaccine, protein trị liệu - Sản xuất dầu nhờn công nghiệp - Sản xuất plastid

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

Động vật chuyển gene

- Động vật mang gene người làm mơ hình thí nghiệm (bệnh di truyền, ung thư,, thối hóa cơ, viêm khớp,…)

- Sản xuất protein tái tổ hợp - Chăn nuôi gene (gene farming)

7 Công nghệ gene sức khỏe người Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism) * Thiết kế thuốc cho bệnh nhân

* Nhận dạng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị Pharmacogenomics: (Dược học gene)

Cung cấp cách chữa bệnh an toàn hiệu cho cá nhân Gene therapy:

* Chuyển gen lành thay gene sai hỏng * Thay gene