Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật RFLP PCR và thử nghiệm phát hiện nhiễm một số nấm ở bệnh nhân viêm não màng não

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Mai Thị Minh Ngọc NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT RFLP-PCR VÀ THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN NHIỄM MỘT SỐ NẤM Ở BỆNH NHÂN VIÊM NÃO, MÀNG NÃO LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Mai Thị Minh Ngọc NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT RFLP-PCR VÀ THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN NHIỄM MỘT SỐ NẤM Ở BỆNH NHÂN VIÊM NÃO, MÀNG NÃO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Duy Bắc GS.TS Đặng Thị Thu HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Luận văn sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát nhiễm Candida Cryptococcus neoformans dịch não tủy” ”, mã số: 2013.75.59 Học viện Quân y chủ trì Là người tham gia thực nội dung thuộc đề tài trình bày luận văn này, xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa tác giả khác công bố luận văn, luận án chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận văn Hà Nội, ngày 26 tháng5 năm 2014 Học viên Mai Thị Minh Ngọc LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn này, nhận hướng dẫn, giúp đỡ quý báu thầy cô, anh chị, bạn đồng nghiệp quan Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Duy Bắc – Phó trưởng phịng Đào tạo, Học viện Quân y GS.TS Đặng Thị Thu, Ngun Phó viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt trình học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Chân thành cảm ơn ThS.BS Đỗ Ngọc Ánh cán bộ, nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Bộ môn ký sinh trùng - Học viện Quân y tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Viện Đào tạo Sau đại học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giảng dạy tạo điều kiện cho q trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, Tập thể cán Phòng Khảo thí & Đảm bảo chất lượng - Viện Đại học Mở Hà Nội động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình cơng tác thực nghiên cứu để hoàn thành luận văn Cuối xin cảm ơn bố mẹ, chồng, con, anh chị em, người thân động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Học viên Mai Thị Minh Ngọc MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Bệnh viêm não, màng não 1.2.Đặc điểm sinh học số loài nấm men 1.2.1.Nấm Cr neoformans 1.2.2.Nấm Candida 10 1.3.Các kỹ thuật chẩn đoán nấm gây viêm não, màng não 122 1.3.1.Soi tươi 12 1.3.2.Nuôi cấy 13 1.3.3.Chẩn đoán huyết 144 1.3.4.Chẩn đoán kỹ thuật sinh học phân tử 155 1.3.4.1 Kỹ thuật PCR 15 1.3.4.2 Kỹ thuật PCR ngược (RT-PCR) 19 1.3.4.3 Kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) 19 1.3.4.4 Kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex PCR) 19 1.3.4.5 Kỹ thuật RAPD 20 1.3.4.6 Kỹ thuật AFLP 20 1.3.4.7 Kỹ thuật RFLP 20 1.3.4.8 Kỹ thuật RFLP-PCR 21 1.3.5 Kỹ thuật giải trình tự gen yếu tố ảnh hưởng 24 1.3.5.1.Sơ lược kỹ thuật giải trình tự 24 1.3.5.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng đọc trình tự 25 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1.Vật liệu nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Thu thập phân lập mẫu nấm sử dụng nghiên cứu 27 2.2.1.1 Kỹ thuật nuôi cấy 27 2.2.1.2 Phương pháp soi tươi nhuộm 27 2.2.1.3 Thử nghiệm huyết 28 2.2.2 Tách DNA chạy phản ứng PCR 28 2.2.2.1 Tách DNA 28 2.2.2.2 Chạy phản ứng PCR 30 2.2.3 Phân tích sản phẩm PCR enzyme MspI 30 2.2.4 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR cắt giới hạn 31 2.2.5 Điện di kiểm tra ngưỡng phát 31 2.2.6 Điện di kiểm tra tính đặc hiệu 31 2.2.7 Giải trình tự gen đoạn gen thu từ phản ứng PCR 31 2.3 Phân tích xử lý số liệu nghiên cứu 33 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 Kết xây dựng quy trình RFLP-PCR phát nhiễm nấm Candida (C albicans, C glabrata, C krusei, C parapsilosis, C tropicalis) Cryptococcus neoformans 34 3.1.1.Nuôi cấy tách chiết DNA từ chủng nấm chuẩn 34 3.1.2.Tối ưu hóa quy trình phản ứng PCR 36 3.1.2.1.Tối ưu nồng độ Mg2+ 36 3.1.2.2.Kết tối ưu nồng độ dNTP 37 3.1.2.3.Kết tối ưu nồng độ nhiệt độ gắn mồi 38 3.1.3.Kết cắt giới hạn enzym MspI 40 3.1.4.Kết thử ngưỡng phát 41 3.1.5.Kết thử tính đặc hiệu cặp mồi ITS1 ITS4 44 3.2.Kết giám định lại lồi dựa vào phân tích trình tự gen 45 3.2.1.Kết giải trình tự chủng nấm chuẩn 45 3.2.2.Kết xác định loài dựa vào trình tự 48 3.3 Bước đầu thử nghiệm kỹ thuật RFLP-PCR nấm Candida Cr.neoformans từ mẫu bệnh phẩm người 51 3.3.1.Phân lập chủng nấm Candida Cr neoformans từ mẫu bệnh phẩm người 51 3.3.2.Kết định danh chủng nấm kỹ thuật soi tươi nuôi cấy 52 3.3.3.Kết đánh giá khả phát nhiễm nấm Candida Cr.neoformans kỹ thuật RFLP-PCR xây dựng 53 3.3.4 Kết kiểm tra giải trình tự gen 55 3.4 Kết chẩn đoán phát nấm dịch não tủy bệnh nhân viêm não, màng não kỹ thuật RFLP-PCR 58 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 68 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A : Adenine AIDS : Acquired Immunodeficiency Syndrome C : Cytosine CS : Cộng CFU : Colony Forming Unit DNA : DeoxyriboNucleic Acid dNTP : Deoxynucleotide triphotphat ETDA : EthyleneDiamineTetraacetic Acid EtBr : Ethidium bromide G : Guanine HIV : Human immunodeficiency virus ITS : Internal Transcribed Spacer MRI : Magnetic Resonance Imaging OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction RFLP : Restriction fragment length polymorphism RNA : RiboNucleic Acid T : Thymine UI : Unit International DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Kết nồng độ dịch treo nồng độ DNA thu từ chủng nấm chuẩn 35 Bảng 3.2: Kết ngưỡng phát theo nồng độ dịch nấm………………… … 42 Bảng 3.3: Kết ngưỡng phát theo nồng độ DNA…………… …………….43 Bảng 3.4: Kết thử tính đặc hiệu cặp mồi ITS1 ITS4 DNA vi khuẩn, virus HBV người…………………….……………… 44 Bảng 3.5: Trình tự đoạn gen thu từ chủng nấm………………… …….…46 Bảng 3.6: Tỷ lệ tương đồng trình tự gen thu với ngân hàng gen 48 Bảng 3.7 Phân loại mẫu bệnh phẩm theo giới tính vị trí phân lập 51 Bảng 3.8: Kết định danh nấm Candida Cr neoformans phân lập Việt Nam hình thái thử nghiệm huyết 52 Bảng 3.9: Kết định danh nấm Candida Cr neoformans kỹ thuật RFLPPCR .54 Bảng 3.10: Sự phù hợp kết định loài kỹ thuật RFLP-PCR giải trình tự số mẫu vi nấm 55 Bảng 3.11 Kết giải trình tự nucleotide chủng nấm N19, N55 .57 Bảng 3.12 Kết chẩn đoán phát nấm dịch não tủy bệnh nhân viêm não, màng não 59 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc mơi trường Sabouraud tế bào nấm tiêu soi tươi, thử nghiệm huyết nhuộm mực tàu 34 Hình 3.2 Kết khảo sát nồng độ Mg2+ 37 Hình 3.3 Kết khảo sát nồng độ dNTP 38 Hình 3.4 Kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi chủng nấm Cr neoformans (A) C albicans (B) 39 Hình 3.5 Kết phản ứng PCR nhiệt độ gắn mồi 550C chủng nấm … 40 Hình 3.6 Sản phẩm PCR cắt giới hạn enzym MspI chủng nấm Candida Cr neoformans…… …………………………… ……… 41 Hình 3.7 Kết ngưỡng phát phản ứng PCR chủng nấm…… …43 Hình 3.8 Kết thử tính đặc hiệu với cặp mồi ITS1 ITS4………….…….……45 Hình 3.9 Minh họa so sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide chủng C albicans với ngân hàng gen………………………………………………….…… …48 Hình 3.10 Minh họa so sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide chủng C parapsilosis với ngân hàng gen………………………………………………………49 Hình 3.11 Minh họa so sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide chủng C tropicalis với ngân hàng gen………………………………………………………49 Hình 3.12 Minh họa so sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide chủng Cr neoformans với ngân hàng gen……………………………………… …………….50 Hình 3.13 Sơ đồ quy trình kỹ thuật RFLP-PCR phát nấm Candida Cr.neoformans bệnh nhân viêm não, màng não…………… .……51 Hình 3.14 Sản phẩm PCR sản phẩm cắt Enzym MspI chủng nấm phân lập từ mẫu bệnh phẩm người 56 Bảng 3.12: Kết chẩn đoán phát nấm dịch não tủy 20 bệnh nhân viêm não, màng não TT Mã Bệnh nhân Nhiễm HIV Kết soi tươi, Kết xác định nhuộm mực tàu kt RFLP-PCR 130607870 (-) (-) (-) 130710663 (-) (-) (-) 130912926 (-) (-) (-) 130521A69 (-) (-) (-) 131029581 (-) (-) (-) 130616100 (-) (-) (-) 131014A10 (-) (-) (-) 130611544 (+) (+) Cr neofomans (+) Cr neofomans 130911671 (-) (-) (-) 10 130911671 (-) (-) (-) 11 130610764 (-) (-) (-) 12 131020009 (-) (-) (-) 13 131110055 (+) (+) Cr neofomans (+) Cr neofomans 14 130729786 (-) (+) C albicans (+) C albicans 15 130726830 (-) (-) (-) 16 130608111 (-) (-) (-) 17 130810060 (-) (-) (-) 18 130830107 (-) (-) (-) 19 130701286 (-) (-) (-) 20 131018491 (-) (-) (-) Ghi chú: (-): Âm tính (+): Dương tính Kết kỹ thuật RFLP-PCR phát dịch não tủy 3/20 bệnh nhân viêm não, màng não dương tính với nấm, có bệnh nhân nhiễm HIV dương tính với nấm Cr neoformans bệnh nhân dương tính nấm C albicans Kết thu phù hợp với kỹ thuật nuôi cấy Từ kết cho thấy, kỹ thuật RFLP-PCR thực cách liên tục, thời gian chẩn đoán khoảng 10 (1.5 phá màng tế bào nấm 59 enzyme lyticase, tách chiết DNA, 2.5 chạy PCR, 1.5 cắt giới hạn enzyme MspI, 0.5-1 điện di kiểm tra), thời gian nhanh nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy (48-72 giờ) Rõ ràng với thời gian kỹ thuật đáp ứng tốt u cầu chẩn đốn nhanh, xác nguyên nấm Candida Cr neoformans gây bệnh Hiện có nhiều phương pháp để chẩn đốn, phương pháp RFLPPCR có tính ổn định, dễ thực hiện, giá thành phù hợp Tác dụng enzym cắt giới hạn đặc hiệu nên kết cho cho âm tính giả thấp Điều giúp người bệnh điều trị sớm, thuốc, làm giảm thời gian nằm viện, giảm chi phí điều trị tránh tai biến, biến chứng chẩn đốn muộn, điều trị khơng đúng, không kịp thời gây 60 KẾT LUẬN Đã xây dựng điều kiện cho quy trình kỹ thuật RFLP-PCR để phát loài nấm men C.albicans, C glabrata, C krusei, C parapsilosis, C.tropicalis Cryptococcus neoformans thường gây bệnh viêm não, màng não người Đã bước đầu thử nghiệm quy trình kỹ thuật RFLP-PCR phát định danh loài nấm men từ 60 mẫu bệnh phẩm (8 mẫu dịch não tủy, 43 mẫu dịch âm đạo, mẫu máu, mẫu nước tiểu) chẩn đoán phát nấm dịch não tủy 20 bệnh nhân viêm não, màng não 61 KIẾN NGHỊ Ứng dụng kỹ thuật RFLP-PCR để phát C.albicans, C glabrata, C krusei, C parapsilosis, C tropicalis Cryptococcus neoformans thường gây bệnh viêm não, màng não người Việt Nam với số lượng mẫu bệnh phẩm lớn Tiếp tục nghiên cứu phát triển kỹ thuật RFLP-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát số loài vi khuẩn virus khác gây bệnh viêm não, viêm màng não người 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình, Quyền Đình Thi (2009), Cơ sở cơng nghệ sinh học, Tập 1, NXB Giáo dục Việt Nam Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Nhữ Thị Hoa cs (2011), Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng viêm não – màng não Cryptococcus neoformans bệnh viện Nhiệt đới Tp.HCM từ 11/2008 đến 6/2009, Tạp chí Y học Tp.HCM, Chuyên đề Ký sinh trùng, 16(1/2012), tr: 76-82 Võ Thị Phương Lan (2008), Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc cs (2007), Giáo trình Cơng nghệ DNA tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Trần Xuân Mai cs (2004), Vi nấm y học Trường đại học y dược TP HCM., tr: 107-120 Lê Bách Quang cs (2005), Ký sinh trùng trùng y học, Giáo trình giảng dạy sau đại học – Học viện Quân y, NXB Quân đội nhân dân Lê Bách Quang cs (2008), Ký sinh trùng trùng y học, Giáo trình giảng dạy đại học – Học viện Quân y, Nhà xuất Quân đội nhân dân, tr: 382-386 10 Lê Bách Quang cs (2010), Kỹ thuật ký sinh trùng Giáo trình giảng dạy đại học – Học viện Quân y, Nhà xuất Quân đội nhân dân, tr: 310-319 11 Trần Phú Mạnh Siêu cs (2006), Tình hình nhiễm vi nấm nội tạng bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS bệnh viện Nhiệt đới năm 2003-2005, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, 10 (1/2006), tr: 99-104 12 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng Giáo trình giảng dạy – Đại học Bách Khoa Hà Nội, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 63 13 Quyền Đình Thi (2005), Cơng nghệ Sinh học, Những kỹ thuật phân tích DNA, (1), NXB Khoa học kỹ thuật 14 Nguyễn Lê Như Tùng cs (2010), Đặc điểm nhiễm khuẩn huyết nấm Cryptococcus Neoformans bệnh nhân người lớn nhiễm HIV/AIDS điều trị bệnh viện nhiệt đới năm 2005-2006, Tạp chí Y học Tp.HCM, 14(1), tr: 435439 15 Quyết định Bộ trưởng Bộ Y tế số 06/2005/QĐ-BYT ngày 07 tháng năm 2005 việc ban hành hướng dẫn chẩn đoán điều trị nhiễm HIV TIẾNG ANH 16 Alexandra Correia, Paula Sampaio, and Judite Almeida (2004), Study of Molecular Epidemiology of Candidasis in Portugal by PCR Fingerprinting of Candida Clinical Isolates, Journal of Clinical Microbiology, 42(12), pp 58995903 17 Amar Safdar et al (2001), Prospective Study of Candida Species in Patients at a Comprehensive Cancer Center, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45(7), pp 2129-2133 18 Arturo Casadevall, John R Perfect (1998), Cryptococcus neoformans, American Society for Microbiology 19 Catriona Halliday et al (2005), Development of a Nested Qualitative RealTime PCR Assay To Detect Aspergillus Species DNA in Clinical Specimens Journal of Clinical Microbiology, 43(10), pp 5366-5368 20 Consuelo Ferrer et al (2001), Detection and Identification of Fungal Pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S Ribosomal DNA Typing in Ocular Infecttions, Journal of Clinical Microbiology, 39(8), pp 2873-2879 21 David W Williams et al (1995), Identification of Candida species by PCR and restriction fragment length polymorphism analysis of intergenic spacer regions of ribosomal DNA, Journal of Clinical Microbiology, 33(9), pp 24762479 64 22 Dolan Champa Saha et al (2009), Detection of Cryptococcus by conventional serological and molecular methods, Journal of Medical Microbiology, 58, pp 1098-1105 23 Donald G barceloux (2008), Medical toxicology of natural substances, A John Wiley & sons, Inc., Publication, pp 315-371 24 Drs Alessandro C Pasqualotto and David W Denning (2005) Diagnosis of Invasive Fungal Infections–Current Limitations Classical and New Diagnostic Methods, European Oncology Review, pp 1-11 25 J.E Safdieh CS (2008), Bacterial and fungal meningitis inpatients with cancer, 70, pp 943–947 26 Jeremy N Day (2004), Cryptococcal meninggitis, Practical neurology, pp 274-285 27 John J Pagani et al (1981), Opportunistic Fungal Pneumonias in Cancer Patients AJR, 137, pp 1033-1039 28 K Diba et al (2012), Identification of Candida species isolated from hospital acquired infections patients and hospital indoor environments, Journal of Microbiology 29 Louie JK, Nguyen HC et al (2004), Inter Jrnt of STD & AIDS 2004, 15, pp 758-761 30 Majid ZARRIN (2010), Isolation of Cryptococcus neoformansfrom pigeon droppings in Ahwaz, Iran, 40(2), pp 313-316 31 Mark D Lindsley et al (2001), Rapid Identification of Dimorphic and YeastLike Fungal Pathogens Using Specific DNA Probes, Journal of Clinical Microbiology, 39(10), pp 3505-3511 32 Mohammad Ghahri et al (2012), Identification of Candida Speccies Screened from Catheter using Patients with PCR-RFLP method, European Journal of Experimental Biology, 2(3), pp 651-656 33 N Jain et al (2005), Molecular Epidemiology of Clinical Cryptococcus neoformans Strains from India, Journal of Clinical Microbiology, 43(11), pp 5733-5742 65 34 Nam K Tran et al (2011), Multiplex Polymerase Chain Reaction Pathogen Detection in Trauma, Emergency, and Burn Surgery Patients with Suspected Septicemia, Journal of Surgery, 151(3), pp 456-463 35 Nongnuch Vanittanakom et al (2006), Penicillium marneffei Infection and Recent Advances in the Epidemiology and Molecular Biology Aspects, Clinical Microbiology Reviews, pp 95-110 36 Omar Luoi et al (2005), Fungal tropical diseases, Journal American Academic Dermatol, 53(6), pp 931-951 37 Paola Rappelli et al (1998), Development of a Nested-PCR for Detection of Cryptococcus neoformans in Cerebrospinal Fluid, Journal of Clinical Microbiology, pp 3438-3440 38 Pei-Lan Shao et al (2006), Invasive fungal infection-laboratory diagnosis and antifugal treatment, Journal of Microbology, 39, pp 178-188 39 Ralf Bialek et al (2002), Detection of Cryptococcus neoformans DNA in Tissue Sample by Nested and Real-Time PCR Assays, Clinical and Diagnostic Laboratory immunology, 9(2), pp 461-469 40 Rui Kano, Yasuhito, Fujino, Nobuko, Takamono, Hajime Tsujimoto, Atsuhiko Hasegawa (2001), PCR detection of the Cryptococcus neoformans CAP59 gene from a biopsy specimen from a case of feline cryptococcosis Journal Vet Diagn Invest, 13, pp 439-442 41 S Arunmozhi Balaijee et al (2007), DNA and the classical way: Identification of medically important molds in the 21st century, Medical Mycology, 45, pp 475-490 42 Seyyed Amin Ayatollahi Mousavi et al (2012), Identification of Candida Species Isolated from Oral Colonization in Iranian HIV-Positive, by PCRRFLP method, Jundishapur Journal Microbiol, 5(1), pp:336-340 43 SH Mirhendi et al (2001), A PCR-RFLP method to Identification of the Important Opportunistic Fungei: Candida Species, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus and Fusarium solani, Iranian J Publ Health, 30(3-4), pp 103-116 66 44 Shahindokht Bassiri Jahromi, Mansoor Abachi et al (2006), Detection of Cryptococcus neoformans by Semi-Nested PCR in cerebrospinal fruild, Medical Journal of the Islamic Republic of Iran, 20(2), pp 62-65 45 S S Y Wong et al (1999), Penicilliosis marneffei – West meets East, Journal Medical Microbiol, 48, pp 973-975 46 S S Y Wong et al (2011), Penicilliosis marneffei Infection in AIDS Pathology Research International, pp 1-10 47 T Shokohi et al (2010), Identification of Candida species using PCR-RFLP in cancer patients in Iran, Indian J Med Microbiol, 28, pp 147-151 48 Tihana Bicanic and Thomas S Harrison (2004), Cryptococcal meningitis, British Medical Bulletin, 72, pp 99-118 49 T Shokohi, MB Hashemi Soteh, Z Saltanat Pouri, MT Hedayati, S Mayahi (2010), Identification of Candida species using PCR-RFLP in cancer patients in Iran, Indian J Med Microbiol, 28, pp.147-151 50 Ulrike Binder et al (2011), Epidemiology of Invasive Fungal Infections in the Mediterranean Area, Open Journal System, 51 Virat Sirisanthana and Thira Sirisanthana (1995), Disseminated Penicillium marneffei infection in human immunodeficiency virus-infected children, The Pediatric Infectious Disease Journal, 14(11) 52 Van Burik et al (1998), Panfugal PCR Assay for Detection of Fungal Infection in Human Blood Specimens, Journal of Clinical Microbiology, 36(5), pp 1169-1175 53 Xiaobo Feng Zhirong Yao, Daming Ren and Wanqing Liao (2008), Simultaneous identification of molecular and mating types within the Cryptoccus species complex by PCR-RFLP analysis, Journal of Medical Microbiology, 57, pp 1481-1490 54 Youssuf Gherbawy, Kerstin Voigt (2010), Molecular Identification of Fungi, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp.317-417 55 Zaremba ML et al (2006), Incidence rate of Candida species in the oral cavity of middle-aged and elderly subjects, Advances in Medical Sciences, 51(1), pp 233-236 67 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Đỗ Ngọc Ánh, Mai Thị Minh Ngọc, Trần Việt Tiến, Nguyễn Duy Bắc, Nguyễn Khắc Lực (2013) Ứng dụng kỹ thuật RFLP-PCR phát nấm Cryptococcus neoformans gây bệnh người Tạp chí Y học Việt Nam, số 1, tr.79-85 Mai Thị Minh Ngọc, Nguyễn Văn Ba, Nguyễn Khắc Lực, Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Duy Bắc, Đặng Thị Thu (2014) Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định thành phần loài nấm men phân lập đường sinh dục Tạp chí Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, số 2, tr.34-38 68 PHỤ LỤC Giấy xác nhận đồng ý cho sử dụng số liệu nghiên cứu đề tài vào luận văn thạc sĩ Danh sách 60 chủng nấm phân lập Việt Nam Danh sách bệnh nhân viêm não, màng não lấy dịch não tủy phục vụ chẩn đoán phân tử ... RFLP- PCR thử nghiệm phát nhiễm số nấm bệnh nhân viêm não, màng não? ?? với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình kỹ thuật RFLP- PCR để phát số loài nấm thường gặp bệnh nhân viêm não, màng não Bước đầu thử. .. Bước đầu thử nghiệm khả phát số loài nấm từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân viêm não, màng não kỹ thuật RFLP- PCR NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Xây dựng quy trình kỹ thuật RFLP- PCR để phát nhiễm số loài nấm (Candida... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Mai Thị Minh Ngọc NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT RFLP- PCR VÀ THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN NHIỄM MỘT SỐ NẤM Ở BỆNH NHÂN VIÊM NÃO, MÀNG NÃO Chuyên