nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối bacillus spp làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN H U T M Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid U N ÁN TIẾN S DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN H U T M Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid CHUY N NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM M SỐ: 62 73 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN CÁT ĐÔNG GS.TS NGUY N V N TH NH Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2015 i ời cam oan Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày Luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Người viết cam đoan Trần Hữu Tâm ii Mục lục Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục anh mục chữ viết t t Danh mục bảng Danh mục hình anh mục s đ ĐẶT VẤN ĐỀ Chư ng T NG QU N T I LI U 1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.2 Carotenoid 1.3 Các vi sinh vật sinh carotenoid 1.4 Nghiên cứu vi khuẩn sinh carotenoid gi i t i Việt Nam 1.5 Lên men sản xuất sinh khối 1.6 Thực phẩm chức n ng probiotic - ứng dụng y học Chư ng Đ I T NG, V T LI U, THI T V PH NG PH P NGHI N CỨU 2.1 Đối tượng 2.2 Vật liệu 2.3 Trang thiết b 2.4 Phư ng pháp nghiên cứu Chư ng K T QUẢ NGHI N CỨU 3.1 Phân lập, sàng lọc s b đ nh danh vi khuẩn 3.2 Khảo sát đặc điểm probiotic 3.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy đường cong t ng trưởng 3.4 Khảo sát đặc điểm sinh carotenoid 3.5 Khảo sát môi trường thay 3.6 Khảo sát thông số lên men thu bào tử môi trường lỏng 3.7 Lên men thu bào tử 3.8 S b xây dựng tiêu chuẩn c sở nguyên liệu sinh khối 3.9 Thử nghiệm đ c tính 3.10 Khả n ng hấp thu, tích lũy carotenoid từ T14 1.1 gan chu t 3.11 Khả n ng tr tiêu chảy kháng sinh DD1.1, AT14 3.12 Khả n ng ứng dụng T14 1.1 m t số d ng chế phẩm i ii iv vi ix x 3 16 19 21 24 28 28 28 29 30 49 49 55 63 65 70 81 86 99 104 111 111 115 iii Chư ng N LU N 4.1 Vi khuẩn sinh carotenoid 4.2 Môi trường thay 4.3 Lên men thu bào tử tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối 4.4 Đ c tính hai chủng T14 1.1 4.5 Hấp thu, tích lũy carotenoid từ T14 1.1 gan chu t 4.6 Khả n ng điều tr tiêu chảy liên quan đến kháng sinh 4.7 Khả n ng ứng dụng bào tử T14 1.1 sinh carotenoid m t số d ng chế phẩm K T LU N KI N NGH NH M C C C C NG TR NH Đ C NG T I LI U TH M KHẢO PH L C 120 120 124 127 129 130 131 132 134 136 PL-1 iv Danh mục ch vi t t t Ch vi t t t Ti ng nh Ti ng Việt 2SG 2xSchaeffer's sporulation agar Th ch 2SG ADN Acid Deoxyribonucleic Vật liệu di truyền BHT Butylated Hydroxyl Toluene Chất butylated hydroxyl toluene BLAST Basic Local Alignment Search Tool Cơng cụ tìm kiếm so sánh chuỗi sinh học CFU Colony Forming Unit Đ n v tính vi khuẩn CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute Viện tiêu chuẩn phịng thí nghiệm lâm sàng CMC Carboxymethyl cellulose Chất carboxymethyl cellulose DNS 3,5-dinitrosalicylic acid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Chất 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl DSM Difco Sporulation Medium Môi trường SM EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid xít ethylendiamin tetraacetic EtOH Ethanol C n etanol FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông lư ng Hb Hemoglobin Huyết s c tố HCT Hematocrit HDL High Density Lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng cao HPLC High Performance Liquid Chromatography S c ký lỏng hiệu n ng cao I Intermediate Trung gian IBS Irritable Bowel Syndrome H i chứng ru t kích thích IL Interleukin Interleukin LDL Low Density Lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp MHA Muller Hilton Agar Th ch Muller Hilton MIC Minimal Inhibitory Concentration N ng đ ức chế tối thiểu N xít 3,5-dinitrosalicylic ung tích h ng cầu v Ch vi t t t Ti ng nh Ti ng Việt NA Nutrient Agar Th ch dinh dưỡng Na CMC Sodium Carboxy Methyl Cellulose Natri carboxy methyl cellulose NAFLD Nonalcoholic Fatty Liver Disease ệnh mỡ gan không rượu NB Nutrient Both Môi trường dinh dưỡng NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm quốc gia liệu sinh học NK Natural Killer Tế bào killer NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ c ng hưởng từ h t nhân OD Optical Density Đ hấp thu PCI Phenol Chloroform Isoamin Alcohol Hợp chất phenol chloroform isoamin alcohol PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PDA Photodiode Array Detector Đầu dò P PVP Polyvinylpyrrolidone Chất Polyvinylpyrrolidone R Resistant Kháng rADN Ribosom Acid Desoxynucleic Ribosom acid desoxynucleic RBC Red Blood Cell H ng cầu RSM Response Surface Methodology Phư ng pháp đáp ứng bề mặt S Susceptible Nh y SD Standard Deviation Đ lệch chuẩn SDS Sodium Dodecyl Sulphat Natri dodecyl sulphat SGOT Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase Men SGOT SGPT Serum Glutamic Pyruvic Transaminase Men SGPT TCA Tricloacetic acid TSA Trypticase Soy Agar Th ch TS TSB Trypticase Soy Broth Th ch TS UV-Vis Ultra violet – Visible Tử ngo i – khả kiến WBC White Blood Cell xít Tricloacetic ch cầu vi Danh mục bảng ảng 1.1 Chế phẩm chứa carotenoid lưu hành t i VN 14 ảng 1.2 Các vi sinh vật sinh carotenoid carotenoid đặc trưng 17 ảng 2.1 C chất cảm ứng cách đọc kết thử nghiệm khả n ng sinh enzym 34 ảng 2.2 Pha dung môi khảo sát tính tuyến tính 37 ảng 2.3 Môi trường từ d ch chiết tự nhiên 38 ảng 2.4 Tỉ lệ nguyên liệu d ch chiết 39 ảng 2.5 Đ n v mã hóa theo CC 40 ảng 2.6 ấu hiệu sức khỏe chu t 43 ảng 2.7 Lô chu t thử nghiệm 46 ảng 2.8 ố trí thí nghiệm 46 ảng 3.1 Kết phân lập vi sinh vật từ n i lấy mẫu 49 ảng 3.2 Các chủng có khả n ng t o bào tử màu s c môi trường SM 50 ảng 3.3 Ho t tính chống oxy hóa mẫu đối chứng 51 ảng 3.4 Ho t tính b t giữ gốc tự PPH mẫu 52 ảng 3.5 Đỉnh hấp thu m t số carotenoid đối chứng cloroform 53 ảng 3.6 Đỉnh hấp thu mẫu thử 53 ảng 3.7 Kết đ nh danh 54 ảng 3.8 Khả n ng sinh enzym chủng vi khuẩn phân lập 55 ảng 3.9 Số lượng phần tr m bào tử vi khuẩn sống sót mơi trường acid 57 ảng 3.10 Số lượng phần tr m bào tử vi khuẩn sống sót muối mật 59 ảng 3.11 MIC chủng chuẩn v i kháng sinh 61 Bảng 3.12 Thống kê số lo i kháng sinh b đề kháng chủng khảo sát 62 ảng 3.13 Điều kiện phát triển thích hợp chủng 64 ảng 3.14 Thời gian hệ đặc tính phát triển chủng 64 ảng 3.15 Kết khảo sát tính tuyến tính 65 ảng 3.16 Kết đ lặp l i phư ng pháp 66 ảng 3.17 Đỉnh s c ký đ d ch chiết carotenoid chủng Bacillus 68 ảng 3.18 Thời gian carotenoid đ t cao chủng khảo sát 70 ảng 3.19 Hàm lượng carotenoid môi trường thay chủng Bacillus 70 ảng 3.20 Ảnh hưởng hàm lượng nguyên liệu d ch chiết 74 vii ảng 3.21 Kết khảo sát khả n ng t o bào tử lo i môi trường lỏng 75 ảng 3.22 Kết khảo sát khả n ng t o bào tử lo i môi trường r n 76 ảng 3.23 Ảnh hưởng khoáng đến sinh khối, hàm lượng carotenoid 77 ảng 3.24 Hệ số tư ng quan R2 mô hình mơi trường lỏng r n 79 ảng 3.25 Giá tr p mơ hình môi trường lỏng r n 79 ảng 3.26 Phư ng trình đáp ứng mơ hình mơi trường lỏng r n 79 ảng 3.27 N ng đ khoáng cho lượng bào tử tối ưu carotenoid theo dự đoán 80 ảng 3.28 Kết khảo sát tỷ lệ truyền chủng T14 81 ảng 3.29 Kết khảo sát tốc đ khuấy T14 82 ảng 3.30 Kết khảo sát lưu lượng oxy T14 83 ảng 3.31 Kết khảo sát lượng chủng đầu vào ảng 3.32 ảng kết khảo sát tốc đ khuấy ảng 3.33 Kết khảo sát pO2 1.1 84 1.1 84 1.1 85 ảng 3.34 Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử T14 ĐK15K mẻ L 95 ảng 3.35 Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử 1.1 Đ5K mẻ L 95 ảng 3.36 Giá thành môi trường thay r n so v i th ch SM 97 ảng 3.37 Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử T14 môi trường lỏng 97 ảng 3.38 Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử 1.1 môi trường lỏng 97 ảng 3.39 Giá thành môi trường thay lỏng so v i môi trường SM 98 ảng 3.40 Chi phí cho mẻ giá 109 bào tử/liều vi khuẩn sinh carotenoid 98 ảng 3.41 Kiểm tra đ lặp l i phư ng pháp đếm 103 ảng 3.42 Khảo sát đ ổn đ nh nguyên liệu chứa bào tử T14 1.1 104 ảng 3.43 Cân nặng c thể chu t liều thử nghiệm cao 105 ảng 3.44 Thể trọng chu t dùng theo thời gian thử nghiệm 106 ảng 3.45 Cân nặng c quan lô sau 60 ngày thử nghiệm 108 ảng 3.46 Các thông số huyết học chu t sau 60 ngày thử nghiệm 109 ảng 3.47 Thông số b ch cầu chu t sau 60 ngày thử nghiệm 109 ảng 3.48 Thông số tiểu cầu chu t sau 60 ngày thử nghiệm 109 ảng 3.49 Các số sinh hóa máu chu t sau 60 ngày thử nghiệm 110 ảng 3.50 Hàm lượng carotenoid gan chu t sau tháng thử nghiệm 111 ảng 3.51 Tỷ lệ chu t chết sau bốn ngày thử nghiệm 111 ảng 3.52 Tỷ lệ chu t khỏi tiêu chảy sau bốn ngày thử nghiệm 112 viii ảng 3.53 T ng cân trung bình lơ chu t sử dụng liều từ 106 bào tử trở lên 114 ảng 3.54 T ng cân trung bình lơ chu t sử dụng liều 2x105 bào tử 114 ảng 3.55 Đánh giá cảm quan sữa chua bổ sung bào tử B marisflavi DD1.1 116 ảng 3.56 Đánh giá cảm quan sữa chua bổ sung bào tử B infantis AT14 116 ảng 3.57 Đ ổn đ nh bào tử vi khuẩn sinh carotenoid sữa chua 117 ảng 3.58 Đ ổn đ nh chế phẩm cốm 118 ảng 3.59 Kết theo dõi mật đ bào tử 12 tháng đối v i hỗn d ch 119 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-52 Phụ lục 12 Phư ng pháp thử Tiêu chuẩn c sở bột nguyên liệu bào tử Bacillus marisflavi DD1.1 PH NG PH P THỬ Hình thức Thử cảm quan, nguyên liệu phải đ t yêu cầu nêu Thử khả n ng phân tán: Cân xác khoảng 1,0 g nguyên liệu phân tán vào 100 ml nư c cất vô trùng, l c 15 ph t, quan sát hỗn d ch t o thành (Hỗn d ch ) Hỗn d ch phải có màu vàng nh t Tiến hành đo pH hỗn d ch Hỗn d ch chia thành nhiều phần làm mẫu thử cho thử nghiệm Đ nh tính vi sinh vật 2.1 Môi trường, thuốc thử - Môi trường th ch Trypticase soy agar (TS ); - Môi trường th ch TS bổ sung gelatin n ng đ 1% (kl/tt); - Mơi trường TS bổ sung khống g m 10 ml KCl 10%, 10 ml MgSO 4.7H2O 1,2%, ml Ca(NO3)2 1M, ml MnCl2 10mM, ml FeSO4 1mM lít mơi trường - ung d ch cid tricloacetic (TCA) 50% (kl/tt) 2.2 Cách thực 2.2.1 Thử nghiệm xác đ nh có mặt bào tử Sử dụng hỗn d ch làm tiêu soi tư i dư i kính hiển vi quang học (đ phóng đ i 400 lần), mẫu phải có bào tử hình oval chiết quang Sử dụng hỗn d ch làm tiêu bản, nhu m Gram quan sát dư i kính hiển vi quang học (đ phóng đ i 1000 lần), mẫu phải có bào tử hình oval b t màu h ng nh t 2.2.2 Thử nghiệm xác đ nh enzym ngo i bào vi khuẩn Bacillus marisflavi DD1.1 Sử dụng que t m vô trùng chấm hỗn d ch lên đĩa th ch TS có bổ sung gelatin n ng đ 1% (kl/tt), ủ 36 ± 2oC 24 giờ, sau thực thử nghiệm sau: Xác đ nh ho t tính protease ngo i bào: Nhỏ dung d ch TC 50% tráng kh p bề mặt th ch TS có gelatin, kết dư ng tính có vịng thủy giải gelatin xung quanh khóm 2.2.3 Nhận d ng nhu m soi Sử dụng hỗn d ch , lấy vòng dây cấy cấy ria lên đĩa th ch TS , TS khoáng ủ 36 ± 2oC 24 giờ, sau thực thử nghiệm sau: Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn có bổ sung Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-53 (1) Quan sát khóm vi khuẩn: Khóm có màu vàng, kích thư c thay đổi 1,5-3 mm, rìa khóm có r ng cưa, mặt khóm t, tâm nhô (2) Nhu m Gram quan sát dư i kính hiển vi quang học: Trực khuẩn Gram dư ng, 0,5x1,7-2,4 m, xếp riêng lẻ thành chuỗi Trên mơi trường TS bổ sung khống sau 72 tế bào sinh dưỡng chứa bào tử bên v trí Đơi có bào tử ngồi hình oval b t màu h ng nh t Đ nh tính carotenoid 3.1 Hóa chất NaOH 1N Cloroform Methanol H2SO4 3.2 Chiết carotenoid từ sinh khối vi khuẩn - Cân xác g sinh khối khơ vào ống Falcon dung tích 15 ml - Thêm 10 ml NaOH 1N vào sinh khối L c rung để phân tán sinh khối Tán bể siêu âm nhiệt đ phòng 10 ph t - Ly tâm 9600 vòng /10 ph t 4oC để lo i bỏ NaOH, thu tế bào - Chiết carotenoid v i 15 ml cloroform:methanol (2:1 tt/tt) L c nhiệt đ phòng 20 ph t Thêm đ ng lượng nư c khử khoáng, l c rung cho - Ly tâm 9600 vòng 20 ph t nhiệt đ 4oC, h t l p dư i có màu (cloroform + methanol) - Tiến hành chiết l i v i cloroform methanol sinh khối tế bào không màu - Thu tất d ch chiết bay h i đến c n 3.3 Cách phát Thêm vài giọt H2SO4 đậm đặc vào c n ung d ch ngả sang màu xanh đến xanh dư ng: có carotenoid Đ nh danh vi khuẩn Tiến hành đ nh danh vi khuẩn phản ứng sinh hóa giải trình tự 16S r N 4.1 Đ nh danh vi khuẩn đặc điểm sinh hóa Sử dụng hỗn d ch , lấy vòng dây cấy cấy ria lên đĩa th ch TS ủ 36 ± oC 18 giờ, sử dụng khuẩn l c đ n để xác đ nh đặc điểm sinh hóa Đặc điểm sinh hóa chủng Bacillus marisflavi DD1.1 trình bày bảng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-54 ảng Đặc điểm sinh hóa chủng Bacillus marisflavi DD1.1 Thử nghiệm Bacillus marisflavi DD1.1 Nhu m Gram + ng chuỗi + Di đ ng + Chiều dài > µm - V trí hình d ng bào tử giữa, hình oval Tế bào chứa bào tử ph ng lên - Sinh trưởng 50oC - Sinh trưởng dung d ch NaCl 10% - ONPG + ADH + LDC + ODC + CIT - H2S - Urease + IND - VP + Thủy phân gelatin + Thủy phân tinh b t - Glucose + yếu Mannitol + Inositol - Sorbitol - Rhamnose + yếu Saccarose + Melibiose - Amydaglin + yếu Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-55 + yếu Aarabinose 4.2 Đ nh danh vi khuẩn giải trình tự 16S r Chiết tách ADN vi hu N : Mơi trườ g hóa chất: Mơi trường TS Môi trường TS Đệm ly giải Bacillus: 50mM EDTA, 0,1M NaCl, pH 7,5 Lysozym 20 μg/ml Phenol/chloroform/iso-amyl alcohol: 25/24/1 N-laurylsarcosin 20% RNAse 10mg/ml Natri acetat 3M, pH 4,8 Ethanol tuyệt đối l nh Ethanol 70% (tt/tt) TE0,1 Cách tiế hà h - Cấy ria Bacillus marisflavi DD1.1 lên môi trường TS , ủ 37oC 24 - Lấy khuẩn l c đ n cấy vào ml môi trường TS , ủ qua đêm 37oC - H t 1,5 ml d ch vi khuẩn cho vào eppendorf 1,5 ml Ly tâm 8000 rpm 10 ph t, g n bỏ phần nư c Hòa cặn tế bào vào 400 μl dung d ch đệm ly giải Bacillus - Thêm 50 μl (20 mg/ml) lysozym, vortex nhanh, ủ 37 oC 10 ph t - Thêm μl N-laurylsarcosin 20%, lật tube p ngửa nhẹ nhàng nhiều lần Ủ 37 oC ph t - Thêm 300 μl PCI (phenol:chloroform:isoamin alcohol), vortex 30 giây - Ly tâm 8000 rpm 10 ph t - H t phần nư c sang eppendorf 1,5 ml m i, bổ sung thêm 1/10 thể tích natri acetat 3M (pH= 4,8) khoảng 50 μl - Thêm ml etanol tuyệt đối l nh, lật tube p ngửa 10 lần, N tủa etanol - Ly tâm 8000 rpm ph t, g n bỏ phần nư c - Rửa v i etanol 70% Ly tâm 8000 rpm ph t, g n bỏ phần nư c nổi, để khơ ngồi khơng khí - Thêm 100 μl TE0,1, vortex, ủ 65 oC để N tan hết Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM - ảo quản PL-56 N oC thời gian ng n -20 oC thời gian dài Khuếch đại ti h trì h tự 16S rADN: óa chất: - N nhiễm s c thể B marisflavi DD1.1 ung d ch đệm PCR 10X (KCl 500 mM, Tris-Cl 100 mM pH 8,8, DTT 30 mM, BSA 1mg/ml) - dNTP 10 mM - MgCl2 25 mM - M i xuôi (P1) 100 mM (5’-GCGGCGTGCCTAATACATGC-3’) - M i ngược (P2) 100 mM (5’-CACCTTCCGATACGGCTACC-3’) - Taq ADN polymerase - Nư c khử ion tiệt trùng - Eppendorf 0,2 ml có thành mỏng ch u nhiệt Ti n hành - Thành phần phản ứng PCR sau: µl N Bacillus marisflavi DD1.1, 5μl đệm PCR 10 X, μl dNTP 10mM, 0,5 μl m i xuôi P1 0,5 μl m i ngược P2, 0,2 μl Taq N polymerase U/ μl nư c khử khống vừa đủ 50µl - Chu trình phản ứng chu kỳ: 95oC ph t; 30 chu kỳ: 95oC ph t, 54 oC 45 giây, 72oC ph t cuối chu kỳ 72oC ph t Sản phẩm PCR có kích thư c khoảng 1473 bp - Sản phẩm 16S r N đánh giá điện di gel agarose 1% - Sản phẩm PCR sau tinh s ch sản phẩm PCR, theo hư ng dẫn nhà sản xuất iải h tích trì h tự: Giải trình tự gen 16S r N Bacillus marisflavi 1.1 theo phư ng pháp Sanger Kết quả: trình tự 16S r N Bacillus marisflavi 1.1 sau: CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAA CCGGGGCTAATACCGGATAACACCTACCCCCGCATGGGGGAAGGTTGAAAGGTGGCTTCGG CTATCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAG GCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-57 CGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTG CCGTTCGAATAGGGCGGCGCCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCG CGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAgCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGA AACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAAaTGCG TAGAGATGTGGAGGgAACTCCAGTGGCGAAGCGACTTTtCTGGTCTATAACTGACGTTGAG GCGGGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGGATACCCTGGTAGTCCCGCCATCAACGATG AGTAATAAGTGTTAGAGGGTTCCACCTCTAGGCAACAGCAAACGCATTAAGCACTGCGCCT GGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTAGA GCATTGGTTTAATTAGAAGCAAAGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGAAATCTCCTGCAACC CTAGAGATGAGGCTTTCCCCTTCGGGGGACAGGATGACAGGTAGTGCATGGTTGTCGTCAG TTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCACCGAGCGCACCCCTAGATCTTAGTAGCC AGCAATAAGTTGGGCACTATAAGGGGACTGCGGGTGCCAAACCGGAGGAAGGTGGGGAGGA CGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAA GGGCGGCAAGACCGCGAGGTTAAGCGAATCCAATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGCAGG CTGCAACTCGCCTCCATGAAGCGGGAGGCGGTAGTAATTCCGGAGCACCTGCCGCGGGGAG AGGGTCCCCGGCCTTTCCCCCCCTCCGCCCCCCCCCTCTTTTGTACCCCCGATTCGTCAC Mất khối lượng làm khô Không 6% Thử theo ĐVN IV, phụ lục 9.6, phư ng pháp (d) sử dụng tủ sấy Sấy 1,0 g mẫu nguyên liệu áp suất ≤ mm Hg, nhiệt đ 110 C Hàm lượng bào tử 6.1 Nguyên t c Nguyên liệu bào tử Bacillus marisflavi xử lý đảm bảo đ khiết Các bào tử có khả n ng ch u nhiệt đ cao thay đổi đ t ng t áp suất thẩm thấu Trư c tiến hành xác đ nh mật đ bào tử, mẫu thử cần xử lý nhiệt để tiêu diệt tế bào sinh dưõng Thử theo ĐVN IV chuyên luận iosubtyl 6.2 Môi trường Môi trường th ch TS 6.3 Cách thử nghiệm Chuẩn b mẫu Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PL-58 Cân 10 g b t nguyên liệu cho vào bình tam giác chứa sẵn 90 ml NaCl 0,85% vô khuẩn, l c v i bi thủy tinh (ta có đ pha 10-1) Đặt hỗn d ch bể ổn nhiệt 65oC 30 ph t Pha loãng bậc 10 NaCl 0,85% để có đ pha lỗng 10-2 đến 10-9 Lấy xác 0,2 ml dung d ch có n ng đ từ 10-6 đến 10-9 cho vào đĩa th ch chuẩn b trư c, n ng đ đĩa, trải ủ 37oC 24 Sau 24 giờ, đếm số khuẩn l c chủng vi khuẩn mọc đĩa th ch (từ đ pha loãng cao đến đ pha loãng thấp nhất) Tính giá tr trung bình X đ pha Tí h độ số g Đ sống = X x Số lần pha loãng x Tiêu chu chấp thuậ : Nguyên liệu đ t yêu cầu hàm lượng bào tử 1,0 g nguyên liệu có ≥ 1010 bào tử vi khuẩn Bacillus marisflavi DD1.1 Gi i h n nhiễm khuẩn Thử gi i h n nhiễm khuẩn theo ĐVN IV, phụ lục 13.6 7.1 Lấy mẫu Sử dụng 10 g nguyên liệu 7.2.Cách thử nghiệm M t mẫu chế phẩm cần xác đ nh gi i h n vi khuẩn phải thực đầy đủ thử nghiệm sau: Thử nghiệm tìm vi khuẩn gây bệnh sau: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Escherichia coli; c lượng số Enterobacteria đếm tổng số nấm men nấm mốc quy g nguyên liệu Nguyên liệu phải đ t yêu cầu nêu Tính an tồn Thử theo ĐVN IV, chun luận iosubtyl Cân xác 5,0 g b t nguyên liệu, thêm dung d ch NaCl 0,85% vừa đủ 10 ml, l c đến phân tán hoàn toàn Chọn mười chu t nh t tr ng Swiss trọng lượng 20 g ± g (5 mẫu chứng mẫu thử), đánh dấu ghi trọng lượng Po ùng b m tiêm kim cong chuyên dụng đưa hỗn d ch bào tử vào d dày chu t v i liều 0,5 g/ ml/con Chu t chứng cho uống dung d ch NaCl 0,85% vô khuẩn v i liều ml/con Theo dõi cân trọng lượng chu t hàng ngày ngày Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-59 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tiêu chu chấp hậ : Nguyên liệu đ t yêu cầu chu t t ng cân bình thường khơng có triệu chứng bất thường ảng tóm t t tiêu chuẩn nguyên liệu Thử nghiệm Tiêu chuẩn Hình thức t màu vàng nh t, dễ phân tán TCCS nư c Đ nh tính vi sinh vật Phải chứa bào tử Bacillus marisflavi TCCS DD1.1 Đ nh tính carotenoid Có carotenoid TCCS Đ nh danh vi sinh vật Là Bacillus marisflavi DD1.1 TCCS Mất khối lượng làm khô Không 6% ĐVN Công hiệu Phải chứa 1010 bào tử/ g nguyên liệu ĐVN Gi i h n nhiễm khuẩn Mẫu nguyên liệu Salmonella, Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Mật đ nấm men nấm mốc < 100 CFU/g Mật đ Enterobacteria