Nghiên cứu tổng hợp ataluren có tác dụng điều trị loạn dưỡng cơ duchenne

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Hà Xuân Anh “NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ATALUREN CÓ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE” LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC HỮU CƠ Hà Nội 2020 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Hà Xuân Anh “NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ATALUREN CÓ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE” Chuyên ngành: Hóa Học Hữu Cơ Mã số:8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC HỮU CƠ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Trịnh Thị Thủy Hà Nội 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi Hà Xuân Anh, Học viên cao học Học viện Khoa học Công nghệ, chun ngành Hóa hữu cơ, tơi xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Trịnh Thị Thủy Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2020 Tác giả HÀ XUÂN ANH LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Thị Thủy TS Trần Đức Quân, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa Học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn suốt trình học tập thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, thầy cô giáo Học viện Khoa học Công nghệ nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Luận văn tiến hành hỗ trợ đề tài: “Nghiên cứu qui trình tổng hợp ataluren làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị loạn dưỡng Duchenne Becker”, TS Trần Đức Quân, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam làm chủ nhiệm Cuối xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè, người thân đồng nghiệp - người bên tôi, ln động viên, khích lệ chỗ dựa vững cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Trân trọng cảm ơn! DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ký hiệu 13 C-NMR H-NMR HPLC LC-MS HRMS Tiếng Anh Tiếng Việt Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance carbon (13) Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance proton (1) High Performance Liquid Chromatography Liquid chromatography-mass spectrometry High Resolution Mass Spectrometry Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng khối phổ Khối Phổ Phân Giải Cao δ Chemical shift Độ chuyển dịch hóa học ppm Part per million Một phần triệu DMD Duchenne Muscular Dystrophy Loạn dưỡng Duchenne TEA t-BuOK SKBM DANH MỤC BẢN triethylamine Kali tert-butoxide Sắc ký mỏng Bảng 1.1: Các dẫn xuất oxadiazole tác giả Mazahar Farooqui 12 Bảng 2.1: Danh sách dụng cụ 23 Bảng 2.2: Danh mục hóa chất 24 Bảng 3.1: Khảo sát ảnh hưởng chất tham gia phản ứng đến hiệu suất thu hồi sản phẩm phản ứng 35 Bảng 3.2: Ảnh hưởng tác nhân tỷ lệ tác nhân đến hiệu suất phản ứng 36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1:Các đồng phân oxadiazole Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp 1,2,4-oxadiazole theo tài liệu số [18, 19] 10 Hình 1.3: Sơ đồ tổng hợp oxadiazoletheoGui-Bai Liang Danqing D Feng 11 Hình 1.4: Sơ đồ tổng hợp số dẫn xuất oxadiazole tác giả Mazahar Farooqui 11 Hình 1.5: Sơ đồ tổng hợp oxadiazole tác giả S Borg 13 Hình 1.6: Một số hợp chất dùng trong vật liệu polyme phát quang 14 Hình 1.7: Một số dẫn xuất oxadiazolecủa tác giả Leslie J Street 14 Hình 1.8: Hợp chất ADAM tác giả Takeshi Sakamoto 15 Hình 1.9: Cơng thức cấu tạo ataluren 16 Hình 1.10: Sơ đồ tổng hợp ataluren theo Laura Lentini 18 Hình 1.11: Sơ đồ tổng hợp theo Hasan A Swarup 19 Hình 1.12: Sơ đồ tổng hợp ataluren tác giả Tsung - Yu Hsiao 20 Hình 1.13: Sơ đồ tổng hợp ataluren tác giả người TQ .21 Hình 1.14: Sơ đồ tổng hợp ataluren theo Puneet K Gupta 21 Hình 1.15: Sơ đồ tổng hợp theo Thomas L Andersen 22 Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp ataluren 25 Hình 2.2: Sơ đồ tổng hợp 2-fluorobenzoyl chloride 25 Hình 2.3: Sơ đồ tổng hợp methyl 3-cyanobenzoate .27 Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp methyl-3-(N-hydroxycarbamimi doyl)-benzoate 27 Hình 2.5: Sơ đồ tổng hợp methyl-3-(5-(2-fluorophenyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl)benzoate 28 Hình 3.1: Sơ đồ tổng hợp 2-fluorobenzoyl chloride 32 Hình 3.2: Sơ đồ tổng hợp methyl 3-cyanobenzoate .32 Hình 3.3: Sơ đồ tổng hợp methyl-3-(N-hydroxycarbamimidoyl)-benzoate (6) .33 Hình 3.5: Sơ đồ tổng hợp ataluren 35 MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu bệnh loạn dưỡng Duchenne 1.1.1 Quá trình phát bệnh 1.1.2 Dấu hiệu bệnh Duchenne 1.1.3 Phương pháp điều trị .7 1.2 Giới thiệu oxadiazole 1.2.1 Phương pháp tổng hợp dẫn xuất oxadiazole 10 1.2.2 Hoạt tính sinh học oxadiazole .13 1.3 Giới thiệu ataluren .15 1.3.1 Cơng thức hóa học Ataluren 16 1.3.2 Tác dụng dược lý 16 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 23 2.1 Nguyên vật liệu .23 2.1.1 Dụng cụ .23 2.1.2 Hóa chất .24 2.2 Tổng hợp ataluren 25 2.2.1 Tổng hợp 2-fluorobenzoyl chloride .25 2.2.2 Tổng hợp methyl 3-cyanobenzoate 27 2.2.3 Tổng hợp methyl-3-(N-hydroxycarbamimi doyl)-benzoate 27 2.2.4 Tổng hợp Methyl-3-(5-(2-fluorophenyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl)-benzoate 28 2.2.5 Tổng hợp Ataluren .30 2.2.6 Quy trình tinh chế ataluren 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Tổng hợp 2-fluorobenzoyl chloride 32 3.2 Tổng hợpmethyl 3-cyanobenzoate 32 3.3 Tổng hợp methyl-3-(N-hydroxycarbamimi doyl)-benzoate 33 3.4 Tổng hợp methyl-3-[5-(2-fluorophenyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]-benzoate .34 3.5 Tổng hợp 3-[5-(2-fluorophenyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]benzoic acid (ataluren).35 3.6 Tinh chế ataluren phịng thí nghiệm 37 4.1 Kết luận 38 4.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .39 MỞ ĐẦU Loạn dưỡng thuật ngữ nhóm bệnh có tính chất di truyền, đặc trưng yếu tiến triển teo cơ, bao gồm loạn dưỡng Duchenne, loạn dưỡng Becker, loạn dưỡng vùng gốc chi (đai vai, đai hông), loạn dưỡng mặt, vai, cánh tay, loạn dưỡng tăng trương lực Bệnh loạn dưỡng Duchenne bệnh lý thần kinh di truyền thường gặp nhất, phát tất chủng tộc khác giới Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai Duchenne người mô tả chi tiết bệnh vào năm 1986[1] Đây bệnh lý nặng, mang tính chất tuần tiến, nặng dần theo thời gian Hầu hết trẻ trai mắc bệnh có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng suy yếu cơ, biểu khó lại, khó đứng lên ngồi xuống khó khăn leo cầu thang Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, khả lại vào lứa tuổi 12 thường tử vong 20 tuổi tổn thương tim rối loạn hô hấp [2, 3] DMD/BMD bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên đột biến gen dystrophin Gen dystrophin nằm vị trí Xp21 nhiễm sắc thể X, có chiều dài 3000 kb, gồm 79 exon với promotor khác gen người lớn phát Gen dystrophin mã hoá 14 kb mRNA tổng hợp sản phẩm tương ứng protein dystrophin Protein có mặt màng tế bào có chức việc trì ổn định màng, bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thương trình co [4, 5] Hiện chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Với phát triển ngành sinh học phân tử năm gần đây, liệu pháp điều trị gen bệnh nhân DMD đem lại hy vọng to lớn cho người bệnh Tuy nhiên với dạng đột biến gen dystrophin khác có liệu pháp điều trị gen khác 4 Ataluren, trước gọi PTC124, Là loại dược phẩm để điều trị chứng loạn dưỡng Duchenne Các nghiên cứu chứng minh điều trị ataluren làm tăng biểu protein dystrophin có chiều dài đầy đủ tế bào chuột chuột có chứa đột biến codon dừng sớm chứng loạn dưỡng Duchenne giải cứu chức vân [6] Các nghiên cứu chuột bị đột biến codon dừng sớm bệnh xơ nang chứng minh chức sản xuất protein CFTR tăng lên [7] Mở rộng công việc này, nghiên cứu học với tế bào nấm men tế bào người làm sáng tỏ chi tiết cặp sở codon-anticodon không qua trung gian ataluren dẫn đến thay acid amin cụ thể vị trí codon cụ thể protein CFTR [8] Hiện nay, nhà khoa học giới nỗ lực nghiên cứu để tìm loại thuốc có khả chữa trị bệnh này, vậy, kết thu cịn hạn hẹp Các loại thuốc tìm đại đa phần dừng bước trì kéo dài tuổi thọ lực vận động nhằm cải thiện điều kiện sống người bệnh gia đình giảm tải gánh nặng xã hội Translarna với hoạt chất ataluren loại thuốc đó, nhiên chi phí điều trị cao: 220.000 Euro/ năm/bệnh nhân Xuất phát từ lý trên, Chúng thực đề tài “Nghiên cứu tổng hợp ataluren có tác dụng điều trị loạn dưỡng Duchenne” để phục vụ nhu cầu chữa trị, cải thiện điều kiện sống cho thân người bệnh gia đình người bệnh Do vậy, việc tiến hành nghiên cứu tổng hợp ataluren làm nguyên liệu để tự sản xuất thuốc nước để phục vụ điều trị cho bệnh nhân BMD DMD hồn tồn thiết thực, bao hàm ý nghĩa kinh tế nhân văn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu bệnh loạn dưỡng Duchenne 1.1.1 Quá trình phát bệnh Loạn dưỡng Duchenne (DMD) phát lần vào năm 1851 BS Meryon (người Anh) Mười năm sau, Duchenne (một nhà thần kinh học người Pháp) phát thấy thay mô mô xơ mô liên kết tiêu sinh thiết bệnh nhân DMD Ơng đề tiêu chí chung dùng để chẩn đoán bệnh loạn dưỡng dựa kết giải phẫu bệnh kích thích điện cơ, tên Ông dùng để đặt tên cho bệnh Năm 1879, Gower nhận thấy biểu yếu ghi nhận trẻ nam bệnh di truyền thơng qua người mẹ Ơng ghi nhận trẻ bệnh có đặc điểm giống thay đổi tư từ nằm sang ngồi hay từ ngồi sang đứng dấu hiệu đặt tên dấu hiệu Gower, đặc trưng cho bệnh loạn dưỡng Duchenne [9] Năm 1981, Zatz M CS quan sát trẻ gái mắc bệnh phát gen dystrophin nằm vị trí Xp21 nhiễm sắc thể (NST) X, trẻ gái mang chuyển đoạn NST X NST thường [10] Đến năm 1993 người ta phát đầy đủ thành phần cấu trúc gen dystrophin gồm 79 exon với promoter khác nhau, mã hóa cho 14kb mRNA, 99% intron Ngày nay, phát triển khoa học kỹ thuật chế phân tử bệnh ngày hiểu rõ giúp hoàn thiện thêm kỹ thuật chẩn đoán bệnh, tư vấn di truyền, kiểm soát trước sinh, bước đầu ứng dụng liệu pháp gen điều trị bệnh DMD, nhằm nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân làm giảm gánh nặng cho gia đình xã hội 1.1.2 Dấu hiệu bệnh Duchenne 6 Bệnh DMD phát tất chủng tộc khác giới, thường gặp trẻ trai (rất gặp em gái) với tần suất lên tới 1/3500 ca sinh Ở độ tuổi từ đến tuổi hầu hết trẻ trai bị mắc bệnh gặp phải khó khăn vận động, từ 12-14 tuổi chúng thường bị khả lại, trở nên tàn phế thường tử vong độ tuổi từ 20 đến 30 tuổi, nguyên nhân tổn thương tim rối loạn chức hô hấp Bệnh xuất sớm, diễn biến từ từ, thường qua ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Bệnh xuất tự nhiên, từ 2-3 tuổi, có bệnh nhân từ 4-5 tuổi với triệu chứng giảm vận động, chậm biết đi, hay mỏi, dễ ngã, cầm nắm đồ vật hay bị rơi [11] Giai đoạn 2: Bệnh biểu với đầy đủ triệu chứng sau: – Triệu chứng giảm vận động rõ: lại khó khăn, đứng lên ngồi xuống khó khăn, nằm ngồi dậy khó khăn (dấu hiệu Gower+) + Dấu hiệu Gower: Khi người bệnh ngồi xổm phải đứng lên nằm phải ngồi dậy người bệnh phải quay người sang bên, gấp đầu gối vào mông, hai tay chống nạng đỡ lấy thân để giữ tư quỳ bắn, sau đó, cách tì hai tay lên cẳng chân, đầu gối đùi, người bệnh đẩy cho thân thẳng dậy, dáng Trendelenberg hay hông lắc lư Sự tiếp nối động tác xem đặc hiệu cho bệnh loạn dưỡng tuần tiến - Teo nhiều nơi, đối xứng: vai, Delta, cánh tay ngực, thắt lưng, mông, đùi… - Giả phì đại bắp chân gặp 100% bệnh nhân, cẳng tay gặp Cuối giai đoạn thường có tượng co gân gót, gân khác làm bệnh nhân thay đổi dáng đứng, dáng đi, ngực ưỡn trước, mông cong sau, đứng chân thường phải nhón gót Giai đoạn 3: Đây giai đoạn cuối bệnh - Mất hẳn khả vận động, ngồi chỗ - Teo toàn thân, teo mặt làm mặt trẻ biến dạng Hai bắp chân teo nhỏ Bệnh nhân lại da bọc xương - Tổn thương chức hơ hấp, tổn thương tim Sa sút trí tuệ gặp tất bệnh nhân có 20 đến 30% bệnh nhân có số IQ 70 Tỷ lệ động kinh thường cao so với quần thể chung Các biến đổi thối hóa, xơ hóa q trình khơng gây đau Bệnh nhân thường khơng có đau chuột rút, có vơi hóa Trẻ mắc bệnh DMD thường tử vong vào khoảng 20 tuổi Nguyên nhân tử vong suy hô hấp ngủ, suy tim xung huyết, viêm phổi sặc tắt nghẽn đường thở [12, 13] 1.1.3 Phương pháp điều trị Trong suốt thời gian dài (từ 1851 đến 1986), bệnh loạn dưỡng chủ yếu đánh giá mức độ lâm sàng hướng điều trị chủ yếu nhằm tập trung vào việc chăm sóc, hỗ trợ cải thiện điều kiện sống người bệnh Các phương pháp điều trị nay:  Điều trị thuốc: Quá trình nghiên cứu tìm loại thuốc nhằm điều trị dứt điểm chứng bệnh DMD thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới Tuy nhiên, nói rằng, chưa có loại thuốc đặc hiệu chữa khỏi cho nhóm bệnh nhân Các dịng thuốc sử dụng như: corticoid đơn độc hay phối hợp với azathioprin, chẹn kênh calci, thuốc tạo cơ; số thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị triệu chứng khác Coenzyme Q10, Leucine, Creatine nhiên chúng giúp làm chậm tiến trình phát triển bệnh Ngồi chúng cịn gây tác dụng phụ không mong muốn người bệnh bệnh loãng xương; suy giảm miễn dịch sử dụng kéo dài  Điều trị liệu pháp gen: Trên thực tế, gần tất bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne bị tàn phế chết suy hô hấp, tổn thương tim nhiễm trùng bội phụ lứa tuổi thiếu niên trước 20 tuổi Rõ ràng với phác đồ điều trị thuốc, việc điều trị bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne dừng lại điều trị triệu chứng, làm chậm diễn biến bệnh, hoàn toàn chưa tác động tới sai hỏng mức độ gen - chất gây bệnh DMD Do đó, liệu pháp điều trị gen với khả can thiệp tận gốc đột biến gen dystrophin nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu, phương pháp gen cung cấp gen mã hóa dystrophin tới sợi cải tạo gen mã hóa dystrophin bất thường Đây biện pháp mới, hy vọng tương lai đem tới hiệu tốt  Điều trị liệu pháp tế bào: Liệu pháp chuyển ghép nguyên bào cơ: Các nguyên bào nuôi cấy tiêm vào loạn dưỡng bệnh nhân, tế bào thay tế bào bệnh lý nhờ chức tái lập Trước thực liệu pháp, bệnh nhân phải điều trị thuốc ức chế miễn dịch để ngăn cản phản ứng thải ghép [14] Liệu pháp tế bào gốc: Có nhiều hứa hẹn tương lai nghiên cứu thực nghiệm cho thấy lấy tế bào gốc tủy xương từ người bình thường cấy ghép vào người bệnh tạo protein dystrophin lượng nhỏ sợi người bệnh [15, 16] 9 Tuy nhiên biện pháp áp dụng lâm sàng có hiệu cịn chưa cao, không ổn định cần nghiên cứu thêm 1.2 Giới thiệu oxadiazole Oxadiazole dị vòng có chứa nguyên tử oxy nguyên tử nitơ, chúng thường tồn dạng đồng phân 1,2,3-; 1,2,4-;1,2,5- 1,3,4oxadiazole, chúng mang tính bazơ Hình 1.1:Các đồng phân oxadiazole Oxadiazole sử dụng để thay cho liên kết peptid amide peptidomimetics bioisosteres cho amide este Vòng 1,2,4 ‐ oxadiazole có kết hợp tính chất ưa nước chất cho điện tử tạo nên hợp chất có hoạt tính sinh học đa dạng, nhiều quan tâm ngành dược hóa học Cho đến nhiều loại thuốc với thành phần hoạt chất oxadiazole có mặt thị trường, giai đoạn thử nghiệm lâm sàng như: Raltegravir (thuốc điều trị HIV/AIDS); Fasiplon (chống trầm cảm); Butalamine (thuốc giãn mạch) Translarna (với ataluren hoạt chất chính) dùng để điều trị bệnh loạn dưỡng Duchenne Ngồi cịn dùng để điều trị bệnh xơ nang đặc biệt để điều trị rối loạn di truyền khác có liên quan đến đoạn sớm protein [17] 1.2.1 Phương pháp tổng hợp dẫn xuất oxadiazole Các hợp chất 1,2,4-oxadiazole thường thu qua phản ứng cộng hợp đóng vịng hợp chất trung gian N-hydroxyimidamide với acid, 10 anhydride chloride acid tương ứng cho sản phẩm dẫn xuất 1,2,4oxadiazole Phản ứng cộng hợp đóng vịng hợp chất hydrazide với aldehyde cho sản phẩm dẫn xuất 1,3,4-oxadiazole tương ứng [18, 19] Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp 1,2,4-oxadiazole theo tài liệu số [18, 19] Năm 1996 Gui-Bai Liangvà Danqing D Feng [20] tổng hợp thành công số dẫn xuất oxadiazole Theo nghiên cứu trước báo cáo tác giả có đề cập đến tổng hợp oxadiazole thường bao gồm trình acyl hóa amidoxime chloride acid anhydride, sau chu trình vịng hóa pyridin Trong cơng bố này, nhóm tác giả thực q trình o-acyl hóa amidoximes cacboxylic acid bước phản ứng đóng vịng tạo oxadiazole Các dẫn xuất oxadiazoleđược tinh chế cột silica gel với hệ dung môi rửa giải methanol dichloromethane (tỉ lệ 1/5 - v/v) Hình 1.3 mơ tả sơ đồ tổng hợp oxadiazole nhómtác giả GuiBai Liang Danqing D Feng Hình 1.3: Sơ đồ tổng hợp oxadiazoletheoGui-Bai Liang Danqing D Feng 11 Từ hợp chất 2-phenylacetonitrile tác giả Mazahar Farooqui [21] cộng tổng hợp thành cơng 17 dẫn xuất oxadiazole Q trình tổng hợp oxadiazole thường phải trải qua giai đoạnvà thực sơ đồ hình 1.4 Để làm dẫn xuất oxadiazole tác giả sử dụng muối NaHCO3 sử dụng phương pháp kết tinh lại ethanol, phương pháp an toàn dễ thực  ... ? ?Nghiên cứu tổng hợp ataluren có tác dụng điều trị loạn dưỡng Duchenne? ?? để phục vụ nhu cầu chữa trị, cải thiện điều kiện sống cho thân người bệnh gia đình người bệnh Do vậy, việc tiến hành nghiên. .. ĐẦU Loạn dưỡng thuật ngữ nhóm bệnh có tính chất di truyền, đặc trưng yếu tiến triển teo cơ, bao gồm loạn dưỡng Duchenne, loạn dưỡng Becker, loạn dưỡng vùng gốc chi (đai vai, đai hông), loạn dưỡng. .. để điều trị chứng loạn dưỡng Duchenne Các nghiên cứu chứng minh điều trị ataluren làm tăng biểu protein dystrophin có chiều dài đầy đủ tế bào chuột chuột có chứa đột biến codon dừng sớm chứng loạn