NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU CÁ HỒI LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN ĐÌNH HẢI NAM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU CÁ HỒI LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đà Nẵng - Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN ĐÌNH HẢI NAM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU CÁ HỒI Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐẶNG MINH NHẬT Đà Nẵng - Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Có ba thứ đời mà người ta nên gặp, cố gắng để gặp: sách hay, bạn tốt, thầy tốt Cái khó tìm thầy tốt Vì thầy khơng sách, bạn Vốn dĩ hai thứ khó mà thầy cịn khó Gặp thầy tốt khơng dễ Có người may mắn gặp được; có người đến lúc cuối đinh ninh gặp, hóa khơng phải Cái tốt đời, thật khó Cái tốt mơ hồ, có tiêu chuẩn Nhưng băn khoăn nên trân trọng, lẽ thường hay Từ tự nhủ, người thầy đời thân gặp qua, người thầy tốt Thầm cảm ơn gặp cô Trâm Tuy thời gian tiếp xúc với cô không nhiều, lượng từ lịng người thầy có đam mê nhiệt huyết, truyền sang chúng em Giọng cô lanh lảnh chất chứa nhiệt tình thật tâm, thứ làm em nhớ Và, nhờ mà em trở thành học trị thầy Nhật Lúc đầu em nghĩ theo thầy Thầy hiền lạnh lùng nói, em chẳng nghĩ làm học trò Hóa duyên, nghiệm lại thấy điều xảy định Thầy chẳng nói nhiều đủ Những khúc mắc thầy giải đáp nhẹ nhàng hợp lý, thầy ln tìm hướng gợi để tự tìm hiểu nói rõ đáp án, nhờ mà kích thích tìm hiểu Thầy bận nên tốt phải tìm hiểu thật kỹ trước hỏi, hỏi cho đúng, cho đáng Chẳng chốc mà em rèn luyện tính cẩn thận, kỹ càng, hết tinh thần tò mò, ham học hỏi Trong suốt thời gian học, em tiếp xúc với nhiều thầy trường Mỗi người tính cách, chun mơn, sắc thái khác Nhờ mà em học hỏi nhiều điều hay Cơ Xơ trầm tính điềm đạm, giảng giải cặn kẽ Cơ Hạnh thích vào chi tiết truyền tải giảng theo cách đơn giản để người nắm bắt Thầy Đông hay kể chuyện bên lề làm ấn tượng giảng trở nên rõ nét Thầy Long với kiến thức hàn lâm uyên thâm phong cách giảng độc vô nhị… Và nhiều thầy khác giúp em tích lũy bao điều hay, lẽ dĩ nhiên, khơng gói gọn kiến thức giảng đơn Nếu khơng có thầy Tuấn, em khơng thể hồn thành thí nghiệm; khơng có thầy Sơn, thầy Cường, em chẳng thể hồn thành kết quan trọng luận văn Đơn giản pipet mà cô Tuyết cho mượn, khơng có nó, kết chưa hồn thiện Tưởng khơng gặp mà gặp đời, lại nhận hỗ trợ nhiệt tình thầy cơ, ân huệ Đã ân huệ khơng thể qn Em cảm ơn chị Hà (Phan Thị Việt Hà) giúp đỡ em nhiều q trình hồn thành luận văn Nhờ tranh luận mà hai chị em làm sáng tỏ nhiều vấn đề Biết bao trăn trở phương pháp nghiên cứu, số thí nghiệm tưởng chừng khơng thể hồn thành Nhưng rồi, chuyện qua Và tất thành viên lớp cao học K32.CNSH Khoảng thời gian ngắn ngủi, chẳng gặp nhiều, người giành cho tình cảm thật chân thành Đặc biệt anh Khiêm, người anh lo lắng cho tất thành viên lớp suốt thời gian vừa qua Ba năm qua thế, lời khun răn, nhắc nhở người Chẳng có lợi ích đây, đơn giản lịng đáng trân trọng người anh dành cho đứa em Nghĩ đường qua Lỗ Tấn có nói: Trên gian vốn làm có đường, người ta thành đường Vậy nên, thật hạnh phúc ngoảnh lại đường, nhận cịn sách hay, vài người bạn tốt, dĩ nhiên, thiếu người thầy tuyệt vời Một lần nữa, em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến tất cả, điều tuyệt vời mà em nhận suốt chặng đường vừa qua Em không quên Đà Nẵng, ngày 01 tháng 10 năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người cam đoan Nguyễn Đình Hải Nam MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 4 Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu Kết cấu luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYM LIPASE 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Cấu trúc enzym 1.1.3 Đặc tính xúc tác 1.1.4 Cơ chế xúc tác 1.1.5 Tính chất 10 1.1.5.1 Tính đặc hiệu 10 1.1.5.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình xúc tác enzym 10 1.1.6 Ứng dụng enzym lipase 11 1.1.7 Ưu phản ứng xúc tác lipase 13 1.1.8 Nguồn gốc lipase 13 1.1.9 Lipase từ mủ đu đủ 14 1.1.9.1 Sơ lược lipase thực vật 14 1.1.9.2 Vài đặc điểm đu đủ 15 1.1.9.3 Mủ đu đủ lipase từ mủ đu đủ 18 1.2 DẦU CÁ VÀ NGUỒN DINH DƯỠNG TỪ DẦU CÁ 19 1.2.1 Dầu cá 19 1.2.2 Nguồn dinh dưỡng từ dầu cá: Omega-3 20 1.2.3 Dầu cá hồi – nguồn cung cấp DHA, EPA 22 1.3 ỨNG DỤNG LIPASE LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU CÁ 22 1.3.1 Phản ứng thủy phân dầu cá 23 1.3.2 Phản ứng ester hóa 24 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 25 1.4.1 Nghiên cứu nước 25 1.4.2 Nghiên cứu nước 26 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 29 2.1.1 Nguyên liệu 29 2.1.2 Hóa chất 29 2.1.3 Thiết bị 30 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Phương pháp thu nhận enzym lipase từ mủ đu đủ 30 2.2.1.1 Thu nhận mủ đu đủ 30 2.2.1.2 Thu nhận enzym thô từ mủ đu đủ 30 2.2.1.3 Hiệu suất thu nhận 31 2.2.2 Phương pháp thu nhận dầu cá hồi 31 2.2.3 Phương pháp vật lý hóa lý 32 2.2.3.1 Xác định khối lượng mẫu 32 2.2.3.2 Xác định nhiệt độ 32 2.2.3.3 Xác định độ pH 32 2.2.3.4 Phương pháp sấy 32 2.2.4 Phương pháp hóa sinh 32 2.2.4.1 Phương pháp xác định số acid 32 2.2.4.2 Phương pháp xác định số xà phịng hóa 33 2.2.4.3 Phương pháp đo quang xác định hoạt độ lipase thô 33 2.2.4.4 Phương pháp chuẩn độ xác định hoạt độ lipase chất dầu cá hồi 33 2.2.4.5 Phương pháp xác định tính đặc hiệu axit béo lipase chất 34 2.2.4.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng nhiệt độ pH đến hoạt độ lipase 35 2.2.4.7 Phương pháp thủy phân làm giàu DHA EPA dầu cá hồi enzym lipase 35 2.2.4.8 Phương pháp ester hóa kết hợp phương pháp kết tinh với ure làm giàu DHA, EPA dầu cá hồi enzym lipase 37 2.2.4.9 Phương pháp xác định hàm lượng axit béo dầu cá 38 2.2.5 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 39 2.2.6 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ 42 3.1.1 Đánh giá hiệu suất thu nhận 42 3.1.2 Đánh giá hoạt độ chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ 43 3.1.2.1 Xác định thời gian đo hoạt độ 43 3.1.2.2 Hoạt độ chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ 44 3.1.3 Nghiên cứu tính đặc hiệu chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ 44 3.1.3.1 Xác định tính đặc hiệu phương pháp chuẩn độ 45 3.1.3.2 Xác định tính đặc hiệu phương pháp đĩa thạch 47 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hoạt độ enzym lipase thô chất dầu cá hồi 49 3.1.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzym lipase thô từ mủ đu đủ 49 3.1.4.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzym lipase thô từ mủ đu đủ 50 3.2 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG LIPASE MỦ ĐU ĐỦ ĐỂ LÀM GIÀU DHA VÀ EPA TRONG DẦU CÁ HỒI 52 3.2.1 Một số đặc điểm dầu cá hồi thô 52 3.2.1.1 Xác định số chất lượng dầu cá hồi thô 52 3.2.1.2 Xác định thành phần axit béo có dầu cá hồi 54 3.2.2 Kết nghiên cứu ứng dụng enzym lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA, EPA 56 3.2.2.1 Làm giàu theo phương pháp tạo kết tinh với ure kết hợp ester hóa lipase từ mủ đu đủ 57 3.2.2.2 Làm giàu theo phương pháp thủy phân xúc tác lipase từ mủ đu đủ 70 3.2.2.3 Đánh giá hai phương pháp làm giàu 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (BẢN SAO) HỒ SƠ HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU CÁ HỒI Học viên: Nguyễn Đình Hải Nam Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 Khóa: K32 Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN Tóm tắt - Lipase thơ thu nhận từ phần không tan mủ đu đủ thể nhiều đặc tính q ứng dụng lĩnh vực khác Trong nghiên cứu này, số đặc tính enzym lipase nghiên cứu phương pháp chuẩn độ phương pháp đĩa thạch Kết cho thấy enzym đặc hiệu chất béo axit béo không no nhiều nối đôi Enzym thể hoạt tính cao nhiệt độ 45oC pH Nghiên cứu ứng dụng lipase vào trình làm giàu DHA, EPA dầu cá hồi tiến hành thông qua hai phương pháp khác Đối với phương pháp kết tinh với ure kết hợp ester hóa: xác định tỉ lệ ure/ axit béo tối ưu 3:1, thời gian phản ứng tối ưu giờ; mức độ làm giàu DHA 1,84 lần với hiệu suất thu hồi đạt 64,88%; tỉ lệ DHA, EPA chuyển thành dạng glycerid 75,50% 65,34% Đối với phương pháp thủy phân: xác định tỉ lệ enzym/cơ chất tối ưu 4%; thời gian để hiệu suất phản ứng đạt 50% 20 Hiệu suất thủy phân DHA tương ứng đạt 63,30% Từ khóa – lipase; đu đủ; DHA; EPA; dầu cá hồi; làm giàu EXAMININATION OF SOME CHARACTERISTICS OF LIPASE FROM PAPAYA LATEX AND APPLICATION IN INCREASING THE CONCENTRATION OF n-3 PUFA FROM SALMON OIL Abstract - The crude lipase were obtained from the insoluble fraction of papaya latex possesses various interesting features, which could be utilized for application in different fields In this study, some biochemical properties of this enzym were studied by titrimetric method and plate method The results indicate that enzyme showed the specificity with respect to glycerids of polyunsaturated fatty acids The activity of the lipase was optimized at the temperature 45oC and the pH 8.5 Study on the enrichment of DHA and EPA in salmon oil using this lipase was conducted through two different methods For the urea complexation and esterification method, optimal conditions were discovered: urea/fatty acid rate of 3:1 and reaction time of hours; DHA concentration increased 1.84 times from originally oil with the recovery was 64.88%; DHA and EPA conversion rates were 75.50% and 65.34%, respectively For the hydrolysis method: the optimal ratio of enzyme/substrate was 4% and the time for the reaction to reach 50% hydrolysis was 20 hours Hydrolysis efficiency of DHA was 63.30% Key words – lipase; papaya; salmon oil; docosahexaenoic (DHA); eicosapentaenoic (EPA); enrichment DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT DHA Docosahexaenoic acid EPA Eicosapentaenoic acid FA(s) Axit béo FFA(s) Axit béo tự SFA(s) Axit béo bão hòa MUFA(s) Axit béo khơng no có nối đơi PUFA(s) Axit béo khơng no có nhiều nối đơi TG Triglycerid = acylglycerol (chất béo) DG Di-glycerid MG Mono-glycerid GC Gas chromatography (Sắc ký khí) HPLC DH High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) Degree of hydrolysis (mức độ thủy phân) Phụ lục B Kết phân tích số liệu Kết hoạt độ lipase chất khác Cơ chất Lần Lần Lần Kết trung bình Dầu cá hồi 260 256 254 256,67±3,06 Dầu đậu nành 228 210 232 223,27±11,68 Triolein 210 200 215 208,33±7,64 Tristearin 151 163 165 159,53±7,8 Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase đu đủ chất dầu cá hồi Mức nhiệt độ (oC) Lần Lần Lần Kết trung bình 30 130 153,33 120 134,44±17,1 35 196,67 180 190 188,89±8,39 40 190 200 206,67 198,89±8,39 45 263,33 256,67 246,67 255,56±8,39 50 120 136,67 146,67 134,45±13,47 55 123,33 53,33 106,67 94,44±36,57 60 103,33 80 60 81,11±21,69 Kết ảnh hưởng pH đến hoạt độ lipase đu đủ chất dầu cá hồi Mức pH Lần Lần Lần Kết trung bình 180 203,33 196,67 193,33±12,02 6.5 213,33 203,33 196,67 204,44±8,39 216,67 226,67 230 224,45±6,94 7.5 223,33 243,33 226,67 231,11±10,71 253,33 263,33 270 262,22±8,39 8.5 220 233,33 226,67 226,67±6,67 233,33 193,33 213,33 213,33±20 9.5 216,67 196,67 210 207,78±10,18 10 186,67 183,33 193,33 187,78±5,09 Kết ảnh hưởng tỉ lệ enzym/cơ chất đến hiệu suất thủy phân dầu cá Tỉ lệ enzym/ chất (%) Lần Lần Lần Kết trung bình 42,1 42,49 42,4 42,33±0,2 45,73 46,03 46,42 46,06±0,35 48,28 49,56 49,95 49,27±0,87 50,44 50,64 51,03 50,71±0,3 51,92 52,21 51,82 51,98±0,2 52,21 52,9 52,41 52,5±0,36 54,17 54,47 53,68 54,11±0,4 Kết ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thủy phân dầu cá Thời gian (giờ) Lần Lần Lần Kết trung bình 38,08 38,18 38,47 38,24±0,2 43,57 42,4 43,28 43,08±0,61 12 44,36 45,54 45,83 45,24±0,78 16 47,89 47,99 47,6 47,83±0,2 20 49,85 50,54 50,25 50,21±0,35 24 51,13 51,52 51,62 51,42±0,26 28 54,96 53,88 54,66 54,5±0,56 32 55,15 54,47 53,98 54,53±0,59 Phụ lục C Một số hình ảnh luận văn Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn EPA với nồng độ 0,3mM Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn DHA với nồng độ 5mM Hình Sắc ký đồ hỗn hợp mẫu chuẩn DHA 18mM EPA 1mM