Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng bacillus subtilis xl62 ứng dụng thử nghiệm chế phẩm bcf trên mô hình in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -o0o - LÊ THANH HỒNG TINH SẠCH PROTEIN CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG Bacillus subtilis XL62, ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM BCF TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -o0o - LÊ THANH HOÀNG TINH SẠCH PROTEIN CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG Bacillus subtilis XL62, ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM BCF TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO Chun ngành: Mã số: Học viên : Hướng dẫn khoa học: Sinh học thực nghiệm 60 42 30 Lê Thanh Hoàng TS Đỗ Thị Tuyên Luận văn thực Phòng CNSH Enzyme, Viện CNSH Hà Nội - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trưởng phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn giúp đỡ tơi q trình học tập làm việc Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian cho thực đề tài Tôi xin cảm ơn tập thể Phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học bảo, giúp đỡ tận tình cho tơi q trình thực nghiệm chia kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin cảm ơn Phịng đào tạo thầy giáo Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập Hà Nội, tháng 11 năm 2012 Học viên Lê Thanh Hồng i Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC TỪ VIẾT TẮT AFC Antifungal compound APS Ammonium persulphate B subtilis Bacillus subtilis BCF Biological Control Fungi CFU Conoly-Forming Unit DEAE-cellulose Dimethylaminoethyl-cellulose ĐC Đối chứng F oxysporum Fusarium oxysporum kDa Kilo Dalton M Marker MIC Minimum inhibitory concentration OD Optical density PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis Pr Protein R solani Rhizoctonia solani SDS Sodium dodecyl sulfate TB Trung bình TEMED N,N,N’,N’,- Tetramethyl ethylene diamine TN Thí nghiệm v/v Volume/volume w/v Weight/volume ii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i CÁC TỪ VIẾT TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chất đối kháng sinh trưởng nấm .3 1.2 Vai trò vi khuẩn Bacillus kiểm soát sinh học 1.2.1 Đại cương vi khuẩn B subtilis 1.2.2 Ứng dụng chủng Bacillus kiểm soát sinh học 1.3 1.3.1 Nghiên cứu hợp chất có hoạt tính kháng nấm 1.3.2 Sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm 1.4 Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh giới Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh Việt Nam 10 1.4.1 Nghiên cứu biện pháp sinh học phòng trừ nấm bệnh 10 1.4.2 Nghiên cứu sản xuất thương mại chế phẩm phòng trừ nấm 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu hóa chất .17 2.1.1 Chủng giống 17 2.1.2 Hóa chất 17 2.1.3 Các loại đệm dung dịch 17 2.1.4 Môi trường 18 2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu .19 2.2.1 Lên men chìm ni cấy vi sinh vật 19 2.2.2 Xác định hoạt tính kháng nấm 19 iii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.3 Xác định ảnh hưởng dinh dưỡng yếu tố hóa lý 20 2.2.4 Tách chiết tinh protein có hoạt tính kháng nấm 21 2.2.5 Điện di SDS-PAGE 22 2.2.6 Xác định hàm lượng protein tổng số 23 2.2.7 Xác định tính chất protein tinh 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 3.1.1 Hoạt tính kháng nấm dịch lọc tế bào từ B subtilis XL62 25 3.1.2 Ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy 27 3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 30 3.1.4 Ảnh hưởng pH nuôi cấy ban đầu 31 3.1.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc 34 3.2 Tinh protein có hoạt tính kháng nấm 35 3.2.1 Tinh qua sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose 35 3.2.2 Tinh qua sắc ký lọc gel Biogel P100 36 3.3 Đánh giá tính chất protein tinh .41 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 41 3.3.2 Ảnh hưởng proteinase K 42 3.3.3 Khả ức chế sợi bào tử nấm 42 3.4 Tính kháng nấm hoạt chất ngoại bào từ B subtilis XL62 25 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm BCF 43 3.4.1 Sản xuất chế phẩm BCF quy mơ phịng thí nghiệm 43 3.4.2 Thử nghiệm chế phẩm BCF mơ hình in vitro 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị .49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 iv Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc chủng B subtilis XL62 môi trường PDA Hình 2.1 Quy trì nh tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B subtilis XL62 22 Hình 3.1 Động thái sinh trưởng B subtilis XL62 môi trường dinh dưỡng khác 28 Hình 3.2 Hoạt tính ức chế sinh trưởng F oxysporum B subtilis XL62 môi trường khác 29 Hình 3.3 Hoạt tính ức chế sinh trưởng R solani B subtilis XL62 môi trường khác 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng B subtilis XL62 30 Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy lên hoạt tính ức chế sinh trưởng F oxysporum R solani 31 Hình 3.6 Mật độ tế bào B subtilis XL62 môi trường MT4 MT2 với giá trị pH ban đầu khác 32 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH mơi trường ban đầu lên hoạt tính ức chế F oxysporum 33 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu lên hoạt tính ức chế R solani 33 Hình 3.9 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên sinh trưởng chủng XL62 34 Hình 3.10 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên hoạt tính ức chế sinh trưởng nấm F oxysporum R solani 35 Hình 3.11 Sắc ký đồ c ác phân đoạn qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE -cellulose (A); Hoạt tính kháng F oxysporum đỉnh protein sau qua cột DEAE-52 cellulose (B) 36 Hình 3.12 Sắc ký đồ (A) điện di đồ (B) phân đoạn tinh qua cột Biogel peak 37 Hình 3.13 Hoạt tính kháng nấm phân đoạn tinh peak sau qua cột Biogel 37 Hình 3.14 ( A) Sắc ký đồ qua cột Biogel P 100; (B) điện di đồ các phân đoạn tinh sạch qua cột Biogel peak 38 Hình 3.15 Hoạt tính kháng nấm F oxysporum phân đoạn tinh peak 38 Hình 3.16 Sắc ký đồ phân đoạn qua cột Biogel P100 (A); Điện di đồ phân đoạn tinh trước sau qua cột Biogel peak (B) 39 Hình 3.17 Hoạt tính kháng nấm F oxysporum phân đoạn tinh peak3 39 Hình 3.18 Hoạt tính kháng F oxysporum R solani protein tinh peak 40 Hình 3.19 Hoạt tính kháng R solani protein tinh từ B subtilis XL62 peak 40 Hình 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tí nh kháng nấm F oxysporum (A) R solani (B) 42 Hình 3.21 Ảnh hưởng proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A) R solani (B) 42 Hình 3.22 Khả ức chế nảy mầm bào tử F oxysporum protein tinh từ B subtilis XL62 quan sát kính hiển vi quang học 42 Hình 3.23 Lên men sản xuất chế phẩm BCF quy mơ 20 lít/mẻ 44 Hình 3.24 Hoạt tính ức chế F oxysporum (A,C) R solani (B,D) chế phẩm BCF dạng đơn (A,B) dạng đa (C,D) sau ngày thí nghiệm 46 Hình 3.25 Hoạt tính ức chế F oxysporum (A) R solani (B) chế phẩm BCF dạng lỏng đặc 10 lần sau ngày thí nghiệm 46 v Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần loại đệm dung dịch 17 Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18 Bảng 2.3 Danh sách thiết bị thí nghiệm sử dụng 18 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ dịch lọc tế bào B subtilis XL62 lên sinh trưởng F oxysporum 26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dịch lọc tế bào B subtilis XL62 lên sinh trưởng sợi R solani 26 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ dịch lọc tế bào B subtilis XL62 lên sinh trưởng hạch R solani 26 Bảng 3.4 Sự biến động giá trị pH mơi trường dinh dưỡng q trình ni cấy 31 Bảng 3.5 Tóm tắt q trình tinh protein kháng nấm từ B subtilis XL62 peak qua bước tinh 39 Bảng 3.6 Khả ức chế F oxysporum R solani dịch nuôi cấy chủng B subtilis XL62, sau ngày lên men khác 44 Bảng 3.7 Hoạt tính ức chế R solani F oxysporum chế phẩm BCF sau ngày thử nghiệm 46 Bảng 3.8 Hoạt tính ức chế R solani F oxysporum chế phẩm BCF cô đặc 10 lần sau ngày thử nghiệm 46 vi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Chất đối kháng sinh trưởng nấm (antifungal compounds , AFC) chất có khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm đặc biệt nấm gây bệnh trồng lạc , cà chua , đậu tương , cà phê Các protein v peptide có hoạt tính kháng nấm tách chiết phần lớn từ động vật, thực vật, vi khuẩn và nấm Dựa cấu trúc chức , protein peptide có khả kháng nấm phân loại thành nhiều lớp khác nhau, chẳng hạn chitinase chitinase-like protein, ribonuclease, chất ức chế protease Peptide kháng nấm tách chiết từ B subtilis iturin bacillomycin Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng có khả kháng nấm tan huyết Các chủn g Bacillus biết đến với vai trò quan trọng việc kiểm sốt bệnh trồng Chúng có khả sinh tởng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác chất kháng sinh , lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin fengycin Một số chủng B subtilis ứng dụng để kiểm soát bệnh trồng nấm gây , chúng có phổ biến đất , chịu nhiệt độ cao , sinh trưởng nhanh môi trường lỏng có nhiều bào tử Hiện giới Việt Nam, việc sử dụng chế phẩm sinh học thay phần thuốc hóa học để phòng trừ số bệnh trồng vi sinh vật gây xu hướng chủ yếu Chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng có tác dụng tích cực nông nghiệp, ưu việt so với việc dùng thuốc hóa học Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng để diệt nấm gây hại trồng mang lại lợi ích lâu dài cho người sản xuất như: làm tăng suất trồng, giảm chi phí đầu tư, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trường sinh thái, không ảnh hưởng đến sức khỏe người vật ni, góp phần quan trọng việc phát triển nông nghiệp hữu bền vững hiệu Việc nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh trồng chế phẩm sinh học hình thành phát triển Việt Nam nhiều hạn chế Các chế phẩm dạng tinh tách chiết từ vi sinh vật nghiên cứu chủ yếu phịng thí nghiệm quy mơ sản xuất thử nên giá thành cao Các sản phẩm thị trường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm chủ yếu sản phẩm có chứa tế bào vi sinh vật đối kháng nên thời gian hữu hiệu ngắn, hiệu không cao Mặt khác, sản phẩm sử dụng tế bào mang nguy gây bệnh lớn cho người Vì vậy, phát triển sản phẩm sinh hóa đạt độ tinh cao để phòng chống nấm bệnh trồng vấn đề cấp thiết Trong trình nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn chủng B subtilis XL62 có khả ức chế mạnh nấm gây bệnh trồng F oxysporum R solani Xuất phát từ lý tình hình nghiên cứu Việt Nam, tơi thực đề tài luận văn: "Tinh protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis XL62, ứng dụng thử nghiệm chế phẩm BCF mơ hình in vitro" khuôn khổ đề tài "Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm BCF phòng chống bệnh trồng nấm Fusarium sp Rhizoctonia solani" TS Nguyễn Ngọc Dũng làm chủ nhiệm với mục tiêu: (1) Tinh protein từ B subtilis XL62 có hoạt tính kháng nấm, (2) Thử nghiệm khả ức chế F oxysporum R solani chế phẩm BCF mơ hình in vitro Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm Bacisubin tách chiết từ B subtilis B-916 ức chế mạnh sử mầm bào tử chủng nấm Alternaria and Botrytis (Liu et al., 2007) Protein B29I từ B subtilis B29 có hoạt tính kháng nấm chứng minh có khả ức chế nảy mầm chủng nấm F oxysporum, R solani, F moniliforme, Sclerotinia sclerotiorum (Li et al., 2009) Trong nghiên cứu bước đầu nghiên cứu ủ protein tinh chủng F oxysporum (Hình 3.22) 3.4 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm BCF Từ kết nghiên cứu đạt được, tiến hành sản xuất thử nghiệm chế phẩm dạng dịch có tác dụng ức chế sinh trưởng phát triển chủng nấm gây bệnh hại (BCF) mơ hình in vitro, tối ưu lên men hồn thiện quy trình sản xuất để tiến tới thử nghiệm quy mơ lớn mơ hình nhà lưới đồng ruộng diện hẹp diện rộng 3.4.1 Sản xuất chế phẩm BCF quy mơ phịng thí nghiệm 3.4.1.1 Tối ưu điều kiện lên men quy mô 20 lít/mẻ Lựa chọn mơi trường lên men Mơi trường King’s B sử dụng làm môi trường lên men cho chủng B sublilis XL62: 30 g glycerol; 10 g peptone; 0,5 g KH2PO4; 0,5 g MgSO4 pH quy mơ bình tam giác Sau q trình tối ưu lựa chọn môi trường lên men B sublilis XL62 quy mô 20 lít/ mẻ bao gồm: 10 g peptone; g cao nấm men; g NaCl; 0,5 g KH2PO4; 0,5 g MgSO4.7H2O; 0,5 g NH4Cl Với thông số kỹ thuật thời gian lên men sau ngày pH 7, 30°C, 200 rpm, sục khí 0,5 vvm Lựa chọn điều kiện lên men Chủng giống vi khuẩn lên men mơi trường chọn xử lí với độ pH 5,5-8,5, 25-40C với tốc độ lắc khác từ 0-200 vòng/ phút thời gian ngày Sau trình tối ưu chọn điều kiện lên men: pH môi trường 6,5-7, nhiệt độ lên men 30°C, tốc độ sục khí 0,5 vvm, thời gian lên men ngày Lựa chọn phương pháp lên men Quá trình lên men chủng B subtilis XL62 tiến hành thiết bị lên men 20 lít Lựa chọn phương pháp lên men: lên men gián đoạn theo mẻ, lên men liên tục 43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm theo mẻ có tiếp môi trường bổ sung Sau tối ưu lựa chọn phương pháp lên men theo mẻ để sản xuất hoạt chất kháng nấm từ chủng 3.4.1.2 Lên men quy mơ 20 lít/mẻ thu hồi hoạt chất kháng nấm Chủng vi khuẩn B subtilis XL62 lên men lỏng môi trường phù hợp điều kiện nuôi cấy pH 7, 30°C, 200 rpm, sục khí 0,5 vvm Lên men gián đoạn thu hồi theo mẻ Dịch lên men loại tế bào Hoạt chất ngoại bào thử hoạt tính kháng nấm Fusarium Rhizoctonia (Hình 3.23) A B C Hình 3.23 Lên men sản xuất chế phẩm BCF quy mơ 20 lít/mẻ Thiết bị lên men sử dụng để lên men chủng B subtilis XL62 tạo chế phẩm BCF (A); Khả ức chế F oxysporum (B) R solani (C) dịch lọc ngoại bào từ chủng B subtilis XL62 Kết cho thấy, dịch lọc ngoại bào từ chủng B sublilis XL62 sau ngày lên men ức chế sinh trường phát triển nấm F oxysporum 44%, nấm R solani 75% Sau ngày lên men, hoạt tính kháng nấm dịch lọc ngoại bào ức chế 80% sinh trưởng phát triển hai loại nấm (Bảng 3.6) Bảng 3.6 Khả ức chế F oxysporum R solani dịch nuôi cấy chủng B subtilis XL62, sau ngày lên men khác Thời gian (ngày) F oxysporum R solani d0 (cm) d1 (cm) Ức chế (%) d0 (cm) d1 (cm) Ức chế (%) 1N 6,1 42 44 2N 44 75 3N 4,2 72 3,6 80 4N 3,6 80 3,2 84 5N 3,5 81 3,1 85 44 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm Với kết thu chứng tỏ hoạt chất ngoại bào từ chủng B subtilis XL62 có hoạt tính kháng nấm Fusarium Rhizoctonia 80% tổng hợp nhiều sau ngày lên men Như thông số lên men quy mơ 20 lít phù hợp cho sản xuất hoạt chất kháng nấm ngoại bào chủng B subtilis XL62 Sau nghiên cứu tối ưu điều kiện lên men quy mô mẻ 20 lít/mẻ với thơng số kỹ thuật ởn định, sản xuất chế phẩm BCF dạng dịch để thử nghiệm 3.4.2 Thử nghiệm chế phẩm BCF mô hình in vitro Với quy trình sản xuất mô tả với thông số kỹ thuật tối ưu, dịch lên men chủng B subtilis XL62 loại tế bào, thu hồi hoạt chất thử phối trộn để tạo chế phẩm BCF theo công thức khác nhau: Dạng đơn hoạt chất riêng biệt từ chủng B subtilis XL62 với nồng độ hoạt chất đạt 30-40 mg/L Dạng đa phối trộn với hoạt chất kháng nấm ngoại bào tách từ hai chủng khác Burkhoderia cepacia ĐngL1 Pseudomonas aeruginosa ĐA3.1 theo tỷ lệ 1:1:1 với nồng độ hoạt chất đạt 30-40 mg/L Các chế phẩm BCF thử hoạt tính ức chế sinh trưởng nấm Fusarium Rhizoctonia đĩa môi trường PDA theo phương pháp ức chế nồng độ bổ sung Khả ức chế xác định sau ngày thí nghiệm 30C, kết thu chế phẩm BCF dạng đơn từ chủng B subtilis XL62 với nồng độ 1% có hoạt tính ức chế nấm đạt 68% nấm F oxysporum 84% nấm R solani Trong chế phẩm BCF dạng đa có phối trộn hoạt chất từ chủng Pseudomonas, Burkholderia Bacillus cho hoạt tính ức chế sinh trưởng sợi nấm R solani F oxysporum cao đạt tương ứng 99% 94% (Hình 3.24 Bảng 3.7) A B 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm C D Hình 3.24 Hoạt tính ức chế F oxysporum (A,C) R solani (B,D) chế phẩm BCF dạng đơn (A,B) dạng đa (C,D) sau ngày thí nghiệm Bảng 3.7 Hoạt tính ức chế R solani F oxysporum chế phẩm BCF sau ngày thử nghiệm R solani Nấm TN F oxysporum Mẫu TN d0 (cm) d1 (cm) % ức chế d0 (cm) d1 (cm) % ức chế BCF đơn 1% 7,3 3,0 84 7,1 4,0 68 BCF đa 1% 7,3 0,7 99 7,1 2,7 94 Như vậy, công thức phối trộn hoạt chất ngoại bào từ Pseudomonas, Burkholderia Bacillus theo tỷ lệ 1:1:1 lựa chọn để làm nguyên liệu ban đầu xây dựng tạo dạng chế phẩm BCF cho nghiên cứu ứng dụng sau quy mô lớn Để thuận lợi cho việc sử dụng, vận chuyển dễ dàng, bảo quản phịng thí nghiệm đưa sử dụng ngồi đồng ruộng, chúng tơi tạo dạng chế phẩm BCF dạng lỏng cô đặc 10 lần so với chế phẩm dạng dịch ban đầu Hoạt tính ức chế sinh trưởng R solani F oxysporum điều kiện in vitro chế phẩm dạng lỏng cô đặc xác định theo phương pháp ức chế theo nồng độ bở sung Hình 3.25 Hoạt tính ức chế F oxysporum (A) R solani (B) chế phẩm BCF dạng lỏng cô đặc 10 lần sau ngày thí nghiệm A B Bảng 3.8 Hoạt tính ức chế R solani F oxysporum chế phẩm BCF cô đặc 10 lần sau ngày thử nghiệm Nấm TN R solani F oxysporum 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm Mẫu TN d0 (cm) d1 (cm) % ức chế d0 (cm) d1 (cm) % ức chế BCF dịch 1% 8,3 1,0 99 7,6 2,2 92 BCF 0,1% 8,3 1,4 97 7,6 3,2 82 BCF 0,2% 8,3 1,0 99 7,6 2,3 91 Chế phẩm BCF dạng lỏng đặc 10 lần pha lỗng với nước cất vô trùng với nồng độ chế phẩm bổ sung 0,1% 0,2% Ở nồng độ 0,1%, chế phẩm BCF dạng cô đặc ức chế 97% nấm R solani 82% nấm F oxysporum (Bảng 3.8) Trong chế phẩm dạng dịch nồng độ 1%, ức chế tương ứng 92-99% F oxysporum R solani Khi nồng độ chế phẩm cô đặc tăng lên 0,2% nồng độ ức chế tăng 99% R solani 91% F oxysporum Như việc cô đặc chế phẩm BCF giúp cho việc vận chuyển chế phẩm sử dụng đồng ruộng thuận lợi hơn, hiệu kinh tế mà hoạt tính ức chế nấm không thay đổi Từ số liệu nghiên cứu cho thấy, chúng tơi tìm công thức phối trộn tạo chế phẩm BCF từ hoạt chất ngoại bào chủng B subtilis XL62, B cepacia ĐngL1 P aeruginosa ĐA3.1 theo tỷ lệ 1:1:1, hoạt tính ức chế sinh trưởng R solani F oxysporum thử nghiệm tốt đạt 82-99% nồng độ chế phẩm cô đặc 0,10,2% sau ngày thử nghiệm Đây kết bước đầu khả quan cho việc thử nghiệm chế phẩm quy mô lớn hơn, tiến tới sản xuất chế phẩm sinh hóa an tồn, có hiệu cao việc kiểm soát loại nấm bệnh gây hại trồng, góp phần phát triển nơng nghiệp an tồn, bền vững 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Dịch chiết hoạt chất ngoại bào từ chủng B subtilis XL62 với nồng độ 20% ức chế 80% sinh trưởng phát triển hai chủng nấm Fusarium Rhizoctonia, đặc biệt nồng độ 50%, dịch lọc chủng nghiên cứu làm cho hạch chủng nấm R solani khả nảy mầm Lựa chọn hai môi trường MT4 MT2 môi trường khảo sát mơi trường thích hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm ngoại bào từ chủng B subtilis XL62 với thông số kỹ thuật: nhiệt độ 3037C, pH 6,5-7,0 tốc độ lắc 200 vịng/phút quy mơ bình tam giác Đã tách chiết tinh phân đoạn protein có hoạt tính kháng nấm cao từ chủng B subtilis XL62 có khối lượng phân tử 21 kDa, 43 kDa