Điều tra thu thập mẫu củ bình vôi ở một số tỉnh việt nam và xây dựng phương pháp định lượng rotundin bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang tlc scanning

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  VŨ ĐỨC THẮNG ĐIỀU TRA, THU THẬP MẪU CỦ BÌNH VƠI Ở MỘT SỐ TỈNH VIỆT NAM VÀ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ROTUNDIN BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KẾT HỢP ĐO MẬT ĐỘ QUANG (TLC-SCANNING) NGÀNH MÃ NGÀNH : SINH HỌC THỰC NGHIỆM : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS LÊ MINH HÀ Hà Nội, Tháng 12-2014 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Bình vơi tên gọi nhiều lồi dây leo có rễ củ thuộc chi Stephania, họ Tiết dê – Menispermaceae Cây Bình vơi cịn gọi củ một, củ mối trịn, dây mối trơn, gà ấp…[89] Trên giới chi Stephania có khoảng 50 lồi, Việt nam có khoảng 14 đến 16 lồi.Các lồi Bình vơi nƣớc ta phân bố rộng miền Bắc, Trung, Nam, thƣờng gặp vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Hồ Bình, Cao Bằng, Thanh Hố, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu Củ Bình vơi chứa chủ yếu alkaloid với hàm lƣợng khác lồi, đặc biệt hợp chất Rotundin (hay Ltetrahydropalmatin) chiếm hàm lƣợng lớn Trong y học cổ truyền từ xa xƣa củ Bình vơi đƣợc dùng dƣới dạng sắc, ngâm rƣợu chữa ngủ, an thần, nhức đầu, sốt nóng, ho hen, lỵ, đau bụng, đau dày, ho nhiều đờm, hen suyễn khó thở Hiện Rotundin đƣợc dùng chủ yếu để chữa bệnh ngủ an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có ƣu điểm bật nhƣ độc tính thấp, dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý.Sau ngủ không bị mệt mỏi không gây nhức đầu nhƣ loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [5] Các nghiên cứu gần cho thấy Rotundin sử dụng với liều thấp cịn có tác dụng làm giảm ảnh hƣởng gây nghiện cocain, gợi ý việc sử dụng Rotundin nhƣ chất cai nghiện [29], [56], [57] Bên cạnh đó, nhiều hoạt tính sinh học quý báu Rotundin đƣợc chứng minh bao gồm tác dụng an thần – giảm đau – gây ngủ, tác dụng hạ sốt, bảo vệ thần kinh, chống động kinh, hạ huyết áp, giãn trơn [13] Hiện việc tiêu thụ sản xuất Rotundin từ ngun liệu củ Bình vơi ngày đƣợc phát triển giới Việt Nam Việc bán tổng hợp Rotundin thành Rotundin sunfat để sản xuất thuốc tiêm đƣợc Học viện Quân Y nghiên cứu thành công Trên thị trƣờng xuất Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nhiều sản phẩm thƣơng mại có chứa Rotundin Rotundin sunfat nhƣ sản phẩm viên Rotunda, Sen vông, Roxen, Nightqueen Tuy nhiên nguồn dƣợc liệu củ Bình vôi Việt Nam tự nhiên ngày cạn kiệt việc khai thác bừa bãi, khơng có qui hoạch.Vì việc khảo sát để tìm kiếm lồi Bình vơi có hàm lƣợng Rotundin cao, từ xây dựng phƣơng án bảo tồn nhân giống, trồng bình vơi hồn tồn cần thiết Để góp phần vào việc nghiên cứu với mục đích trên, luận văn tiến hành thực đề tài “Điều tra, thu thập mẫu củ Bình vơi số tỉnh Việt Nam xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Rotundin sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning)” nhằm tìm kiếm, xác định đƣợc lồi Bình vơi chứa hàm lƣợng hoạt chất Rotundin cao đƣa đƣợc phƣơng pháp định lƣợng Rotundin từ củ Bình vơi tƣơi TLC-Scanning giúp tiết kiệm đƣợc thời gian chi phí so với định lƣợng từ củ khô HPLC, phục vụ cho việc thu mua kịp thời nguồn dƣợc liệu để sản xuất Rotundin qui mô lớn Nội dung nghiên cứu cụ thể nhƣ sau: Đihiên cứu cụ thể nhƣ sau:úp tiết kiệm đƣợc thời gian chi phíNam xác đcụ thể nhƣ sau:úp tiết kiệm đƣợc t Xây d xác đcụ thể nhƣ sau:úp tiếRotundin mụ thể nhƣ sau:úp tiết kbằng phƣơng pháp sắc ký lỏng kết hợp đo mật độ quang TLC-Scanning Chianning.g pháp sắcRotundin ttunding.g pháp sắc ký lỏng kết hợp đo c hóa học Rotundin Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chi Bình vơi Chi Bình vơi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) chi thực vật có hoa họ Biển cát (Menispermaceae hay gọi họ Tiết dê), có nguồn gốc miền đơng nam châu Á nhƣ Australasia Chúng loài thân thảo dạng dây leo, thƣờng xanh, cao tới m, với thân củ dạng gỗ phình to, dân gian gọi củ Các mọc thành vòng xoắn thân cây, hình khiên với cuống gắn gần trung tâm Hoa nhỏ, khác gốc, màu vàng cam tụ tập thành tán kép Quả hình cầu dẹt, chín màu đỏ, chứa hạt, hình móng ngựa, có gai [89] Trên giới chi Bình vơi Stephania có khoảng 50 loài, phân bố vùng nhiệt đới, Á nhiệt đới nƣớc châu Á chủ yếu nhƣ: Trung quốc (43 loài), Thái lan (18 loài), Indonesia (17 loài), Việt nam (14 - 16 loài), Malaysia (11 loài), Ấn độ (11 loài), Philippin (8 loài), Papua New Guinea (8 loài), Myanma (5 loài), Nhật (2 loài), Sri Lanka (2 lồi), Lào (2 lồi), Đơng timor (1 lồi), Quần đảo Solomon (1 loài), Banglades (1 loài), Nepal (1 lồi); ngồi cịn có châu Úc: Australia (7 loài), châu Phi (12 loài) [8] Ở nƣớc ta, lồi chi Bình vơi có khoảng 14 đến 16 loài chúng phân bố rộng, nhiều địa phƣơng từ Bắc vào Nam Song khu vực có số lồi phong phú, đa dạng tập trung tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Phú Thọ, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Lai Châu, Sơn La, Hoà Binh, Hà Tây, Hà Nam, Ninh Bình, Thanh Hố, Nghệ An, Hà Tĩnh Một số lồi (S venosa, S cambodica Gagnep, S pierrei) gặp tỉnh phía Nam: Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình Định, Phú Yên, Ninh Thuận, Khánh Hoà, Bà Rịa - Vũng Tàu An Giang Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ [15] Trƣớc đây, tên Bình vơi dùng cho lồi Stephaniarotunda Lour (Stephania glabra (Roxb.) Miers.), với tên khác Củ một, Củ gà ấp, Dây mối trơn, Cà tòm, Cáy pầm (Tày), Co cáy (Thái), Tở lùng dòi (Dao), P'lồi (K'ho), Moon - seed (Anh) Một số lồi Bình vơi đƣợc phát số tỉnh Việt Nam đƣợc liệt kê bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số lồi Bình vơi đƣợc phát số tỉnh Việt Nam STT Địa điểm Tên loài S glabra (Roxb.) Miers S viridiflavens H S Lo et M Yang Sơn La Hàm lượng Tài liệu Ninh Bình Sapa 0,59% [21] 0,63% [6] 3,7% [11] Hoàng Liên Sơn (cũ) 3,55% [2] Sapa 5,1% [16] Sapa 3,69% [8] 3,06% [21] Ninh Bình 1,4% [16] Quảng Bình 2,43% [8] S brachyandra Diels S kuinanensis H s Lo et M Yang Lạng Sơn S sinica Diels S sinica Diels Hà Nam Ninh (cũ) 1,31% [2] S dielsiana Y C Wu Hà Nội 0,4% [8] S kwangsiensis H S Lo Quảng Ninh 1,8% [16] 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Bình vơi Các lồi chi Bình vơi (Stephania) dây leo, sống lâu năm năm (Hình 1.1) Ở giai đoạn non thân thƣờng nhẵn, màu xanh nhạt, xanh bóng xanh đậm Trên thân già thƣờng có rãnh dọc, Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ mụn cóc sần sùi, màu nâu xám, nâu đen màu nâu đất Rễ dạng sợi phình to tạo thành rễ củ Củ đa dạng hình thái, kích thƣớc màu sắc Củ thƣờng có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hình dạng bất định Có lồi rễ củ thƣờng nặng 0,5-2(hoặc 3) kg, nhƣng có lồi cho củ nặng tới 50-70 kg Tùy thuộc vào lồi, tuổi điều kiện mơi trƣờng sống mà hình thái, màu sắc vỏ củ có nhiều thay đổi (nhẵn xù xì, màu nâu sáng nhạt, nâu đậm, xám tro, đen ) Thịt củ nạc có lẫn vằn xơ, màu trắng ngà, vàng tƣơi, vàng nhạt đỏ nâu, đỏ tƣơi Lá mọc cách, cuống thƣờng mảnh, dài đến 15 đến 20 cm hai đầu phồng lên[15], có gấp khúc gốc [21] Cuống đính vào thƣờng vị trí cách xa mép dƣới gốc khoảng cách định, tùy thuộc vào lồi (có thể từ 1/5 đến 1/3 chiều dài phiến lá) Phiến mỏng dày, nhẵn bóng rải rác có lơng, hình khiên, hình tam giác rộng, hình trứng-tam giác, tam giác trịn gần trịn; mép nguyên chia thùy; gân dạng chân vịt, gổm 8-9 10-12 gân xuất phát từ đỉnh cuống Chóp nhọn, thn nhọn, tù gần tròn; gốc gần tròn, phẳng gần hình tim Màu sắc phiến tùy thuộc vào loài (màu xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt đốm tía) Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực, thƣờng mọc từ kẽ Cụm hoa có dạng tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [15], có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm nhánh tán cấp (2), nhánh cuối không xim tụ họp thành đầu hình đĩa [21] Hoa đực thƣờng có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6-8,rời, xếp thành vịng; 3-4 cánh hoa, dạng vỏ sị, màu vàng, đơi trắng xanh; nhị 2-6, thƣờng 4, nhị dính tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xoè thành đĩa Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ tròn Hoa thƣờng gồm đài cánh hoa (rất có 3-4 đài 3-4 cánh hoa), bầu hình trứng có đến núm nhụy hình dùi Quả hạch, dạng hình gần trịn, hình trứng, trứng bầu, bên dẹt Ở trƣởng thành, cuống lệch phía gần với dấu vết cịn lại núm nhụy Bầu nỗn, nhƣng có phát triển thành hạt, cịn thối hóa Ở chín, vỏ ngồi thƣờng có màu vàng đậm đỏ tƣơi, nhẵn bóng Hạt hình móng ngựa, hình trứng dẹp trịn, mặt bên lõm, có lỗ thủng khơng, dọc theo gờ lƣng bụng thƣờng có hàng vằn gai Đặc điểm hình thái hạt thƣờng đặc trƣng cho taxon; nên đƣợc coi dấu hiệu đáng tin cậy để giám định tên khoa học lồi chi Bình vơi [15] Cây mầm có mầm nhiều rễ mầm, bao quanh nội nhũ [21] Hình 1.1 Hình ảnh Bình vơi 1.1.2 Sinh thái, sinh trưởng phát triển lồi Bình vơi Các lồi thuộc chi Bình vơi thƣờng sinh trƣởng rừng nguyên sinh hay rừng thứ sinh Chúng thƣờng mọc đỉnh hay sƣờn núi đá Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vôi, núi đất xen lẫn đá, dải đất ven đƣờng, ven sơng, đơi gặp ven bờ biển Sống thích hợp nhiệt độ trung bình năm 21-230C, lƣợng mƣa 20002500mm, ƣa đất nhiều mùn, thoát nƣớc, độ pH = 6,5-7 Một số lồi phân bố độ cao tới 2.000-2.800 m so với mực nƣớc biển Hầu hết lồi Bình vơi ƣa sáng, ƣa đất có độ ẩm vừa phải đặc biệt giai đoạn hoa tạo Các lồi Bình vơi có Việt Nam có thời vụ chồi năm Vụ chồi đông xuân, bao gồm chồi sớm xuất (trên thân đầu củ) từ tháng 11- 12 Những chồi trạng thái "chồi ngủ" mùa xuân (tháng - 2) bắt đầu thời kỳ sinh trƣởng mạnh Chỉ vòng - tháng, chồi dài tới 1m Chồi đông xuân lứa chồi quan trọng Bình vơi, loại chồi lá, hoa, mọc lứa chồi xuân hè (chồi cấp II) Số chồi cấp II nhiều gấp bội so với chồi đông xuân (tính đơn vị chiều dài chồi) Lá trƣởng thành mùa hè rụng hết mùa khô hanh (tháng 10) Sự rụng hàng năm tập tính quan trọng Bình vơi Sự tái sinh chồi mạnh mẽ Bình vơi cịn thể khả mọc mầm mảnh bổ từ củ đem vùi xuống đất Những mảnh đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt mảnh khác Có thể áp dụng khả để nhân giống Bình vơi Trong tự nhiên, hoa Bình vơi đƣợc thụ phấn chéo chủ yếu nhờ trùng Hạt Bình vơi thƣờng nhỏ, khối lƣợng trung bình 1.000 hạt thƣờng khoảng 10-29g Hạt phát tán nhờ nƣớc Các cá thể Bình vơi trồng từ hạt thƣờng sinh trƣởng, phát triển nhanh Chỉ sau 5-6 tháng tuổi, vƣơn dài tới 50-80(-100) cm, phân cành khỏe Ở số lồi, bắt đầu hoa cho bƣớc vào giai đoạn 6- tháng tuổi Trong q trình Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ sinh trƣởng, rễ thƣờng lớn dần tạo thành củ (ớ lồi có củ) phân nhánh nhiều tạo thành rễ dạng sợi (ở lồi có rễ dạng sợi) [15] 1.1.3 Kỹ thuật nhân giống gây trồng Có thể nhân giống Bình vơi phƣơng pháp vơ tính hữu tính Với lồi Bình vơi khơng có củ (chỉ có rễ dạng sợi) nhân giống dễ dàng đoạn hom dây lấy từ thân cành Cịn với lồi Bình vơi có củ thƣờng nhân giống sinh dƣỡng mảnh củ phía gần gốc Tuy nhiên, hệ số nhân giống vơ tính thƣờng thấp, gấp có 2-4 lần tốc độ tăng truởng chậm Nhân giống Bình vơi từ hạt biện pháp có hiệu cao Hạt Bình vơi sau thu hoạch gieo ủ cát ẩm tỉ lệ nẩy mầm cao Sau gieo khoảng 40-65 ngày hạt bắt đầu nảy mầm Hạt tƣơi đƣợc gieo sau thu hái, điều kiện thuận lợi có tỷ lệ nẩy mẩm cao (thƣờng từ 75-85%) Nếu để lâu 2-3 tháng gieo tỷ lệ nẩy mầm đạt khoảng 30% tối đa 40-45% Trồng 2-3 năm thu hoạch dƣợc liệu Thời gian lâu suất cao Trồng hạt có suất cao trồng từ mầm củ [15] 1.1.4 Năng suất thu hái củ Bình vơi Đến nay, nƣớc ta việc khai thác củ chủ yếu dựa vào nguồn Bình vơi mọc sẵn tự nhiên Lƣợng củ Bình vơi bị khai thác để sử dụng nƣớc nhƣ bán qua biên giới thời gian qua lớn Những năm trƣớc đây, sản lƣợng khai thác thƣờng đạt tới 500-700 tấn/năm Hiện nguồn nguyên liệu tự nhiên trở nên khan Bình vơi trồng từ hạt năm suất củ tƣơi đạt 1-2 tấn/ha, đến năm thứ đạt 2,5-3(-5) tấn/ha [15] Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học củ Bình vơi Những thuộc chi Stephania (họ Menispermaceae) phân bố rộng đƣợc sử dụng từ lâu y học cổ truyền để chữa nhiều bệnh khác Hơn 150 hợp chất alkaloid với flavonoids, lignans, steroids, terpenoids coumarins đƣợc phân lập xác định cấu trúc chi nhiều hợp chất đƣợc đánh giá có hoạt tính sinh học cao 1.2.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học củ Bình vơi giới Số lƣợng hợp chất phân lập từ loài chi Stephaniatrên giới xếp vào nhóm hợp chất đƣợc liệt kê bảng 1.2 [8] Bảng 1.2 Các nhóm alkaloid chi Stephania STT Nhóm chất Số lƣợng alkaloid Gồm chất đƣợc phân lập từ loài khác Benzylisoquinolin Bisbenzilisoquinolin Gồm 47 chất đƣợc phân lập từ 14 loài Aporphin Gồm 75 chất đƣợc phân lập từ 33 loài Proaporphin Gồm chất đƣợc phân lập từ loài Protoberberin Morphinan Gồm 21 chất đƣợc phân lập từ 22 loài Hasubanan Gồm 49 chất đƣợc phân lập từ 11 loài Eribidin Gồm chất Protostephanin Stephaoxocan Gồm 24 chất đƣợc phân lập từ 22 loài, có L-tetrahydropalmatin Gồm chất đƣợc phân lập từ loài S cepharantha 1.2.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học củ Bình vơi Việt Nam Một số hợp chất đƣợc phân lập từ số lồi Bình vơi Việt Nam đƣợc liệt kê bảng 1.3 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 17 Trần Thị Quế , (2008), Nghiên cứu, phân lập chuyển hóa ankaloit củ Cà tôm (Stephania sinica Deils), Luận văn thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên 18 Thái Nguyễn Hùng Thu, Phan Đình Châu, Hồ Đức Cƣờng (2000), Phối hợp sắc ký lớp mỏng máy vi tính để định lƣợng sản phẩm số hỗn hợp phản ứng ether hóa dihydroartemisinin, Tạp chí Dược học, 2000(8), tr 20 – 23 19 Trần Khắc Vũ, (1997), Góp phần hồn thiện cơng nghệ chiết xuất Ltetrahydro palmatin từ củ bình vơi Stephania Lour; Luận Thạc sỹ 20 Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ, Bùi Kim Liên, Chu Đình Kính, Trịnh Văn Bảo (1998).Tác dụng L-tetrahydropalmatin chiết suất từ củ lồi bình vơi Stephania glabra (Roxb.) Miers lên điện tim điện não thỏ", Tạp chí dược học, 269, tr 21-23 21 Nguyễn Tiến Vững (2000), Nghiên cứu thực vật, hóa học tác dụng sinh học số loài thuộc chi Stephania Lour Việt nam, Luận án Tiến sĩ Dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà nội Tiếng anh 22 Angerhofer, C.K., Guinaudeau, H., Wongpanich, V., Pezzuto, J.M., Cordell, G.A., 1999 Antiplasmodial and cytotoxic activity of natural bisbenzylisoquinoline alkaloids Journal of Natural Products 62, 59–66 23 Aogi K., Nishiyama M (1997), Overcoming CPT-11 resistance by using abiscoclaurine alkaloid, cepharanthine, to modulate plasma trans- membrane potential, Int-J-Cancer, vol 72, pp 295-300 24 Bun Sok-Siya, Michele Laget, Aun Chea, Hot Bun, Evelyne Ollivier and Riad Elias (2009), Cytotoxic activity of alkaloids isolated from Stephania rotunda in vitro cytotoxic activity of cepharanthine, Phytother Res., 23, pp.587-590 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 25 Camacho, M.R., Kirby, G.C., Warhurst, D.C., Croft, S.L., Phillipson, J.D., 2000 Oxoaporphine alkaloids and quinines from Stephania dinklagei and evalution of their antiprotozoal activity Planta Medica 66, 478–480 26 Chen Y J., Tu M.L (1997), Protective effect of tetrandrine on normal human mononuclear cells against ionizing irradiation, Biol-PharmBull, 20, pp 1160-1164 27 Chen Yuan-wen, Li Ding-Guo, Wu Jian-xin, Chen Ying-wei, Lu Hanming (2005), Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-P in vitro via up-regulation of Smad 7, Journal of Ethnopharmacology, vol 100, pp 299-305 28 Chiou WF, Lee WS, Yeh PH (2006) Tetrandrine selectively protects against amyloid-beta protein-but not against MPTP-induced cytotoxicity in SK-N-SH neuroblastoma cells [J] Planta Med., 72(14): 1300-1304 29 Chu Hongyuan, Jin Guozhang, Friedman Eitan, Zhen Xuechu (2008), Recent development in studies of tetrahydroprotoberberines: Mechanism in antinociception and drug addition, Ceil Movelopment in studies of tetrah 30 Das, B., Pal, P., Tandon, V., Lyndem, L.M., Kar, P.K., Rao, H.S.P., 2004 Anthelmintic efficacy of extract of Stephania glabra and aerial root extract of Trichosanthes multiloba in vitro: two indigenous plants in Shillong, India Journal of Parasitic Diseases 28, 37–44 31 Eike Reich, Anne Schibli (2006), High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme medical Publishers, Inc Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 32 Ellenbroek, B.A., Zhang, X.X., Jin, G.Z., 2006 Effects of (−)stepholidine in animal models for schizophrenia Acta Pharmacologica Sinica 27, 1111–1118 33 Feng Dechun, Mei Yunhua, Wang Ying, Zhang Bianhong, Wang Chen, Xu Lingyun (2008), Tetrandrine protects mice from concanavalin A- induced hepatitis through inhibiting NF-kB activation, Immunology Letters, 121, pp 127-133 34 Furusawa S., Wu J (1998), Cepharanthin inhibits proliferation of cancer cells by inducing apoptosis, Methods-Find-Exp-Clin- Phaarmacol, 20, pp 87-97 35 Furusawa Shinobu, Wu Jianghong (2007), The effects of biscoclaurine alkaloid cepharanthine on mammalian cells: Implications for cancer, shock, and inflammatory diseases, Life Sciences, Volume 80, pp 1073–1079 36 Gulcin, I., Elias, R., Gepdiremen, A., Chea, A., Topal, F., 2010 Antioxidant activity of bisbenzylisoquinoline alkaloids from Stephania rotunda: cepharanthine and fangchinoline Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry 25, 44–53 37 Halicka H Dorota, Ita Masamichi, Tanaka Toshiki, Kurose Akira, and Darzynkiewicz Zbigniew (2008), Biscoclaurine alkaloid cepharanthine protects DNA in TK6 lymphoblastoid cells from constitiitive oxidative damage, Pharmacol Rep., 60(1), pp 93-100 38 Hall, A.M., Chang, C.J., 1997 Multidrug resistance modulators from Stephania japonica Journal of Natural Products 60, 1193–1195 39 Harada K., Supriatno, Ymanmoto s., Kawaguchi s., Yoshida H., Sato M (2003), Cepharanthin exerts antitumor activity on oral squamous Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ cell carcinoma cell lines by induction of p27Kipl, Anticancer Res., 23(2B), pp.1441-1448 40 Henry T A (1949), The Plant Alkaloids 4th edition, Ltd., London, pp 282-316 41 Ho, L.J., Chang, D.M., Lee, T.C., Chang, M.L., Lai, J.H., 1999 Plant alkaloid tetrandrine down reg ulates protein kinase C-dependent signaling pathway in T cells European Journal of Pharmacology 367, 389–398 42 Hotta T., Tanimura H (1997), Modulation of multidrug resistance by cepharanthin in fresh human gastrointestinal tumor cells, Oncology, 54, pp 153-157 43 Hu S., Merayo L (1997), Potent inhibitory effects of tetrandrine on experimental allergic conjunctivities in mice, J Ocul-Pharmacol, 13, pp 435-444 44 Hullatti, K.K., Sharada, M.S., 2007 Antimicrobial activity of Cissampelos pareira Cyclea peltata and Stephania japonica methanolic root extracts Advances in Pharmacology and Toxicology 8, 105–108 45 Hung, T.M., Dang, N.H., Kim, J.C., Jang, H.S., Ryoo, S.W., Lee, J.H., Choi, J.S., Bae, K., Min, B.S 2010 Alkaloids from roots of Stephania rotunda and their cholinesterase inhibitory activity Planta Medica PMID: 20391319, in press 46 Ita Masamichi, Halicka H Dorota, Tanaka Toshiki, Kurose Akira, Ardelt Barbara, Shogen Kuslima, and Darzynkiewicz Zbigniew (2008), Remarkable enhancement of cytotoxicity of onconase and cepharanthine when used in combination on various tumor cell lines, Cancer Biol Ther., 7(7), pp 1104-1108 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 Ingkaninan, K., Phengpa, P., Yuenyongsawad, S., Khorana, N., 2006 Acetylcholinesterase inhibitors from Stephania venosa tuber The Journal of Pharmacy and Pharmacology 58, 695–700 48 Jang Byeong-Churl, Lim Ki-jo, Paik Ji-hye, Cho Jae-we, Baek Wonki, Suli Min-ho (2004), Tetrandrine-induced apoptosis is mediated by activation of caspases and PKC-O in U937 cells, Biochemical Pharmacology, vol 67, iss 10, pp 1819-1829 49 Kohno H., Inoue H (1987), Mode of anti-allergic action of Cepharanthine on an experimental model of allergic rhinitis, NipponYakurigaku- Zhasshi, 90, pp 205-211 50 Kobayyashi S., Inaba K (1998), Inhibitory effects of tetrandrine on angiogenesis in adof tetrandrine on 205-211.on an experimental model of allergic rhinitison on various, Biol-Pharm-Bul adof tetrandrine on 51 Kupchan, S.M., Suffness, M.I., White, D.N.J., McPhail, A.T., Sim, G.A., 1968 Isolation and structural elucidation of 4- demethylhasubanonine, a new alkaloid from Stephania hernandifolia Journal of Organic Chemistry 33, 4529–4531 52 Lai J H (2002), Immunomodulatory effects and mechanism of plant alkaloid tetrandrine in autoimmune diseases, Acta Pharmacol Sin., 23(12), pp.1093-1101 53 Likhitwitayawuid, K., Angerhofer, C.K., Chai, H., Pezzuto, J.M., Cordell, G.A., 1993a Cytotoxic and antimalarial alkaloids from the tubers of Stephania pierrei Journal of Natural Products 56, 1468–1478 54 Likhitwitayawuid, K., Angerhofer, C.K., Cordell, G.A., Pezzuto, J.M., Ruangrungsi, N., 1993b Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinoline alkaloids from Stephania errecta Journal of Natural Products 56, 30–38 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 55 Liu, X.J., Wang, Y.F., Zhang, M.Y., 2004 Study on the inhibitory effect of cepharanthine on herpes simplex type virus (HSV-1) in vitro Journal of Chinese Medicinal Materials (Chin) 27, 107–110 56 Liu Yan-Li, Yan Ling-Di, Zhou Pei-Lan, Wu Chun Fu, Gong Ze-Hui (2009), Levo-tetrahydropalmatine conditioned place preference in attenuates rats, oxycodone-induced European Journal of Pharmacology, 602, pp 321-327 57 Mantsch JR, Li SJ, Risinger R, Awad S, Katz E, Baker DA, Yang Z (2007), Levo-tetrahydropalmatine administration and attenuates cocaine-induced cocaine reinstatement in selfrats, Psychopharmacology (Berl), 192, pp 581-591 58 Meng Ling-hua, Zhang Hongliang, Hayward Lariy, Takemura Haruyuki, Shao Rong-Guang, and Porrunier Yves (2004), Tetrandrine induces early G] arrest in human colon carcinoma cells by downregulating the activity and inducing the degradation of G]-S-Specific Cyclin-Dependent kinases and by inđucing p53 and p21, Cancer research, 64, pp 9086-9092 59 Montririttigri, K., Moongkarndi, P., Joongsomboonkusol, S., Chitkul, B., Pattanapanyasat, K., 2008 Apoptotic activity of aporphine from Stephania venosa on human ovarian cancer cells Mahidol University Journal of Pharmaceutical Sciences 35, 52–56 60 Moongkarndi, P., Kosem, N., Luanratana, O., Jongsomboonkusol, S., Pongpan, N., 2004 Antiproliferative activity of Thai medicinal plant extracts on human breast adenocarcinoma cell line Fitoterapia 75, 375–377 61 Muregi, F.W., Chhabra, S.C., Njagi, E.N.M., Lang at-Thoruwa, C.C., Njue, W.M., Orago, A.S.S., 2004 Anti-plasmodial activity of some Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Kenyan medicinal plant extracts singly and in combination with chloroquine Phytotherapy Research 18, 379–384 62 Nagaoka S., Kawasaki S (1987), Bisbenzylisoquinoline alkaloids from S cepharantha and their effects on proliferation of cultured cells from Murine Hair Apparantus, Plant Med., 63, pp 425-428 63 Nakajima, A., Yamamoto, Y., Taura, K., Hata, K., Fukumoto, M., Uchinami, H., Yonezawa, K and Yamaoka, Y (2004), Beneficial effect of cepharanthine on overcoming drug-resistance of hepatocellular carcinoma Int J Oncology, 24，635-645 64 Nawawi, A., Nakamura, N., Meselhy, M.R., Hattori, M., Kurokawa, M., Shiraki, K., Kashiwaba, N., Ono, M., 2001 In vivo antiviral activity of Stephania cepharantha against herpes simplex virus type-1 Phytotherapy Research 15, 497–500 65 Okamoto M., Ono M (2001), Suppression of cytokine production and neural cell death by the anti-inflammatory alkaloid cepharanthine: a potential agent against HIV-1 encephalopathy, Biochem Pharmacol, 747-753 66 Ono M (1997), Positive interaction of bisbenzylisoquinoline alkaloid, cepharanthin, with vinca alkaloid agents agaisnt human tumors, In vivo, 11, pp 233-241 67 Pang, L., Hoult, J.R., 1997 Cytotoxicity to macrophages of tetrandrine, an antisili cosis alkaloid, accompanied by an overproduction of prostaglandins Biochemical Pharmacology 53, 773– 782 68.Pharmacopoeiae of the Peoples Republic of China{ 1997), English Edition Vol II, 173-174 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 69 Pharmacopoeiae of the Peoples Republic of China (2000), English Edition, Vol II, 599 -601 70 Qian, J.Q., 2002 Cardiovascular pharmacological effects of bisbenzylisoquinoline alkaloid derivatives Acta Pharmacologica Sinica 23, 1086–1092 71 Semwal, D.K., Rawat, U., 2009a Antimicrobial hasubanalactam alkaloid from Stephania glabra Planta Medica 75, 378–380 72 Semwal, D.K., Rawat, U., 2009b Gindarudine, a novel morphine alkaloid from Stephania glabra Chinese Chemical Letters 20, 823– 826 73 Semwal, D.K., Rawat, U., Bamola, A., Semwal, R., 2009 Antimicrobial activity of Phoebe lanceolata and Stephania glabra; preliminary screening studies Journal of Scientific Research 1, 662– 666 74 Sharma, U, Sahu, R.K., Roy, A., Golwala, D.K., 2010 In vivo antidiabetic and antioxidant potential of Stephania hernandifolia in streptozotocin-induced-diabetic rats Journal of Young Pharmacists 2, 255–260 75 Sun G., Qi Y., Pan Q (1997), Quantitative analysis of prevention effect of tetrandrine on pancreatic islet beta cells iĩýury in rats, Chung Hua I Hsueh Tsa Chtion effect of tetran 76 Shiraishi N., Akiyama S (1987), Effect of bisbenzylisoquinoline (biscoclaurine) alkoloids on multidrug resistance in KB human cancer cells, Cancer Res, 47, pp 2413-6 77 Sueblinvong, T., Plumchai, T., Leewanich, P., Limpanasithikul, W., 2007 Cytotoxic effects of water extract from Stephania venosa tubers Thai Pharmaceutical and Health Science Journal 2, 203–208 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 78 Takemura, H., Imoto, K., Ohshika, H., Kwan, C.Y., 1996 Tetrandrine as a calcium antagonist Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 23, 751–753 79 Tamatani T., Azuma M., Motegi K., Takamaru N., Kawashima Y., Bando T (2007), Cepharanthine anhanced radiosensitivity through the inhibition of radiation-induced nuclear factor-kB activity in human oral squamous cell carcinoma cells, International Jounranl of Oncology, 31, pp 761-768 80 Teh, B.S., Seow, W.K., Li, S.Y., Thong, Y.H., 1990 Inhibition of prostaglandin and leukotriene generation by the plant alkaloids tetrandrine and berbamine International Journal of Immunopharmacology 12, 321–326 81 Xue, Y., Wang, Y., Feng, D.C., Xiao, B.G., Xu, L.Y., 2008 Tetrandrine suppresses lipopolysaccharide induced microglial activation by inhibiting NF-kappaB pathway Acta Pharmacologica Sinica 29, 245–251 82 Yang, D.L., Mei, W.L., Dai, H.F., 2010a Cytotoxic alkaloids from the tuber of Stephania succifera Chinese Journal of Medicinal Chemistry 20, 206–210 83 Yang, D.L., Mei, W.L., Wang, H., Dai, H.F., 2010b Antimicrobial alkaloids from the tubers of Stephania succifera Zeitschrift für Naturforschung B 65, 757–761 84 Yasukawa, K., Takido, M., Takeuchi, M., Akasu, M., Nakagawa, S., 1991 Cepharanthine inhibits two-stage tumor promotion by 12-Otetradecanoylphorbol 13-acetate and mezerein on skin tumor formation in mice initiated with 7, 12- dimethylbenz[a]anthracene Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 117, 421–424 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 85 Zhang Dei kui, Cheng LiNa, Huang Xiao Li, Shi Wei, Xiang Jun Ying, Gan Hua Tian (2009), Tetrandrine ameliorate dextran-sulfate-sodiuminduced colitis in mice through inhibition of nuclear factor-kB activation, Int J Colorectal Dis.f 24, pp 5-12 86 Zhang, H., Yue, J.M., 2005 Hasubanan type alkaloids from Stephania longa Journal of Natural Products 68, 1201–1207 87 Zhao, Y.Z., Kim, J.Y., Park, E.J., Lee, S.H.,Woo,S.W., Ko, G., Sohn, D.H., 2004 Tetrandrine induces apoptosis in hepatic stellate cells Phytotherapy Research 18, 306–309 88.Zhu X Z, (1991), Development of Natural products as drugs acting on central nervous system, Mem Inst Oswaldo Cruz, 86, pp 173-175 TRANG WEB 89 http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_B%C3%ACnh_v%C3%B4i 90 http://www.duoclieu.org/2012/10/cac-phuong-phap-chung-chiet-xuatalkaloid.html Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC BÀI BÁO ĐÃ CƠNG BỐ Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC PHỔ 1H – NMR, 13c – NMR, HMBC, HSQC, MS – ESI CỦA RT1 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH Trang MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu chi Bình vơi 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Bình vơi 1.1.2 Sinh thái, sinh trưởng phát triển loài Bình vơi 1.1.3 Kỹ thuật nhân giống gây trồng 1.1.4 Năng suất thu hái củ Bình vơi 1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học củ Bình vơi 10 1.2.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học củ Bình vơi giới 10 1.2.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học củ Bình vơi Việt Nam 10 1.3 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học alkaloid phân lập từ số lồi thuộc chi Bình vôiStephania 12 1.4.Hợp chất Rotundin Bình vơi 14 1.4.1 Cấu trúc hóa học 14 1.4.2 Tính chất lí học 15 1.4.3 Tính chất hóa học 15 1.4.4 Tác dụng dược lí Rotundin 16 1.5 Một số sản phẩm thƣơng mại sử dụng Rotundin 18 1.6 Các phƣơng pháp định lƣợng Rotundin 19 1.6.1 Phương pháp kết tủa với AgNO3 [68], [69] 19 1.6.2 Phương pháp chuẩn độ môi trường khan [69] 20 1.6.3 Phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến [3], [68, [69] 20 1.6.4 Phương pháp sắc ký mỏng 20 1.6.5 Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao 21 1.7 Ứng dụng sắc ký lớp mỏng phân tích định lƣợng 21 1.7.1 Phương pháp định lượng sau tách chất khỏi mỏng 22 1.7.2 Các phương pháp định lượng trực tiếp mỏng 22 1.7.3 Các biện pháp xử lý vết mỏng định lượng 23 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp điều tra đánh giá, thu thập xác định tên loài thực vật 25 2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu thực vật 25 2.2.3 Phương pháp chiết alkaloid toàn phần 25 2.2.4 Phương pháp định lượng Rotundin alkaloid toàn phần 25 2.2.5 Các phương pháp hóa lý để nhận dạng cấu trúc 26 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 27 3.1 3.2 27 , vật liệu 27 3.2.1 Thiết bị 27 3.2.2 Hóa chất 28 3.3 Định lƣợng Rotundin củ Bình vơi tƣơi sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning) 29 3.3.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn 29 3.3.2 Chuẩn bị mẫu thử 29 3.3.4 Tính tốn kết 30 3.4 Chiết tách Rotundin từ nguyên liệu củ Bình vơi tƣơi 31 3.5 Xác định tính chất vật lý cấu trúc hóa học Rotundin 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Xác định tên khoa học số lồi Bình vơi thu số tỉnh Việt Nam 34 4.1.1 Stephania sinica Diels thu hái Tây nguyên (ký hiệu BV-TN) 34 4.1.2 Stephania epigaea H S Lo thu hái Hịa Bình (ký hiệu BV-HB) 36 4.1.3 Stephania cephalantha Hayata thu hái Sơn la (ký hiệu BV-SL) 36 4.1.4 Stephania hernadifolia (Willd.) Walp thu hái Hà giang (ký hiệu BV-HG) 37 4.2 Kết xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hợp chất Rotundin củ Bình vơi tƣơi phƣơng pháp sắc ký mỏng kết hợp đo mật độ quang(TLCScanning) 38 4.2.1 Khảo sát tính thích hợp hệ thống 39 4.2.2 Xác định khoảng tuyến tính phương trình hồi qui 40 4.2.3 Độ lặp lại phương pháp 40 4.2.4 Độ phương pháp 41 4.2.5 Giới hạn phát giới hạn định lượng Rotundin 42 4.3 Kết xác định hàm lƣợng Rotundin mẫu Bình vơi theo phƣơng pháp sắc ký mỏng kết hợp đo mật độ quang(TLC-Scanning) xây dựng 43 4.4 Kết chiết tách tinh chế Rotundin từ củ Bình vơi tƣơi thu Sơn La 45 4.4.1 Kết chiết tách alkaloid toàn phần 45 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4.4.2 Kết tinh chế Rotundin từ alkaloid toàn phần 46 4.5 Kết xác định tính chất vật lý cấu trúc hóa học Rotundin phƣơng pháp cộng hƣởng từ chiều hai chiều 48 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 69 BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ 69 PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... tài ? ?Điều tra, thu thập mẫu củ Bình vơi số tỉnh Việt Nam xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Rotundin sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC- Scanning) ” nhằm tìm kiếm, xác định đƣợc lồi Bình. .. ti? ?Rotundin mụ thể nhƣ sau:úp tiết kbằng phƣơng pháp sắc ký lỏng kết hợp đo mật độ quang TLC- Scanning Chianning.g pháp sắcRotundin ttunding.g pháp sắc ký lỏng kết hợp đo c hóa học Rotundin Số. .. phƣơng pháp định lƣợng hợp chất Rotundin củ Bình vơi tƣơi phƣơng pháp sắc ký mỏng kết hợp đo mật độ quang( TLC- Scanning) Chúng tiến hành xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng rotudin củ Bình vơi