TÀI LIỆU TRẮC NGHIỆM, BÀI GIẢNG PPT CÁC MÔN CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT CÓ TẠI “TÀI LIỆU NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT” ;https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC). DÀNH CHO SINH VIÊN CÁC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC VÀ CÁC NGÀNH KHÁC, GIÚP SINH VIÊN HỆ THỐNG, ÔN TẬP VÀ HỌC TỐT KHI HỌC TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC)
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự bùng nổ bệnh nhiễm trùng thường kết tình trạng phơi nhiễm với nguồn lõy Nhìn chung, nguyên gõy bùng nổ bệnh nhiễm trùng hay bắt nguồn từ loại tế bào vi sinh vật riêng lẻ Vì vậy, hệ sau chúng giống gen có quan hệ gần với vi sinh vật bắt nguồn gõy bệnh (source organism) Trong nghiên cứu giai đoạn dịch tễ học, vi sinh vật có liên quan đến bùng nổ dịch có mối liên quan dịng tế bào, tức có nguồn gốc chung Vi sinh vật có liên quan dòng tế bào, thành viên lồi giống nên có chung yếu tố độc lực, đặc điểm sinh hóa đặc điểm gen Tuy nhiên, chủng vi sinh vật phõn lập từ nguồn khác thời điểm địa lý khác đủ khác biệt mức độ loài phõn loại typ (subtype) hay chủng (strain) Quy trình phõn loại typ quan trọng dịch tễ học để xác định bùng nổ bệnh nhiễm trùng, phát lõy truyền chéo nguồn bệnh bệnh viện, xác định nguồn gốc nhiễm trùng, phát chủng vi sinh vật độc lực cụ thể kiểm sốt chương trình tiêm chủng vacxin [32] Phõn loại loài (subtyping) phõn loại chủng thực nhiều phương pháp khác nhau, phương pháp phải có khả đưa tiêu chuẩn chung để dễ dàng sử dụng rộng rói Trong phõn loại loài, tất vi khuẩn loài phải phõn loại nhiều phương pháp khác sử dụng Tuy nhiên, với phương pháp phõn loại dựa theo đặc điểm kiểu hình (phenotype), chẳng hạn như: phương pháp dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể xuất receptor bacteriophage đặc điểm sinh học cụ thể không xuất tất chủng vi khuẩn loài Typ huyết (serotype) xác định xuất dấu ấn huyết học (serological marker) Ví dụ: 10 – 15% chủng Mycobacterium avium khơng có khả định typ huyết chủng khơng ngưng kết với kháng huyết mẫu Tương tự, phương pháp phõn loại theo bacteriopgage thường áp dụng để đánh giá đặc điểm Staphylococcus aureus, số chủng S aureus phõn lập thiếu receptor bacteriophage, khơng thể phõn loại theo phương pháp [25] Một số phương pháp phõn loại lồi có khả phõn biệt (differentiation power) cao nên phõn loại rừ ràng chủng vi khuẩn khơng có mối liên quan với nhau, chẳng hạn khác biệt địa lý nguồn gõy nhiễm trùng [36] Vấn đề quan trọng phương pháp phõn loại lồi phải có độ tái lặp (reproducibility) [36] Độ tái lặp kỹ thuật khả tạo kết lặp lại giống với chủng cụ thể sau nhiều lần thực Độ tái lặp đặc biệt quan trọng để giải thích sở số liệu cách tin cậy phõn loại vi khuẩn, bao gồm chủng chưa biết loài hay chủng chưa biết rừ lồi so sánh để phõn loại Phối hợp với phương pháp xác định khác đặc điểm kiểu hình (phenotypic characteristics), biểu lác đác (sporadic) gen độc lực đặc điểm kháng nguyên góp phần vào việc nõng cao mức đánh giá độ tái lặp [36] Nhiều kỹ thuật sinh học phõn tử dùng để phõn loại (genotype) vi khuẩn dựa phõn tích đoạn ADN với độ dài khác thạch điện di, kết thể tớnh đa dạng mẫu (pattern) băng (band) điện di thạch (gel) Mỗi mẫu băng phức tạp, để thuận tiện cho phõn tích mẫu băng cần phải dựa sở giải thích xác định mối liên hệ Đõy yếu tố hữu ích đánh giá phương pháp phõn loại cụ thể [25][36] Vì vậy, với việc đánh giá mức độ thuận tiện phương pháp phõn loại cụ thể, khả giải thích kết thuận tiện tiến hành kỹ thuật quan trọng Những khó khăn kỹ thuật, giá thời gian thực phải đánh giá việc lựa chọn phương pháp phõn loại cụ thể [24][36] Nhược điểm phương pháp phõn loại dựa kiểu hình nguồn gốc cho phát triển phương pháp phõn loại dựa kiểu gen trình tự ADN Những phương pháp phõn loại dựa cấu trúc ADN có khả giảm tối đa hạn chế có liên quan đến khả phõn loại (typeability) độ tái lặp (reproducibility) Ngoài ra, số trường hợp phương pháp phõn loại dựa vào cấu trúc ADN thiết lập số lượng lớn sở liệu đặc điểm vi khuẩn Vì vậy, tơi thực chun đề: "Một số phương pháp phân loại vi khuẩn dựa cấu trúc ADN ứng dụng nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae" nhằm giải mục tiêu: Xác định nguyên lý, ứng dụng số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa cấu trúc ADN so sánh ưu điểm, nhược điểm phương pháp Ứng dụng phương pháp phõn loại sinh học phõn tử nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae Chương I NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI KHUẨN 1.1 Nguyên lý ứng dụng số kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phân loại vi khuẩn 1.1.1 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): Kỹ thuật điện di trường xung điện (điện di trường điện thay đổi) [1], [2], [3], [25], [35] PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) thường xem "tiêu chuẩn vàng - gold standard" phương pháp sinh học phõn tử dùng phõn loại vi khuẩn Đối với kỹ thuật PFGE, chủng vi khuẩn nghiên cứu nuôi cấy môi trường lỏng mơi trường thạch, sau hịa vi khuẩn vào thạch agarose lỏng đổ vào khuôn nhỏ (small molds), kết miếng thạch sau đổ cắt tạo nút thạch (plugs) nhỏ có chứa tồn tế bào vi khuẩn Vi khuẩn cố định thạch chịu tác dụng enzym ly giải tế bào để giải phóng tồn ADN, ADN vi khuẩn bị giáng hóa tác dụng phõn cắt vị trí đặc hiệu enzym giới hạn Các nút thạch (plugs) chứa ADN sau phõn cắt đặt vào giếng (wells) tương ứng khuôn thạch agarose tiến hành điện di Trong đó, điện di đặt với dòng điện thay đổi khoảng xác định trước cho điện trường phải cho phép đoạn ADN có kích thước lớn khoảng 10 - 800 kb phõn tách rời với Mẫu thạch sau điện di nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide quan sát đốn cực tớm (UV light) Kết phõn tích ADN thạch chụp ảnh số liệu lưu giữ hệ thống kỹ thuật số thương mại, sản phẩm Alpha-Innotech, Bio-Rad, Hitachi Molecular Dyamics Phõn tích số liệu thực sử dụng số phần mềm thương mại sẵn có Applied Math, Bio-Rad, BioSystematics, Bio-numerics, Media Cybernetics Scanalytics Bảng 1.1: Tiêu chuẩn phân loại mức độ liên quan gen chủng vi khuẩn kỹ thuật PFGE [35] Số đoạn ADN (band) khác Mối liên quan Không thể phân biệt (Indistinguishabble) 2-3 Có mối liên quan gần (Closely related) 4-6 Có thể có liên quan (Possbly related) ≥ Khác hoàn toàn (Different) Tenover cộng [35] đưa hệ thống tiêu chuẩn để giải thích mẫu PFGE mối tương quan để xác định liên quan chủng vi khuẩn phân lập Trong đó, chủng vi khuẩn tương ứng tạo mẫu PFGE hoàn tồn giống xem có nguồn gốc từ chủng (Indistinguishabble) Những chủng vi khuẩn phân lập khác xảy biến cố gen, phản ánh khác – băng thạch điện di xem có mối liên quan gần (Closely related) Những chủng phân lập khác – băng thạch điện di xuất biến cố độc lập gen, xem có liên quan với (Possbly related) Những chủng phân lập khác băng nhiều thạch điện di, xuất thay đổi nhiều biến cố độc lập gen, xem khơng có mối liên quan với (Different) Tiờu chuẩn áp dụng đối nghiên cứu địa phương nhỏ, khác biệt gen xem có giới hạn (bảng 1.1) Đối với nghiên cứu lớn, xác định mẫu băng khác thạch điện di vi khuẩn dựa phõn cắt phõn tử ADN enzym giới hạn kỹ thuật PFGE chứng minh tốt so với hầu hết phương pháp dùng phõn loại vi khuẩn dựa tớnh chất sinh hóa hay kỹ thuật sinh học phõn tử khác Kỹ thuật có độ tách biệt (discriminatory) độ tái lặp (reproducibility) tốt so với phương pháp khác dùng để phõn loại vi khuẩn, cụ thể, với loài vi khuẩn: Escherichia coli, Entercocci kháng vancomycin, Staphylococcus aureus, loài Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa Mycobacterium avium [25] Ngồi ra, PFGE có hiệu khả phân biệt (differentiate) chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin so với phương pháp khác PFGE có khả tách biệt tốt so với kỹ thuật Repetitive Element Sequence-base PCR (Rep – PCR) dùng để phõn biệt phức hợp Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter baumannii, Entercocci kháng vancomycin, Neisseria gonnorhoeae Pseudomonas aeruginosa [25] Hiện nay, với giúp đỡ máy tính phần mềm phõn tích kết điện di thạch, PFGE tạo ngõn hàng số liệu mẫu phõn tớch ADN với hầu hết tất loại vi khuẩn Vì vậy, mẫu tạo sở liệu tham khảo, so sánh số chủng để xác định quan hệ phát sinh loài (phylogenetic relationship) Khả phản ánh số báo cáo an toàn thực phẩm, nghiên cứu đưa chấp nhận kỹ thuật này, là: (I) để nõng cao khả giám sát bùng nổ ngộ độc thức ăn vi khuẩn, cần thiết phải thực kỹ thuật ADN fingerprinting (trong đó, PFGE tiêu chuẩn vàng) để xác định nguồn gốc yếu tố gõy nhiễm trùng (II) để thiết lập mạng lưới giúp cho việc so sánh ADN fingerprinting thuận tiện, cho phép lưu giữ trang web thường trực để chia sẻ số liệu cách nhanh chóng [25], [32], [36] Tuy nhiên, yếu tố làm giới hạn việc sử dụng phương pháp PFGE thời gian có liên quan đến hồn thành q trình phõn tích Mặc dù bước thực không phức tạp, thời gian để hoàn thành đến ngày Điều làm giảm khả phõn tích lượng lớn mẫu chủng vi khuẩn 1.1.2 Kỹ thuật Southern blotting RFLP (Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn ADN cắt ngẫu nhiên bới enzym giới hạn) Southern blotting Edward Southern phát minh năm 1975 Kỹ thuật sử dụng nhiều năm để phát xác định có mặt gen (một trình tự gen) gen tế bào sinh vật Eukaryote Prokaryote Để phát gen này, trước hết cần tách chiết ADN gen tế bào, toàn phõn tử ADN phõn cắt enzym giới hạn thành đoạn nhỏ, đoạn ADN nhỏ phõn tách trình điện di thạch agarose Những đoạn ADN sau phõn tách di chuyển từ thạch agarose tới màng nitrocellulose nylon kỹ thuật Southern blotting (Gây biến tính ADN gel dung dịch kiềm, thơng thường NaOH 0,5N; NaCl 1,5N Sau đó, chuyển đoạn ADN từ gel lên màng lai sức mao dẫn) Vị trí đoạn ADN gel giữ nguyên chuyển lên màng lai [1], [2], [3] Acid nucleic gắn màng sau lai với nhiều mẫu dò đánh dấu (labelled probes) có trình tự tương đồng với đoạn gen nghiên cứu, tạo nên phõn tử ADN lai (các mẫu dị đánh dấu với nửa mẫu dị, bao gồm: chất phóng xạ chất có màu với hoạt tớnh enzym chất huỳnh quang với hoạt tớnh enzym) Sau đó, rửa màng lai để loại bỏ mẫu dị thừa, thấm khơ thực ghi hình phóng xạ phim X-quang với chất đánh dấu phóng xạ đo huỳnh quang hay phát xuất màu màng lai tùy theo phương pháp gắn chất đánh dấu sử dụng Phương pháp cổ điển điều chỉnh phù hợp với khả phõn biệt chủng vi khuẩn dựa sở quan sát tớnh đa dạng băng ADN tạo phõn cắt enzym giới hạn vị trí nhận dạng đặc hiệu gen cụ thể từ chủng tới chủng khác Kết băng ADN tạo thạch khác kích thước chủng vi khuẩn khác Vì vậy, kỹ thuật với tên RFLP (restriction fragment length polymorphism) đời với chất xác định đa dạng tự nhiên vị trí có trình tự đặc hiệu nằm gen mà enzym giới hạn có khả nhận diện cắt Kỹ thuật tạo nên đoạn ADN khác phõn biệt điện di đồ, đoạn cắt cũn gọi “dấu võn tay” đặc trưng cho phõn tử ADN Xử lý mẫu ADN cặp enzym giới hạn, gen có cấu trúc khác tạo nên số lượng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, cũn gen hoàn toàn giống tạo nên đoạn cắt giống Bản đồ di truyền kết RFLP có tớnh chớnh xác cao, thường sử dụng nghiên cứu định loại nguồn gốc mức độ tiến hóa lồi sinh vật [1], [2] Trong kỹ thuật RFLP, có đoạn gen (ADN) lai hóa với mẫu dị thấy qua phõn tích RFLP, điều làm đơn giản hóa cho q trình phõn tích mẫu ADN fingerprinting nhiều [25] Những mẫu dò đặc hiệu với gen sử dụng để phõn loại loài vi khuẩn Brucella, Legionella pneumophila Pseudomonas aeruginosa Hơn nữa, ribotyping, dạng khác RFLP – Southern blotting sử dụng mẫu dò bắt nguồn từ gen rARN 16S 23S áp dụng thành công nhiều nghiên cứu để phõn biệt chủng vi khuẩn [25] Kết phõn tích ribotyping cho số lượng nhỏ băng, đơn giản cho phõn tích Tuy nhiên, điều hạn chế khả kỹ thuật việc phõn biệt chủng có mối liên quan gần Tác dụng lên nhiều vị trí gen kỹ thuật Southern blotting áp dụng nghiên cứu phõn loại loài vi khuẩn Grundmann cộng [25] sử dụng phối hợp mẫu dò gen toxA với mẫu dò gen rARN 23S 16S để phõn loại loài Pseudomonas aeruginosa Cả hai mẫu dò sử dụng kỹ thuật RFLP – Southern blotting mang lại thông tin mối liên quan tiến hóa chủng vi khuẩn nghiên cứu Tuy nhiên, khơng có kỹ thuật có khả tách biệt chủng vi khuẩn hiệu kỹ thuật PFGE RFLP – Southern blotting kỹ thuật hữu ích cho nghiên cứu giới hạn phõn loại loài chủng vi khuẩn, kỹ thuật blotting cồng kềnh thay rộng rói kỹ thuật PCR based locus – specific RFLP [25] 1.1.3 Phương pháp PCR based locus – specific RFLP (Kỹ thuật RFLP dựa khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu) PCR có khả khuếch đại cách thông thường đoạn gen đặc hiệu để nghiên cứu khác chủng vi khuẩn khả đề kháng kháng sinh Đoạn gen đặc hiệu sử dụng nghiên cứu khuếch đại primer đặc hiệu sau phõn tích kỹ thuật RFLP Những đoạn ADN sau bị phõn cắt tách biệt thạch agarose gel nhỏ polyacrylamide mẫu gen quan sát, phõn tích sau nhuộm ethilium bromide [1], [2] Kỹ thuật RFLP dựa khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu (locusspecific RFLP) áp dụng nhiều nghiên cứu khác Shortrige cộng sử dụng RFLP để phõn tích gen ureC để chứng tỏ khác chủng Helicobacter pylori Mỹ Vùng gen 16S, 23S vùng đệm 16S-23S sử dụng đích tác dụng kỹ thuật RFLP dựa 10 đoạn gen đặc hiệu (locus-specific RFLP) [25] Trong đó, thay đổi ribotyping, ADN ribosom khuếch đại bị cắt enzym giới hạn Những đoạn ADN bị cắt enzym giới hạn quan sát sau điện di gel thạch Vì vậy, làm giảm bớt nhu cầu kỹ thuật Southern blotting Ribotyping áp dụng thành công cho phõn biệt chủng vi khuẩn thể độ tương đồng cao với operon rARN Một áp dụng kỹ thuật RFLP dựa khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu (locus-specific RFLP), Cockerill cộng xác định đột biến điểm xảy gen katG Mycobacterium tuberculosis dẫn đến mức độ đề kháng khác với isoniazid chủng vi khuẩn phõn lập được, thể qua mẫu RFLP gen khuếch đại sử dụng nghiên cứu Tuy nhiên, khả tách biệt (discriminatory power) kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu (locus-specific PCR) nhìn chung khơng tốt phương pháp khác, trước hết nghiên cứu, kỹ thuật phõn tích vùng giới hạn hệ gen khuếch đại Ví dụ nghiên cứu Kỹhn cộng cho thấy PCR – ribotyping có khả tách biệt nghèo nàn so sánh với kỹ thuật PFGE phương pháp phõn loại theo sinh hóa [25] Tuy nhiên, kỹ thuật RFLP dựa đoạn khuếch đại PCR gen đặc hiệu cho thấy hiệu áp dụng đáng tin cậy số nghiên cứu dịch tễ học virus viêm gan C (HCV) Bằng kỹ thuật này, HCV chia thành genotype chớnh, đánh số từ đến Davison cộng phát triển kỹ thuật đơn giản để xác định genotype HCV dựa khuếch đại PCR phõn tích RFLP đoạn ADN khơng mã hóa nằm gen virus Kỹ thuật sử dụng phương pháp cắt ADN nhiều enzym riêng lẻ HaeIII – RSAI, MvaI - HinfI, BstI ScrFI cho phép tách biệt chủng virus phõn lập vào nhúm 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, RFLP 20 loài vi khuẩn Vùng gen nằm hai gen 16S 23S rARN sử dụng với kết khác Về locus gen đặc hiệu loài phải xác định kiểm tra cách có kinh nghiệm để xem xét locus gen có khả đưa khác biệt chủng Hạn chế phương pháp giải trình tự ADN đối sử dụng để phân loại nhỏ lồi vi khuẩn nấm kích thước đoạn ADN dùng nghiên cứu bắt buộc phải giải trình tự thực tế [25] Ngược lại, giải trình tự ADN xem “tiờu chuẩn vàng” phân loại virus Giải trình tự acid nucleic có khả tách biệt lớn xác định genotype HCV kỹ thuật sinh học phân tử dễ dàng xác định đột biến có liên quan đến kháng thuốc HIV Vùng acid nucleic sử dụng để phân loại virus theo genotype phát đột biến kháng thuốc cú kích thước ngắn, chuỗi acid nucleic rõ ràng, đáp ứng tiêu chuẩn cần thiết cho áp dụng phương pháp giải trình tự acid nucleic 1.2 So sánh ưu điểm, nhược điểm kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phân loại vi khuẩn hướng lựa chọn kỹ thuật sử dụng nghiên cứu [25], [36] Tonover cộng xác định tiêu chuẩn giúp cho việc lựa chọn giải thích phương pháp phân loại sinh học phân tử dùng nghiên cứu dịch tễ học [36] Cho dù phương pháp phân loại cụ thể có độ tách biệt cao, độ lặp lại tốt, phức tạp phương pháp cách giải thích kết giá liên quan đến việc cú xõy dựng hay sử dụng phương pháp hay khơng tùy theo khả phịng xét nghiệm Vì vậy, lựa chọn phương pháp phân loại sinh học phân tử phụ thuộc vào mức độ cần thiết, khả – trình độ kỹ thuật nguồn tài phịng xét nghiệm [25] 21 Bảng 1.2: So sánh ưu điểm, nhược điểm kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phân loại vi khuẩn Phương pháp PCR based PFGE Đặc điểm Tiện lợi sử dụng Giải thích locus – specific RAPD Rep- PCR AFLP RFLP ADN Sequencing Vừa Dễ Dễ Dễ Vừa Khó Dễ Dễ Dễ Dễ Dễ Vừa Cao Trung bình Cao Cao Cao Cao 1 2 Cao Cao Vừa Cao Cao Cao phòng Cao Cao Kém Cao Cao xét nghiệm Giá Trung Cao Cao kết Khả tách biệt Thời gian thực (ngày) Mức độ lặp lại phịng xét nghiệm Mức độ tái lặp bình trang thiết bị Giá mẫu Trung Xét nghiệm bình Trung bình Thấp Trung bình Trung Trung bình bình Thấp Thấp Trung bình Cao Qua tổng kết so sánh, cho thấy phương pháp PCR based locus – specific RFLP, RAPD Rep PCR có quy trình tương tự dễ dàng thực Trong đó, kỹ thuật PFGE cần nhiều thời gian, kỹ thuật lại khụng khú khăn thực quy trình Ngược lại, quy trình giải trình tự gen địi hỏi nhiều trình độ, khả sử dụng thiết bị, phương pháp rủi ro có khả xảy dẫn đến khơng thể giải thích kết Vì dẫn đến khó khăn để thực kết cách đáng tin cậy đòi hỏi người làm phải cú trỡnh độ kỹ thuật cao 22 Những phương pháp khác quan tâm đến cần thiết thiết bị, giá thiết bị giá thành mẫu xét nghiệm Ví dụ, kỹ thuật giải trình tự gen đảm bảo thay đổi tinh vi phát hiện, rào cản lớn giá thành máy giải trình tự gen tự động cao Hơn nữa, phõn loại loài chủng vi khuẩn nấm, thực tế phòng xét nghiệm phải cõn nhắc đến kỹ thuật khác PFGE Rep - PCR Bởi vì, kỹ thuật có khả tách biệt đủ lớn để tạo kết phõn loại loài có độ tin cậy phần xõy dựng hệ thống thiết bị giá thấp cho mẫu xét nghiệm Trong khi, kỹ thuật giải trình tự gen có giá thành thực cho mẫu cao Điều dẫn đến phòng xét nghiệm phải cõn nhắc đến yêu cầu kết mẫu nghiên cứu, cụ thể yêu cầu phõn biệt chủng vi khuẩn đưa để phõn loại Kỹ thuật giải trình tự gen chắn có độ chớnh xác hai chuỗi ADN xác định trình tự Những đặc điểm chớnh phương pháp phõn loại sinh học phõn tử đưa (bảng 1.2) Điều quan trọng để đưa phương pháp phõn loại sinh học phõn tử phù hợp với thực tế phịng xét nghiệm Ngồi ra, tiêu chuẩn khác khơng xem xét đõy, số lượng mẫu phương pháp có khả phõn tích Tiêu chuẩn cho quan trọng số phịng xét nghiệm lõm sàng có liên qua đến nghiên cứu dịch tễ lớn, khả phõn tích số lượng lớn định việc lựa chọn phương pháp Đối với mẫu nghiên cứu có số lượng lớn, kỹ thuật đơn giản với độ tách biệt cao giá thấp Rep - PCR, thích hợp Tuy nhiên, mong muốn giữ kết phõn tích ADN vi sinh vật để làm sở liệu tham khảo kỹ thuật PFGE AFLP lựa chọn ngang phõn loại loài vi khuẩn nấm 23 Hiện nay, nhà nghiên cứu vi sinh đại may mắn có nhiều kỹ thuật khác với khả phõn biệt tốt mức độ phõn tử ADN phõn loại vi sinh vật Những kỹ thuật phù hợp với cần thiết nghiên cứu phòng xét nghiệm nghiên cứu lõm sàng Ngoài ra, số kỹ thuật sinh học phõn tử có khả tạo thư viện tham khảo lớn (cơ sở liệu) vi sinh vật phõn loại Vì vậy, chủng vi sinh vật bùng nổ phát được so sánh chéo phòng xét nghiệm để kiểm soát thay đổi quần thể vi sinh vật Chương II ỨNG DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP 24 PHÂN LOẠI VI KHUẨN DỰA TRÊN CẤU TRÚC ADN TRONG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN HAEMOPHILUS INFLUENZAE 2.1 Kỹ thuật PFGE 2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học Haemophilus influenzae Đối với phõn loại vi khuẩn Haemophilus influenzae từ trước đến chủ yếu dựa vào phương pháp phõn loại chớnh, phõn loại theo typ sinh học (biotype) phõn loại theo typ huyết (serotype) Tuy nhiên, với phát triển công nghệ sinh học ứng dụng phương pháp sinh học phõn tử phõn loại vi khuẩn cho độ phõn biệt cao, đặc biệt kỹ thuật PFGE [8], [12], [22], [23], [26], [33], [38] Những nghiên cứu đặc điểm sinh học phõn tử Haemophilus influenzae có sử dụng kỹ thuật PFGE với mục đích phõn loại theo genotype Enzym giới hạn SmaI thường dùng để phõn tích tồn hệ gen vi khuẩn Với khả nhận diện trình tự 5’-CCCGGG- 3’ có tồn phõn tử ADN cắt vị trí nucleotid C G (hình dưới) cho mẫu phõn tích PFGE với 10-12 đoạn ADN cú kớch thước từ 10-500 kilobases (kb) điện di đồ [36] Qua phõn tích mẫu PFGE thu cho phõn loại genotype chủng Haemophilus influenzae theo đặc thù kỹ thuật PFGE [1], [3], [35] Hình 2.1: Vị trí cắt enzym SmaI - Tại Việt Nam, nghiên cứu Haemophilus influenzae typ b gõy viêm màng nóo mủ đánh giá đặc sinh học phõn tử vi khuẩn dựa phõn loại genotype theo kỹ thuật PFGE Qua phõn tích cho thấy, hầu hết chủng Haemophilus influenzae typ b tập trung số nhúm 25 genotype chớnh Ngoài cũn có nghiên cứu đánh giá, so sánh đặc điểm sinh học phõn tử chủng Haemophilus influenzae typ b gõy viêm màng nóo mủ chủng gõy nhiễm trùng đường hô hấp [4], [26], [35] - Trên giới, có nhiều nghiên cứu đặc điểm sinh học phõn tử chủng Haemophilus influenzae gõy bệnh phõn lập từ người lành thực nhiều quốc gia khác Điển hình nghiên cứu Anna Skoczyn’ska cộng đặc điểm sinh học phõn tử chủng Haemophilus influenzae typ b gõy viêm màng nóo mủ từ năm 1997 đến 2004 Phần Lan kỹ thuật PFGE, cho thấy 233 chủng Hib gõy bệnh xếp vào genotype tất chủng đánh giá có liên quan với (Possibly related) Một nghiên cứu khác Phần Lan, Agnieszka Sulikowska sử dụng kỹ thuật PFGE để đánh giá đặc điểm sinh học phõn tử chủng Haemophilus influenzae phõn lập từ họng mũi (nasopharynge) đứa trẻ theo mùa khác [33] Ngoài ra, cũn nhiều nghiên cứu khác Hi nói chung Hib nói riêng có sử dụng kỹ thuật PFGE, đặc biệt lĩnh vực dịch tễ học [8], [12], [22], [23] 2.1.2 Đánh giá mối liên quan ADN chủng Haemophilus influenzae phân lập xác định nguồn gốc gõy nhiễm trùng Hiện nay, nước giới, nghiên cứu so sánh tương đồng mẫu phõn tích ADN điện di đồ chủng Haemophilus influenzae phõn lập từ nghiên cứu Sau đánh giá tương đồng mẫu ADN chủng vi khuẩn dựa băng (band) ADN điện di đồ đưa mối liên quan chủng vi khuẩn Haemophilus influenzae phõn lập mức độ khác nhau: Không thể phân biệt (Indistinguishable) hay xếp vào nguồn gốc, có mối liên quan gần (Closely related), có liên quan 26 (Possibly related) khác hồn tồn (Different) Vì vậy, đõy kỹ thuật hữu ích nghiên cứu xác định nguồn gốc chủng vi khuẩn gõy bệnh [4], [37] - Tại Việt Nam, dựa vào phương pháp PFGE, Phan Lê Thanh Hương cộng có nghiên cứu xác định Haemophilus influenzae typ b với nguồn lõy mang tớnh gia đình [4] - Trên giới, Nhật Bản Hiroshi Wantanabe cộng cho thấy có lõy truyền chủng Haemophilus influenzae khơng có vỏ đề kháng ampicillin-không sản xuất β-lactamase trẻ em bố mẹ chúng dựa nghiên cứu 15 gia đình [36] Cũng Nhật Bản, nghiên cứu Saito cộng cho thấy lan truyền Haemophilus influenzae typ b từ đứa trẻ mắc viêm màng nóo vi khuẩn sang cho người chăm sóc chưa tiêm vacxin với tỷ lệ cao [29] Ngồi ra, với mục đích này, số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PFGE để đánh giá khác biệt ADN chủng Haemophilus influenzae phõn lập từ nguồn khác Cụ thể, nghiên cứu Patricia Ezekiel Moor cộng khác cấu trúc ADN chủng Haemophilus influenzae typ b phõn lập từ thổ dõn đối tượng thổ dõn Úc [23] 2.1.3 Sử dụng nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng Haemophilus influenzae gây bệnh nhiễm trùng PFGE kỹ thuật đánh giá cơng cụ hữu ích sử dụng nghiên cứu dịch tễ học phõn tử loài vi khuẩn [32], [34], [36] Đối với vi khuẩn Haemophilus influenzae, có nhiều nghiên cứu dịch tễ học phõn tử nhiều khớa cạnh khác Cụ thể, nghiên cứu dịch tễ học phõn tử chủng Haemophilus influenzae phõn lập từ vùng hầu họng trẻ khoẻ mạnh nhà trẻ trại trẻ mồ côi [27], chủng Haemophilus influenzae đề kháng ampicillin không sinh enzym β-lactamase 27 [12] hay chủng Haemophilus influenzae typ b phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo mủ [21] Tất nghiên cứu dựa phõn loại genotype Haemophilus influenzae theo kỹ thuật PFGE kết hợp với đối tượng địa điểm nghiên cứu để đánh giá mặt dịch tễ học [12], [22], [27] 2.2 Kỹ thuật PCR – RFLP Kỹ thuật PCR – RFLP sử dụng nghiên cứu chủng Haemophilus influenzae dựa phõn tớch RFLP đoạn gen đặc hiệu thường dùng với mục đích phõn loại, xác định liên quan chủng vi khuẩn phõn lập [4], [6], [9] Cụ thể, gen thường phõn tích là: - Gen quy định tổng hợp pili (pilin gene: pil), nghiên cứu Tendai Mhlanga cộng cho thấy cấu trúc gen tổng hợp pili (hif) chủng Haemophilus influenzae tương tự với đoạn gen độc lực, có khả truyền ngang (Horizontal gene transfer) loài vi khuẩn (Pathogenicity island) [4] Gen xem có liên quan đến định cư khả gõy bệnh vi khuẩn Haemophilus influenzae [3] Ngoài ra, dựa vào kỹ thuật PCR–RFLP phõn tích gen hif chủng Haemophilus influenzae chia thành nhiều genotyp khác đánh giá mối liên quan genotyp [3] Nghiên cứu khác Kirk W Mc Crea cộng xác định mối liên quan cấu trúc miễn dịch tiểu phần cấu trúc nên pili chủng vi khuẩn Haemophilus influenzae phõn lập Hai gen tổng hợp protein HifD HifE phõn tích, kết cho thấy trình tự nucleotid hai gen HifD HifE tương tự chủng Hib, có thay đổi (khác nhau) nhiều chủng không định typ huyết [4], [21] 28 - Gen quy định tổng hợp protein P1 (Outer Membrane Protein Gene) [6], nghiên cứu Robyn B Reed cộng Haemophilus influenzae nhúm sinh học aegyptius kỹ thuật PCR–RFLP cho thấy kỹ thuật có khả phõn loại có độ chớnh xác nghiên cứu chủng độc lực liên quan đến bệnh sốt xuất huyết Brazil (Brazilian Purpuric Fever: BPF) Ngoài ra, nghiên cứu cũn cho thấy mối liên quan chặt chẽ đặc điểm độc lực với mẫu ADN phõn tích enzym đặc hiệu Alw1 Nghiên cứu đưa tảng cho việc xác định cách chớnh xác thuận tiện chủng Haemophilus influenzae nhúm sinh học aegyptius gõy BPF kỹ thuật PCR–RFLP [6] - Đoạn ADN mã hóa cho yếu tố 16S ribosom [8], đõy đoạn ADN có độ bảo thủ cao nên kỹ thuật PCR – RFLP thường sử dụng chẩn đoán nguyên vi khuẩn gõy viêm màng nóo mủ với enzym giới hạn HaeIII Kết cho thấy Haemophilus influenzae sau phõn tích PCR – RFLP cho mẫu với băng có kích thước 380bp, 270bp, 175bp 135bp [7] 2.3 Kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) dựa lý thuyết khuếch đại ngẫu nhiên đặc hiệu từ đoạn ADN giới hạn tạo enzym giới hạn cắt toàn sợi ADN vi khuẩn Jordans cộng chọn đoạn mồi RAPD để mô tả trước phõn loại Listeria monocytogenes RAPD chứng minh kỹ thuật đơn giản so sánh chủng Hi khơng có vỏ bùng nổ bệnh cách phõn biệt chủng phõn loại theo cấu trúc OMP, tương tự ribotyping RAPD với đoạn mồi khác dùng để phõn biệt chủng Hib có hiệu tương tự MLEE Phương pháp xem tốt cho phõn loại, chưa xác định khả đánh giá mối liên quan 29 chủng vi khuẩn hay xõy dựng phả hệ chủng vi khuẩn phõn lập có liên quan dịch tễ học (phylogenetically relate strains) [40] Về phõn loại chủng Hi theo RAPD, điển hình gần đõy nghiên cứu S Yokota cộng Nhật Bản 2007 sử dụng đoạn mồi khác để phõn loại Hi phõn lập từ bệnh nhi mắc viêm tai giữa, bao gồm: mồi P1 (5'-GGTGCGGGAA-3'), P2 (5'-CTTTCGCTCC-3'), P3 (5'GTAGACCCGT-3'), P4 (5'-AAGAGCCCGT-3'), P5 (5'-AACGCGCAAC-3') P6 (5'-CCCGTCAGCA-3') để khuếch đại ngẫu nhiên đoạn ADN toàn sợi ADN Hi Thêm vào đó, nghiên cứu Toru Kobuta, Futoshi Higa cộng Nhật Bản năm 2006 [19]; A Sharma cộng tai Ấn Độ năm 2002 [30] sử dụng RAPD phân loại vi khuẩn Haemophilus influenzae Qua nghiên cứu có sử dụng kỹ thuật “dấu võn tay” RAPD để phõn loại Haemophilus influenzae cho thấy đõy kỹ thuật cho mức độ tách biệt cao Mồi ngẫu nhiên thường sử dụng với để phõn loại vi khuẩn kỹ thuật RAPD AP1 AP2 Trong đó, mồi AP2 thường sử dụng có độ tách biệt cao (DI: Discriminatory Index) [19], [31] Ngoài ra, số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật RAPD xác định nguồn gốc vi sinh vật gõy bệnh dựa đánh giá phõn loại theo tương đồng ADN chủng vi khuẩn Trên sở vậy, năm 2008 S Yokota cộng đưa kết luận, phần lớn chủng Hi kháng Quinolon phõn lập người 58 tuổi không gặp trẻ nhỏ [42] 2.4 Rep - PCR Các trình tự lặp lại với chức chưa biết tỡm thấy tất gen (genome) vi khuẩn loài prokaryote, chúng bao gồm đoạn xi ngược giống nằm ngồi gen (REP) đoạn tương đồng nằm gen có tớnh lặp lại trực khuẩn đường ruột (ERIC) xác định REP trình tự nguyên thủy bảo tồn với cấu trúc 30 ngược xuôi, nằm đoạn khơng mã hóa phõn bố khắp chromosome Những trình tự xuất nhiều lồi khác nhau, chúng trở thành đích lý tưởng cho PCR ADN chủng Hi khơng có vỏ khuếch đại với primer ERIC đưa khác biệt phức tạp kết PCR fingerprinting 40 chủng vi khuẩn khơng có liên quan dịch tễ học từ bệnh nhõn bị viêm tắc nghẽn đường thở mạn tớnh xơ phế nang Trong nghiên cứu tương tự, PCR với mồi ERIC kết hợp với mồi tùy ý (arbitrary primer), kết tạo số lượng band đồng Kỹ thuật ổn định có độ lặp lại với chứng thu kết liệu đồng từ khuẩn lạc sau cấy chuyển, từ chủng vi khuẩn bệnh nhõn, từ chỉng Hi vỏ suốt q trình dịch bệnh đường hơ hấp Rep - PCR thể kỹ thuật phõn loại genotype có độ phõn giải cao dễ dàng nhanh nghiên cứu dịch tễ, với độ tách biệt tương đương với RFLP phõn loại theo OMP [40] 2.5 Kỹ thuật AFLP Khác với kỹ thuật PFGE, RAPD hay Rep – PCR, nay, nghiên cứu Hi có sử dụng kỹ thuật AFLP Điển hình việc ứng dụng kỹ thuật nghiên cứu Hi, gần đõy AFLP sử dụng phõn loại 87 chủng Hi không định typ huyết phõn lập từ trẻ khỏe mạnh nhà trẻ sống trại trẻ mồ côi miền Nam Ba Lan [5] Kết nghiên cứu cho thấy kỹ thuật AFLP cho mức độ tách biệt cao so với kỹ thuật RAPD phõn loại Hi không định typ huyết 2.6 Kỹ thuật Sequencing Kỹ thuật sequencing thường sử dụng để phõn tích đoạn hay nhúm gen chromosom vi khuẩn Vì vậy, để phõn tích so sánh 31 phõn loại khác biệt chủng vi khuẩn loài, đoạn gen cần phõn tích ln xác định Hiện nay, kỹ thuật sequencing thường áp dụng với nhiều mục đích nghiên cứu Haemophilus influenzae - Phõn loại so sánh mối liên quan chủng H influenzae phõn lập được: nghiên cứu thường sử dụng kỹ thuật sequencing để phõn tích vùng gồm gen đặc trưng loài (housekeeping gene: đõy gen tương đối ổn định, chúng chép tương đối ổn định bất chấp thay đổi điều kiện môi trường tế bào Sản phẩm gen cần thiết cho trì sống tế bào Gen sử dụng tiêu chuẩn nội phản ứng PCR định lượng, gen cho hiện chúng không chịu ảnh hưởng điều kiện môi trường gen mã hóa 16S rARN đánh giá phõn loại, đặc biệt để so sánh mối liên quan chủng H influezae phõn lập Cụ thể, nghiên cứu Alice L Erwin phõn tích mối liên quan gen chủng H influenzae phõn lập phõn loại dựa trình tự hệ thống locus (Multilocus Sequence Typing: MLST) Nghiên cứu này, sử dụng vùng giới hạn (term island) Trong đó, giới hạn (term) khơng có nghĩa locus có khả chuyển từ chủng sang chủng khác vừa có gần đõy Vùng (Island), chức chúng gồm locus gen quy định khả bám H influenzae hmw, hia hif; vùng kế cận infA ksgA chứa locus tham gia tổng hợp lipopolysaccharide (LPS) lic2BC losAB; ba locus quy định tớnh chất sinh hóa định typ sinh học Một số chủng gần đõy giải trình tự, chủng có chứa vùng gen lớn (numerous island) mà không xuất chủng khác Một số nghiên cứu lai hoá (hybridization) xác định vùng khác (other islands) Vùng chắn (certain islands) thông thường xuất nhiều chủng phõn lập từ bệnh nhõn, phõn lập từ người khỏe mạnh Ngoài ra, nghiên cứu Alice L Erwin phõn loại chủng H influenzae phương pháp giải trình tự gen mã hóa 16S rARN, từ 32 đưa so sánh với phương pháp phõn loại dựa trình tự hệ thống locus Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp phõn loại dựa giải trình tự gen mã hóa 16S rARN đa dạng so với phương pháp phõn loại theo trình tự hệ thống locus Xem xét toàn bộ, cõy phả hệ theo phõn loại trình tự 16S khơng có mõu thuẫn với phương pháp phõn tích MLST Tuy nhiên, hầu hết nhánh cõy phả hệ đưa (support) Trước đõy, cho thấy, phương pháp phõn loại dự vào cấu trúc gen 16S hữu ích xác định nguồn gốc củng H influenzae định typ hay không định typ huyết Gần đõy, nghiên cứu cho thấy phương pháp không thực hữu ích MLST xác định mối liên quan phả hệ chủng H influenzae không định typ huyết [11] - Phõn tích khác biệt cấu trúc vỏ polysaccharide chủng Hib dựa khác cấu trúc gen bcs4, hcsA hcsB Hình 2.1: Hình ảnh mơ tả vùng giới hạn (term island) phõn tử ADN H influenzae sử dụng phõn loại theo sequencing Cụ thể, nghiên cứu Leo Schouls cộng Hà Lan cho thấy với chủng Hib gõy bệnh xõm hại nghiên cứu, chủng typ I có trình tự nhúm gen phụ trách tổng hợp vỏ polysaccharide giống nhau, chủng typ II có trình tự khác thường Nghiên cứu cũn cho thấy chủng Hib typ II phõn lập kỷ nguyên chưa có vacxin từ trẻ nhỏ (0 – tuổi), người chưa tiêm vacxin cho thấy bộc lộ vỏ 33 polysaccharide so với typ I Sự bộc lộ vỏ polysaccharide nhiều typ I giúp cho vi khuẩn Hib typ I có lợi so với typ II Kết sau sử dụng vacxin phòng bệnh, chủng Hib typ II nhanh chóng bị loại bỏ khỏi quần thể dõn cư Tuy nhiên, tượng lạ khơng giải thích có gia tăng tượng thất bại vacxin [11], [13], [30], [37], [43] - Xác định đột biến gen Hib: + Xác định đột biến kháng thuốc: điển hình kỹ thuật sequencing dùng giải trình tự vùng gen ftsI mã hố transpeptidase có vai trò tổng hợp penicillin – binding protein (PBP) 3A PBP 3B, qua phõn tích trình tự vùng gen xác định đột biến dẫn đến sai khác acid amin tổng hợp Vì vậy, cấu trúc PBP thay đổi dẫn đến tượng đề kháng kháng sinh nhúm β−lactam [17], [19] Ngoài ra, nghiên cứu chế đề kháng kháng sinh nhúm Quinolon H influenzae đột biến gen gyrA, gyrB, parC parE [42] + Xác định đột biến gen gõy thay đổi phõn tử protein cấu trúc tế bào vi khuẩn Hib Cụ thể, số nghiên cứu xác định đột biến gen ompP2 (Outer membrane protein) dẫn đến thay đổi cấu trúc phõn tử protein porin nằm màng ngồi tế bào vi khuẩn Hib, có vai trị thẩm thấu chọn lọc chất [14] Ngồi ra, xác định trình tự thay đổi cấu trúc gen quy định tổng hợp protein pili Hib, đõy cấu trúc giúp cho vi khuẩn bám vào vùng hầu họng công gõy bệnh nhiễm trùng xõm hại [33] KẾT LUẬN 34 Phõn loại phần quan trọng nghiên cứu vi sinh vật Phõn loại vi khuẩn phương pháp ln thực với mục đích xác định nguồn gốc bệnh nhiễm trùng hay đặc điểm dịch tễ học chủng vi khuẩn gõy bệnh phõn lập Phương pháp phõn loại vi sinh vật dựa cấu trúc phõn tử ADN khắc phục phần lớn nhược điểm phõn loại theo đặc điểm kiểu hình cổ điển Tuy nhiên, phương pháp phõn loại có nhược điểm định, phức tạp thực kỹ thuật chi phí cao cho đầu tư trang thiết bị hóa chất cho mẫu xét nghiệm Qua nghiên cứu, đánh giá phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa cấu trúc phõn tử ADN, kỹ thuật giải trình tự gen có độ chớnh xác hai chuỗi ADN xác định trình tự Tuy nhiên, phương pháp phõn loại kỹ thuật giải trình tự thường thực đoạn ADN ngắn phải thỏa đủ điều kiện nghiêm ngặt trình giải trình tự nên khả phõn biệt chủng vi khuẩn số trường hợp cụ thể khơng cao Vì vậy, kỹ thuật PFGE, Rep – PCR AFLP sử dụng để phõn tích tồn cấu trúc ADN (chromosome) vi khuẩn nên có khả phõn biệt đủ lớn để tạo kết phõn loại lồi có độ tin cậy Ngồi ra, phương pháp này, phần xõy dựng hệ thống thiết bị giá thấp cho mẫu xét nghiệm Một số phương pháp phõn loại dựa cấu trúc phõn tử ADN như: sequencing, PFGE, Rep – PCR, AFLP, PCR based locus – specific RFLP RAPD áp dụng nghiên cứu H influenzae Tuy nhiên, kỹ thuật phõn loại PFGE đánh giá phương pháp thường sử dụng nghiên cứu dịch tễ học hay xác định nguồn gốc H influenzae, đặc biệt H influenzae typ b ... phương pháp phõn loại dựa vào cấu trúc ADN thiết lập số lượng lớn sở liệu đặc điểm vi khuẩn Vì vậy, tơi thực chun đề: "Một số phương pháp phân loại vi khuẩn dựa cấu trúc ADN ứng dụng nghiên cứu. .. cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae" nhằm giải mục tiêu: Xác định nguyên lý, ứng dụng số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa cấu trúc ADN so sánh ưu điểm, nhược điểm phương pháp Ứng dụng phương pháp. .. LOẠI VI KHUẨN DỰA TRÊN CẤU TRÚC ADN TRONG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN HAEMOPHILUS INFLUENZAE 2.1 Kỹ thuật PFGE 2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học Haemophilus influenzae Đối với phõn loại vi khuẩn Haemophilus