Xây dựng quy trình sản xuất nấm linh chi bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM TIẾN DŨNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP NI CẤY DỊCH THỂ Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Bích Thùy TS Nguyễn Văn Giang NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Tiến Dũng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Bích Thùy TS Nguyễn Văn Giang – Bộ môn Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công Nghệ Vi Sinh, Khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Lãnh đạo, cán viên chức Trung tâm Đào tạo, Nghiên cứu Phát triển Nấm, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Tiến Dũng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Danh mục biểu đồ, sơ đồ ix Trích yếu luận văn x Thesis abstract xii Phần mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Phạm vi nội dung nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi thời gian 1.3.3 Địa điểm nghiên cứu: 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Khái quát chung nấm linh chi 2.1.1 Phân loại học phân bố 2.1.2 Giải phẫu hình thái thể nấm linh chi 2.1.3 Giá trị dược liệu nấm linh chi 2.1.4 Sinh trưởng phát triển nấm linh chi ganoderma lucidum 2.2 Công nghệ sản xuất nấm ăn nấm dược liệu phương pháp nhân giống nấm dạng dịch thể 13 2.2.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống nấm dịch thể giới 13 iii 2.2.2 Nghiên cứu nhân giống nấm dạng dịch thể việt nam 17 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 19 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 19 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 3.1.2 Vật liệu có nguồn gốc tự nhiên 19 3.1.3 Hóa chất vật tư 19 3.1.4 Trang thiết bị sử dụng thí nghiệm 19 3.2 Nội dung nghiên cứu .19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20 3.3.2 Phương pháp chuẩn bị mơi trường điều kiện thí nghiệm 25 3.3.3 Phương pháp theo dõi đánh giá 26 3.3.4 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 29 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 30 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng dịch thể tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 30 4.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng ph môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 30 4.1.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dịch chiết tự nhiên tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 34 4.1.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng carbon tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 35 4.1.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng nitrogen tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 37 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chế độ nuôi tới sinh trưởng hệ sợi giống nấm linh chi môi trường dinh dưỡng dịch thể 40 4.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chế độ lắc 40 4.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chế độ sục khí 41 4.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi 44 4.3 Kết nghiên cứu sử dụng giống nấm linh chi dạng dịch thể 46 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi nuôi cấy dịch thể 46 iv 4.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tuổi giống tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi nuôi cấy dịch thể 49 4.4 Kết nghiên cứu nuôi trồng nấm linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể 50 4.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nguồn giống nguyên liệu nuôi trồng đến sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi suất nấm linh chi 50 4.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng lượng giống thương phẩm đến sinh trưởng nấm linh chi nguyên liệu nuôi trồng 53 4.5 Kết xây dựng quy trình sản xuất nấm linh chi phương pháp nhân giống dạng dịch thể 54 Phần Kết luận kiến nghị 59 5.1 Kết luận 59 5.2 Kiến nghị 59 Tài liệu tham khảo 60 Phụ lục 63 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CNM Cao nấm men CT Công thức CTĐC Cơng thức đối chứng CV% Sai số thí nghiệm g Gram KLC Khuẩn lạc cầu LSD0.05 Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% MTĐC Môi trường đối chứng PG Potato glucose QTCN Quy trình cơng nghệ SKS Sinh khối sợi T Thời gian TB Trung bình TN Thí nghiệm V/V/M Lít khơng khí/lít mơi trường/phút vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại học nấm Linh chi Bảng 2.2 Lục bảo Linh chi tác dụng trị liệu Bảng 4.1 Kết ảnh hưởng pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến đặc điểm sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 31 Bảng 4.2 Kết ảnh hưởng pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến sinh khối hệ sợi nấm Linh chi 33 Bảng 4.3 Kết ảnh hưởng dịch chiết tự nhiên đến đặc điểm sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 34 Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng glucose đến đặc điểm sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 36 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng cao nấm men đến đặc điểm sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 37 Bảng 4.6 Kết ảnh hưởng chế độ lắc đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 40 Bảng 4.7 Ảnh hưởng chế độ sục khí đến sinh trưởng giống dịch thể (cho bình lên men dung tích 2lit) 42 Bảng 4.8 So sánh hiệu ni lắc ni sục khí 44 Bảng 4.9 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 45 Bảng 4.10 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ giống đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 47 Bảng 4.11 Ảnh hưởng nguyên liệu nuôi trồng nguồn giống đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 52 Bảng 4.12 Ảnh hưởng ngun liệu ni trồng đến hình thành thể nấm Linh chi 53 Bảng 4.13 Ảnh hưởng lượng giống cấy đến sinh trưởng nấm Linh chi nguyên liệu nuôi trồng 54 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái giải phẫu thể nấm Linh chi Hình 2.2 Chu kỳ sinh trưởng phát triển nấm Linh chi 10 Hình 4.1 Hệ sợi nấm Linh chi nuôi tĩnh sau 10 ngày ni cấy 32 Hình 4.2 Ảnh hưởng cao nấm men tới sinh trưởng hệ sợi Linh chi 38 Hình 4.3 Hệ sợi nấm Linh chi sau 10 ngày ni cấy bình sục khí 41 Hình 4.4 Sinh trưởng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống khác 51 viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Biểu đồ 4.1 Kết ảnh hưởng dịch chiết tự nhiên đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 35 Biểu đồ 4.2 Kết ảnh hưởng hàm lượng glucose môi trường dinh dưỡng dịch thể đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 36 Biểu đồ 4.3 Kết ảnh hưởng hàm lượng cao nấm men môi trường dinh dưỡng dịch thể đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 38 Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng thành phần Pepton môi trường dinh dưỡng dịch thể đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 39 Biểu đồ 4.5 Đường cong sinh trưởng nấm Linh chi 46 Biểu đồ 4.6 Kết ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 48 Biểu đồ 4.7 Kết ảnh hưởng tuổi giống đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 49 Sơ đồ 4.1 Quy trình công nghệ sản xuất nấm Linh chi phương pháp nhân giống dạng dịch thể 55 ix Kết thu tiến hành nghiên cứu cho thấy: Sử dụng giống giai đoạn từ đến ngày tuổi cho kết tốt, lượng sinh khối sợi đạt 7,2 – 7,4 g/1000ml dịch nuôi; Hệ sợi phát triển đồng đều, khuẩn lạc cầu trịn đều, có gai tua xung quanh;Mầu sắc khuẩn lạc cầu trắng đục đồng Từ kết thu được, lựa chọn dùng giống ni ngày tuổi để tiến hành thí nghiệm 4.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG NẤM LINH CHI SỬ DỤNG NGUỒN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ 4.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nguồn giống nguyên liệu nuôi trồng đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi suất nấm Linh chi Nuôi trồng nấm Linh chi song song đồng thời sử dụng nguồn giống dịch thể với nguồn giống rắn hạt thóc nhằm so sánh khẳng định ưu quy trình cơng nghệ sản xuất nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dịch thể với đối chứng quy trình cơng nghệ sản xuất Linh chi sử dụng nguồn giống thể rắn; thí nghiệm thực điều kiện, với tiêu chuẩn giống nấm đưa vào sử dụng sau: Tiêu chuẩn giống dạng hạt đưa vào sử dụng: Giống nhân chất hạt thóc, đóng chai thủy tinh khối lượng 300 gam/chai; Giống sử dụng độ tuổi, hệ sợi mọc kín đáy chai giống chưa xuất mầm thể bề mặt chai thành chai; Sinh lực giống khỏe: hệ sợi trắng muốt, màu sắc đồng nhất, khả phục hồi nhanh sau q trình bảo quản, khả thích ứng cao với môi trường dinh dưỡng nuôi trồng; Giống nấm không bị nhiễm mốc, nhiễm khuẩn Tiêu chuẩn giống dạng dịch thể đưa vào sử dụng: Giống dạng dịch thể ni bình lên men lít có sục khí, thời gian ni ngày; trước đưa sử dụng kiểm tra độ khiết giống, đảm bảo giống không nhiễm khuẩn, nhiễm mốc, sinh lực giống khỏe Giống dạng dịch có màu vàng đậm mơi trường nhân giống; dịch ni trong, có mùi thơm đặc trưng nấm Linh chi, không phân tầng, mật độ KLC dày đặc, sinh khối sợi đạt 0,7 – 0,8 g/100 ml giống dịch thể; kích cỡ khuẩn lạc 50 cầu đồng đạt từ 1,2 – 1,5mm, soi kiểm tra xung quanh bề mặt khuẩn lạc cầu thấy sợi nấm phân nhánh dày tạo thành dạng tua gai xung quanh khuẩn lạc cầu, pH dịch nuôi đạt ± 0,2 Việt Nam có nguồn nguyên liệu phong phú để ni trồng nấm nói chung ni trồng nấm Linh chi nói riêng Hiện mùn cưa sử dụng làm mơi trường giá thể để nơi trồng Tuy nhiên, mùn cưa nguyên liệu nghèo chất dinh dưỡng, kích cỡ mịn, để nâng cao hiệu suất nuôi trồng nấm rút ngắn thời gian ni trồng cần thiết phải trộn thêm nhiều chất bổ sung Chất bổ sung chủ yếu thường cám gạo, cám ngô, bột đậu tương,… Các nguyên liệu cung cấp chất cần thiết cho hệ sợi nấm sinh trưởng nhanh.Nguyên liệu môi trường sống, ảnh hưởng xun suốt vịng đời nấm nói chung, thí nghiệm chúng tơi tiến hành bổ sung trấu với hàm lượng khác nhằm tang độ xốp cho giá thể sử dụng nguồn giống nấm (giống thể rắn giống thể dịch) để cấy giống nấm Linh chi công thức phối trộn khác nhau, nuôi sợi điều kiện tối ưu (nuôi sợi điều kiện nhiệt độ 26 ± 10C) b Sử dụng giống dịch thể a Đối chứng sử dụng giống thể rắn Hình 4.4 Sinh trưởng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống khác 51 Số liệu Bảng 4.11 cho thấy công thức CT9.1 (ĐC): 84% mùn cưa + 10 cám gạo + 5% bột ngô + 1% CaCO3 sử dụng nguồn giống cấy giống truyền thống ( thể rắn) giống dịch thể hệ sợi nấm Linh chi sinh trưởng chậm nhất, thời gian mọc kín nguyên liệu bịch tương ứng 32-25 ngày Các công thức bổ sung trấu có thời gian hệ sợi sinh trưởng nhanh hơn, tỷ lệ trấu cao thời gian mọc sợi Linh chi ngắn nguồn giống nấm; cao công thức CT9.4 (bổ sung 15% trấu) Tuy nhiên, trấu có hàm lượng dinh dưỡng kém, khả giữ ẩm không tốt, chúng tơi bổ sung tới tỷ lệ tối đa 15%, kết quan trọng để định chọn tỷ lệ bổ sung phụ thuộc vào yếu tố quan trọng suất sinh khối nấm So sánh việc sử dụng giống dịch thể giống truyền thống để nuôi trồng, nhận thấy tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dịch thể để cấy nhanh giống truyền thống khoảng 7-9 ngày tùy theo công thức Tỷ lệ nhiễm công thức nghiên cứu sử dụng giống dịch thể thấp sử dụng giống truyền thống Bảng 4.11 Ảnh hưởng nguyên liệu nuôi trồng nguồn giống đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi Giống Giống nấm Linh chi dịch thể Giống nấm Linh chi thể rắn CT Chỉ tiêu Thời gian mọc kín bịch (ngày) CT9.1 25 CT9.2 23 Thời gian tạo mầm thể (ngày) 28 27 Tỷ lệ nhiễm (%) 9,3 8,4 CT9.3 20 24 8,8 CT9.4 CT9.1 18 32 22 29 8,5 10,6 CT9.2 30 27 9,8 CT9.3 28 25 9,3 CT9.4 27 23 8,8 Kết thúc giai đoạn nghiên cứu ảnh hưởng nguồn giống nguồn nguyên liệu đến sinh trưởng hệ sợi, tiếp tục theo dõi khả hình thành, phát triển thể nấm Linh chi điều kiện nhiệt độ 25- 280C, cường độ ánh sáng 800 – 1000 lux, độ ẩm khơng khí 85-90% (Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh, 2000) Kết theo dõi khả hình thành, phát triển thể nấm trình bày Bảng 4.12 52 Bảng 4.12 Ảnh hưởng ngun liệu ni trồng đến hình thành thể nấm Linh chi Công thức T phát triển thể (ngày) Kích thước dọc mũ nấm (cm) Kích thước ngang mũ nấm(cm) Khối lượng trung bình thể khô (g) Năng suất nấm khô (%) Giống 9.1 46 6,56 11,38 16.6±1.0 29.6 nấm 9.2 44 7,88 12,65 18.4±1.6 31.4 Linh chi 9.3 43 7,14 12,02 17.5±1.5 30.9 dịch thể 9.4 42 6,22 11,08 15.7±1,3 27.6 Giống 9.1 80 5,96 10,58 15.9±0.8 27.2 nấm 9.2 73 7,08 11,98 17.3±1.5 29.5 Linh chi 9.3 68 6,94 11,42 16.5±1.4 28.8 thể rắn 9.4 65 6,02 10,98 14.2±1.2 26.3 Giống Khả hình thành thể tiêu chí quan trọng, có ý nghĩa định đến suất nấm ăn, nấm dược liệu nói chung nấm Linh chi nói riêng Việc sử dụng nguồn giống, nguồn nguyên liệu, biện pháp kỹ thuật phù hợp giúp nấm sinh trưởng tốt, làm tăng khả hình thành mầm thể thể trưởng thành Ở tất công thức nghiên cứu, nấm Linh chi nuôi trồng từ nguồn giống dịch thể cho thời gian thu thể (tính từ lúc nảy mầm đến lúc thu hái) có thời gian ngắn từ 23 đến 34 ngày so với nấm Linh chi sử dụng nguồn giống thể rắn, tùy theo công thức nguyên liệu Các tiêu nghiên cứu cho thấy, với nguồn giống dịch thể, công thức CT9.2 cho hiệu cao Như vậy, công thức nguyên liệu để nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể xác định theo công thức CT9.2: 79% mùn cưa + 5% trấu + 10% cám gạo + 5% bột ngô + 1% CaCO3 4.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng lượng giống thương phẩm đến sinh trưởng nấm Linh chi nguyên liệu nuôi trồng Giống dịch thể cấy sang nguyên liệu nuôi trồng thể rắn, lượng giống cấy ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ sinh trưởng sợi nấm Giống dịch thể có ưu 53 sức sống giống khỏe, khả phân tán tốt, thấm sâu vào nguyên liệu nuôi trồng, tạo nhiều điểm nảy mầm Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng nguồn giống trung gian để cấy Lượng giống cấy vào bịch nguyên liệu theo định mức khác nhau: 10ml; 15ml; 20ml; 25ml; 30ml cấy cho bịch nguyên liệu Bảng 4.13 Ảnh hưởng lượng giống cấy đến sinh trưởng nấm Linh chi nguyên liệu nuôi trồng Lượng Tỷ lệ T sợi sinh T xuất Năng suất nấm giống (ml) nhiễm trưởng kín giá thể khô(%) bệnh (%) thể (ngày) (ngày) 10 9,6 25 29 24,3 15 7,2 22 26 32,9 20 5,6 21 25 33,4 25 5,6 20 24 33,5 30 5,4 20 24 33,5 Kết theo dõi đánh giá thể qua Bảng 4.13, cho thấy, tăng lượng cấy giống theo cơng thức tỷ lệ nhiễm bệnh giảm, hệ sợi nhanh chóng ăn kín bịch nấm sớm cho thể hơn; kết thu sinh khối thể cho thấy suất thể khô tăng Tuy nhiên, tăng lượng cấy giống đến giới hạn số khơng tăng rõ rệt Điều cho thấy, lượng cấy giống đủ lớn, hệ sinh khối sợi chất nuôi phát triển thuận lợi đến giới hạn định lượng giống tăng lên làm tăng mức độ cạnh tranh dinh dưỡng nội nên sinh khối sợi khơng tăng Như vậy, kết thí nghiệm xác định được, với lượng cấy giống 20ml/bịch hiệu ni trồng cao 4.5 KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ Từ kết nghiên cứu nhân giống nấm Linh chi dạng dịnh thể kết nghiên cứu nuôi trồng Linh chi chất tổng hợp sử dụng nguồn giống dịch thể, đề xuất quy trình sản xuất nấm Linh chi phương pháp nhân giống dạng dịch thể sau: 54 Công thức môi trường: 300g/l Khoai tây + 20g/l Glucose + 3g/l Cao nấm men + Nước cất bù đủ định mức pha chế Nhiệt độ nuôi: 26oC  Điều kiện pH = Tốc độ lắc 120 vòng/phút Tỷ lệ giống cấy: 4% thể tích Thời gian ni: ngày Giống gốc ngày Giống cấp Công thức môi trường: 300g/l Khoai tây + 20g/l Glucose + 3g/l Cao nấm men + Nước cất bù đủ định mức pha chế Nhiệt độ nuôi: 26oC  Điều kiện pH = Lưu lượng sục khí: 0,5 V/V/M Tỷ lệ giống cấy: 4% thể tích Thời gian nuôi: Giống trung gian 45 - 46 ngày Nuôi trồng Công thức nguyên liệu: 79% mùn cưa + 5% trấu + 10% cám gạo + 5% bột ngô + 1% CaCO3 Khối lượng bịch nguyên liệu: 1,4 kg/bịch Tuổi giống sử dụng: ngày tuổi Lượng cấy: 20 ml/bịch Thời gian nuôi sợi: 23 ngày Thời gian nuôi thể: 44 ngày Sơ đồ 4.1 Quy trình cơng nghệ sản xuất nấm Linh chi phương pháp nhân giống dạng dịch thể BƯỚC 1: NHÂN GIỐNG NẤM LINH CHI GA-1 TRUNG GIAN CẤP DẠNG DỊCH THỂ S1.1 Chẩn bị môi trường nhân giống nấm Linh chi Ga-1cấp Chuẩn bị nguyên liệu cho lít môi trường: 300g/l Khoai tây + 20g/l Glucose + 3g/lCao nấm men + Nước cất bù đủ định mức1000ml dịch thể 55 Điều chỉnh pH môi trường mức Đổ mơi trường vào bình tam giác 500ml, bình chứa 200ml môi trường; khử trùng môi trường nhiệt độ 1210C thời gian 90 phút; để nguội môi trường, chuyển vào phòng cấy giống S1.2 Cấy giống nấm Linh chi Ga-1cấp Chuẩn bị giống gốc: Giống gốc nấm Linh chi Ga-1đạt tiêu chuẩn Chuẩn bị nước cất: chai tam giác chứa 100ml nước cất, hấp khử trùng để nguội (cùng với mơi trường) Chuyển tồn giống gốc cho vào chai nước cất khử trùng trên, xay nát toàn giống gốc máy xay bình vơ trùng, dùng pipet vơ trùng hút 30ml dịch giống xay cho vào chai tam giác có chứa mơi trường Tất q trình thực BOX cấy, dụng cụ khử trùng S1.3 Nuôi giống nấm Linh chi Ga-1cấp Chuyển bình giống cấy vào máy lắc, điều chỉnh nhiệt độ 250C±1; tốc độ lắc 120 vòng/ phút Định kỳ theo dõi biến đổi giống nấm, sau 12 tiếng kiểm tra lần (kiểm tra màu sắc, mùi giống, thấy có thay đổi cần loại bỏ ngay) Thời gian nuôi giống nấm Linh chi Ga-1cấp 1kéo dài khoảng 120 (5 ngày nuôi) Giống nấm đạt tiêu chuẩn: dịch giống có màu trong, nhiều khuẩn lạc cầu (KLC) nhỏ li ti trông dạng huyền phù xen lẫn KLC có kích thước trung bình khoảng 1,2 mm; Giống có mùi thơm đặc trưng giống nấm Linh chi Ga-1, kiểm tra kỹ vành giống bám thành chai khơng thấy có màu lạ BƯỚC 2: CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG NẤM LINH CHI GA-1 CẤP DẠNG DỊCH THỂ S2.1 Chẩn bị môi trường nhân giống nấm Linh chi Ga-1cấp Chuẩn bị ngun liệu cho lít mơi trường: 300g/l Khoai tây + 20g/l Glucose + 3g/l Cao nấm men Các hóa chất cịn lại hịa tan 1000ml nước cất; trộn dung dịch môi trường; điều chỉnh pH= Đổ mơi trường vào bình Duran 5000ml; bình chứa 3000ml mơi trường Bình mơi trường có lắp nắp chun dụng (có ống dẫn khí ống dẫn khí vào, ống để cấy giống) Các đầu ống dẫn bịt kín Khử trùng mơi trường nhiệt độ 1210C; thời gian 90 phút; Để nguội môi 56 trường, chuyển vào phòng cấy giống S2.2 Cấy giống nấm Linh chi Ga-1 cấp Chuẩn bị giống gốc: Giống cấp nấm Linh chi Ga-1đạt tiêu chuẩn Chuẩn bị màng lọc khí midisart kích thước 0,02µm, màng vơ trùng; loại màng lọc khử trùng nồi hấp Dùng pipet vô trùng hút bơm giống cấp vào bình có chứa mơi trường; tỷ lệ giống cấy 4% thể tích Lắp màng lọc khí vào ống dẫn khí vào, đầu lắp khơng Tất trình thực BOX cấy, dụng cụ khử trùng S2.3 Nuôi giống nấm Linh chi Ga-1 cấp Chuyển bình giống cấy vào phịng ni nhiệt độ 260C ± 1, lắp đầu màng lọc vào ống dẫn với điều chỉnh khí, điều chỉnh lưu lượng khí cấp vào bình để bọt khí khơng tràn Định kỳ theo dõi biến đổi giống nấm, sau 12 tiếng kiểm tra lần (kiểm tra màu sắc, mùi giống, thấy có thay đổi cần loại bỏ ngay) Thời gian nuôi giống nấm Linh chi Ga-1cấp kéo dài khoảng 120 Giống nấm đạt tiêu chuẩn: dịch giống có màu trong, nhiều khuẩn lạc cầu (KLC) nhỏ liti xen lẫn KLC có kích thước trung bình khoảng 1,2 mm; Các KLC khơng kết dính Giống có mùi thơm đặc trưng giống nấm Linh chi Ga-1, kiểm tra kỹ vành giống bám thành bình khơng thấy có màu lạ; ống khí khơng có mùi chua, ngừng sục khí 24 nhiều sợi trắng kết bề mặt dịch BƯỚC NUÔI TRỒNG NẤM LINH CHI TRÊN CƠ CHẤT TỔNG HỢP S3.1 Xử lý nguyên liệu chất tổng hợp Chuẩn bị: Bông nút, cổ nút chịu nhiệt, túi nilon chịu nhiệt, mùn cưa (cao su, ), phụ gia khác (bột nhẹ, ), nước (nước sinh hoạt ăn, uống hàng ngày) Phương pháp đóng túi:Mùn cưa tạo ẩm ủ đống ngày; sau phối trộn thêm với phụ gia để đóng vào túi nilon theo kích thước cho khối lượng túi đạt 1,2 - 1,4kg đưa vào trùng Phương pháp trùng:thanh trùng nồi áp suất (Autoclave) trì nhiệt độ 1210C 150 phút; sau chuyển vào phịng để nguội chờ cấy giống S3.2 Cấy giống dịch thể lên chất tổng hợp Chuẩn bị giống dịch thể trung gian đủ tiêu chuẩn giống, độ tuổi giống ngày tuổi 57 Cấy giống thực tủ cấy vô trùng, lượng giống cấy 20 ml dịch thể giống/bịch ngun liệu S3.3 Ni trồng, chăm sóc thu hái nấm Ươm sợi Nhà ươm sợi phải đảm bảo yêu cầu nhiệt độ 20-300C, độ ẩm từ 75% đến 85%, ánh sáng yếu, thơng thống Nhà ươm chuẩn bị xong chuyển lớp đặt nhẹ nhàng giàn giá xếp thành luống, giàn luống có lối thoáng, khoảng cách túi 2-3cm Trong thời gian ươm khơng tưới nước, vị trí nấm không dịch chuyển nhiều nơi Khi sợi nấm phát triển thấy có túi bị nhiễm cần phải loại bỏ khỏi khu vực ươm giống tìm nguyên nhân để khắc phục: Chăm sóc Nhà trồng nấm phải đảm bảo sẽ, thơng thống, chống mưa dột chủ động điều kiện sinh thái sau: kín gió; ánh sáng chia từ phía, phù hợp với ánh sáng đọc sách; độ ẩm khơng khí đạt từ 80-90%; nhiệt độ thích hợp nấm mọc dao động từ 220C đến 280C Cần tiến hành tưới nước nhà từ đến 10 ngày đầu , đảm bảo độ ẩm 80-90%, thơng thống vừa phải Khi thể nấm bắt đầu mọc lên qua nút bơng ngồi việc tạo ẩm khơng khí, tưới phun sương nhẹ vào túi nấm từ 1-3 lần ngày (tuỳ theo điều kiện thời tiết) Chế độ chăm sóc trì liên tục thu hái nhìn thấy viền trắng vành mũ thể khơng cịn Thu hái Dùng kéo dao sắc cắt chân nấm sát bề mặt túi Quả thể nấm sau thu hái vệ sinh sẽ, nấm phơi khô sấy nhiệt độ 40 - 450C Độ ẩm nấm khô 13%, với tỷ lệ 3kg tươi cho kg khô Đợt vừa thu hoạch xong tiến hành chăm sóc lúc ban đầu kịp thu đợt 2./ 58 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Kết nghiên cứu đề tài sau: a Điều kiện tối ưu môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể ni cấy giống nấm Linh chi có cơng thức môi trường: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 3g/l cao nấm men, pH = 6, lượng cấy giống 4% thể tích, ni cấy hệ sợi 250C, ni lắc 120 vịng/phút máy lắc ni sục khí 0,5 V/V/M Hệ sợi cấy chuyển tốt sau ngày nuôi cấy b Điều kiện tối ưu nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể có độ tuổi ngày ni, lượng giống cấy 20ml/1400g chất nuôi trồng, nuôi điều kiện 22-280C; công thức nguyên liệu nuôi trồng: 79% mùn cưa + 5% trấu + 10% cám gạo + 5% bột ngô + 1% CaCO3 Từ kết nghiên cứu đề tài cho thấy, công nghệ sản xuất nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể giúp rút ngắn thời gian nuôi trồng (khoảng 29 ngày) đồng thời suất nấm thu cao (khoảng 6%) so với nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống thể rắn theo công nghệ truyền thống 5.2 KIẾN NGHỊ Trên sở kết nghiên cứu thực đề tài này, điều kiện hạn chế thiết bị, thời gian yếu tố khác, tác giả chưa sâu nghiên cứu chi tiết tồn diện nhiều yếu tố quan trọng, như: vai trị chất khoáng, vitamin sinh trưởng hệ sợi giống nấm Linh chi môi trường dịch thể; ảnh hưởng quang chu kỳ vòng đời sinh trưởng phát triển nấm Linh chi; Để tiếp tục hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất nấm Linh chi phương pháp nuôi cấy giống dạng dịch thể tác giả kiến nghị nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chất khác nuôi trồng nấm Linh chi chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể;đề nghị nghiên cứu nuôi trồng sinh thể từ mầm phân hóa hệ sợi nguồn chất dịch thể mà không cần nuôi trồng nguồn chất rắn tổng hợp./ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Lân Dũng, 2001 Công nghệ nuôi trồng nấm, tập1 Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Trịnh Tam Kiệt , 2013 Nấm lớn Việt Nam, Tập Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Vũ Thị Hằng (2012), “Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống Kim châm dạng dịch thể sản xuất nấm kim châm (Flammulina velutipes)”.Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp Trần Văn Mão, 2004 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thị Bích Thùy, Cồ Thị Thùy Vân, Trịnh Tam Kiệt (2012), Nghiên cứu cơng nghệ nhân giống nấm Sị Vua (Pleurotus eryngii) dạng dịch thể Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học, (8), tr 88-95 Nguyễn Thị Bích Thuỳ, Cồ Thị Thùy Vân, Đinh Xuân Linh, Trịnh Tam Kiệt, Nguyễn Trung Thành (2013), “Nghiên cứu nhân giống nấm Vân chi (Trametes vesicolor) dạng dịch thể”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, (41) tr 67-73 Nguyễn Thị Bích Thùy, Cồ Thị Thùy Vân, Trịnh Tam Kiệt (2012), Nghiên cứu cơng nghệ nhân giống nấm Sị Vua (Pleurotus eryngii) dạng dịch thể Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học, (8) tr 88-95 Lê Xuân Thám, 1996 Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điểm hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.exFr).Karst Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Việt Nam Lê Xuân Thám, 1996 Nấm Linh chi - dược liệu quí Việt Nam Nhà xuất Mũi Cà Mau Tài liệu tiếng Anh: 10 Adebayo-Tayo B.C and Ugwu E.E (2011), “Influence of Different Nutrient Sources on Exopolysaccharide Production and Biomass Yield by Submerged Culture of Trametes versicolor and Coprinussp.”, Australian Journal of Biotechnology, 15(2), pp 63-69 60 11 Bolla K., GopinathB V., Shaheen S.Z.and CharyaM.A.S.(2010), “Optimization of carbon and nitrogen sources ofsubmerged culture process for the production ofmycelial biomass and exopolysaccharides byTrametes versicolor”, International Journal for Biotechnology and Molecular Biology Research,1(2), pp.15-21 12 Diamantopoulou P., Papanikolaou S., Katsarou E., Komaitis M., Aggelis G and Philippoussis A (2012), “Mushroom Polysaccharides and Lipids Synthesized in Liquid agitated and static cultures”, Appl Biochem Biotechnol, 167(7), pp 890-906 13 Gibbs P.A., Seviour R.J and Schmid F (2000), “Growth of filamentous fungi in submerged culture: Problems and possible solutions”, Crit Rev Biotechnol.,(20), pp 17-48 14 Hamedi A., Vahid H and Ghanati F (2007), “Optimization of the medium composition for production of mycelial biomass and exo-polysaccaride by Agaricus blazei Murill DPPh 131 using response surface methodology” Biotechnology, 6(4), pp 456-464 15 Hassan F.R.H., Ghada M.M and El-Kady A.T.M (2012), “Mycelial Biomass Production of Enoke Mushroom (Flammulina velutipes) by Submerged Culture”, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 6(7), pp 603-610 16 Jonathan S.G., Bawo D.D.S., Adejoye D.O and Briyai O.F (2009), “Studies on Biomass Production in Auricularia polytricha Collected from Wilberforce Island, Bayelsa State, Nigeria”, American Journal of Applied Sciences, 6(1), pp 182-186 17 Kawai G., Kobayashi H., Fukushima Y and Ohsaki K (1995), “Liquid culture induces early fruiting in Shiitake (Lentinula edodes)”, Mushroom Science, 14(2), pp 787-793 18 Kwon J.S., Lee J.S., Shin W.C., Lee K.E and Hong E.K (2009), “Optimization of culture conditions and medium components for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides with Cordyceps militaris in liquid culture”, Biotechnol Bioprocess Eng., (14), pp 756-762 19 Lin J.H and Yang S.S (2006), “Mycelium and polysaccharide production of Agaricus blazeiMurrill by submerged fermentation”, J Microbiol Immunol Infect., 39(2), pp 98-108 20 Liu P , Li G and Wen S (2010), “Study for the liquid culture conditions of laccase production in Flammulina velutipes LP03”, Food science., pp31-36 61 21 Marquez-RochaF.J., Guillén G.K., Sánchez J.E and Vázquez R.D (1999), “Growth characteristic of Pleurotus ostreatus in bioreactors”, Biotechnol Tech., (13), pp 29-32 22 Sanodiya BS, Thakur GS, Baghel RK, Prasad GB, Bisen PS (2009) Ganoderma lucidum: a potent pharmacological macrofungus Curr Pharm Biotechnol;10: 717-753 23 Sukumar M., Sivasamy A and Swaminathan G (2008), “Biological Decolorization of Dye House Effluent by Trametes sp.isolated from Contaminated Soil”, Res J Biotech.,3(3), pp 53-58 24 Xu C.P.and Yun J.W (2003), “Optimization of submerged culture conditions for mycelial growth and exopolymer production by Auricularia polytricha (wood ears fungus) using the methods of uniform design and regression analysis”, Biotechnol Appl Bioch, (38), pp 193-199 25 Yan C.W., Chen H., Qin J.Z and Chen Y.D (2003), “Studies on Liquid Inoculum Filtration and Cultivated Condition of Flammulina velutipes”, Edible Fungi of China, College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xianyang, 71208 62 PHỤ LỤC Phụ lục Sơ đồ quy trình nhân giống nấm theo công nghệ truyền thống công nghệ Phụ lục Ni cấy nấm Linh chi bình sục khí ni máy lắc 63 Ni cấy giống nấm bình sục khí Ni cấy giống nấm máy lắc 64 ... cho nuôi cấy giống nấm Linh chi dạng dich thể nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể; sở kết đạt được, xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất nấm Linh chi sử dụng nguồn giống nấm. .. cứu xây dựng quy trình sản xuất nấm Linh chi phương pháp nuôi cấy giống dạng dịch thể 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Xác định số điều kiện tối ưu môi trường nuôi cấy giống nấm Linh chi chủng Ga-1 dạng dịch. .. dạng dịch thể so với công nghệ nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống thể rắn phổ biến Trên sở đó, tác giả xây dựng chi tiết công đoạn sản xuất đề xuất quy trình sản xuất nấm Linh chi phương