Nghiên cứu bệnh virus hại cà chua tại hà nội và phụ cận

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS HẠI CÀ CHUA TẠI HÀ NỘI VÀ PHỤ CẬN Ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60 62 01 12 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Ngô Bích Hảo NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thảo i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình hồn thành luận văn này, ngồi nỗ lực thân, nhận giúp đỡ tận tình quý báu từ nhiều tập thể cá nhân Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Ngơ Bích Hảo trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam hướng dẫn tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn cán công nhân viên thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực tập Trung tâm Đồng thời xin chân thành cảm ơn Thầy giáo, Cô giáo môn Bệnh Thầy cô khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp nhiệt tình dạy dỗ, bảo cho tơi suốt thời gian học tập trường Cuối xin chân thành cảm ơn người thân, gia đình, bạn bè hết lịng giúp đỡ, động viên tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày .tháng .năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thảo ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Những nghiên cứu cà chua nước 2.1.1 Tình hình sản xuất cà chua Việt Nam 2.1.2 Nghiên cứu bệnh virus cà chua nước ta 2.2 Nghiên cứu bệnh virus cà chua giới 2.2.1 Nghiên cứu Cucumber mosaic virus (CMV) 2.2.2 Những ngiên cứu Tomato mosaic virus (ToMV) 2.2.3 Những nghiên cứu virus xoăn vàng cà chua (Tomato yellow leaf curl virus) 2.2.4 Những nghiên cứu virus khảm khoai tây ( Potato virus X) 2.2.5 Những nghiên cứu virus Y khoai tây (Potato virus Y) 2.2.6 Những nghiên cứu Tomato necrotic ringspot virus (TNRV) 10 2.3 Đặc điểm số chi virus hại cà chua quan trọng 10 2.3.1 Đặc điểm chi Tospovirus 10 2.3.2 Đặc điểm chung chi Begomovirus 14 iii 2.3.3 Đặc điểm chung chi Potyvirus 19 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 3.1 Địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Thời gian nghiên cứu 21 3.3 Đối tượng, vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 21 3.3.3 Dụng cụ hóa chất nghiên cứu 21 3.4 Nội dung nghiên cứu 22 3.5 Phương pháp nghiên cứu 23 3.5.1 Phương pháp điều tra thành phần bệnh đồng 23 3.5.2 Phương pháp nghiên cứu phịng thí nghiệm 24 3.5.3 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo tiếp xúc học 27 Phần Kết nghiên cứu 28 4.1 Điều tra bệnh virus cà chua hà nội phụ cận 28 4.1.1 Xoăn vàng 29 4.1.2 Khảm 29 4.1.3 Lá dương xỉ 30 4.1.4 Khảm, vàng – đốm hình nhẫn – đốm chết hoại 30 4.1.5 Biến vàng – tím gân – lùn 31 4.2 Điều tra bệnh virus cà chua vụ đông xuân 2016-2017 Đặng Xá – Gia Lâm 31 4.3 Điều tra triệu chứng xoăn vàng cà chua mật độ bọ phấn giống cà chua Savior VT5 vụ xuân hè năm 2017 Vân Nội – Đơng Anh 32 4.4 Điều tra tình hình bệnh virus cà chua tập đồn giống cà chua thí nghiệm trung tâm nghiên cứu rau chất lượng cao 33 4.5 Điều tra bệnh virus cà chua mật độ bọ phấn cà chua vụ xuân hè năm 2017 Hải Phòng Nam Định 36 4.6 Diễn biến số bệnh virus hại cà chua vụ xuân hè năm 2017 Gia Lâm – Hà Nội 37 4.7 Đánh giá mức độ biểu triệu chứng xoăn vàng cà chua giống cà chua Tiên Dương – Đông Anh – Hà Nội vụ xuân hè 2017 38 iv 4.8 Phát virus mẫu thu thập đồng ruộng kỹ thuật ELISA 38 4.9 Kiểm tra phát Tospovirus RT-PCR 46 4.10 Đánh giá tính gây bệnh PVY lây nhiễm nhân tạo thị 49 4.11 Đánh giá tính gây bệnh Tospovirus lây nhiễm nhân tạo 52 Phần Kết luận kiến nghị 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Kiến nghị 55 Tài liệu tham khảo 57 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Bp Basepair Cdna complementary DNA CTAB Cetryl Ammonium Bromide DAS-ELISA Double antibody sandwich- Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay dNTP Deoxynucleotide triphotphate EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic- Acid ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M Kb Kilobase NPP Nitrophenyl photphat OD Optical density ORF Open reading frame PBS Phosphate-buffered saline PBS-T Phosphate Buffered Saline with Tween PVP Polyvinylpyrrolidone RdRp RNA-dependent RNA polymerase RNA Ribonucleic acid RNP Ribonucleoprotein RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction TAE Tris-acetate-EDTA β- ME Beta- Mercaptoethanol PCR Polymerase chain reaction Nm Nanomet vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Diện tích, suất, sản lượng cà chua Việt Nam Bảng 4.1 Các hoại hình triệu chứng bệnh virus cà chua Hà Nội phụ cận năm 2016-2017 28 Bảng 4.2 Các loại hình triệu chứng bệnh virus hại cà chua Đặng Xá – Gia Lâm vụ đông xuân 2016-2017 32 Bảng 4.3 Diễn biến triệu chứng xoăn vàng cà chua mật độ bọ phấn giống cà chua Savior VT5 vụ xuân hè năm 2017 Vân Nội – Đông Anh – Hà Nội 33 Bảng 4.4 Tình hình bệnh virus cà chua năm 2017 tập đồn giống cà chua thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu rau chất lượng cao 34 Bảng 4.5 Điều tra bệnh virus cà chua mật độ bọ phấn cà chua vụ xuân hè năm 2017 Hải Phòng Nam Định 36 Bảng 4.6 Diễn biến bệnh khảm cà chua vụ Xuân hè năm 2017 Gia Lâm, Hà Nội 37 Bảng 4.7 Diễn biến triệu chứng xoăn vàng hại cà chua vụ Xuân hè năm 2017 Gia Lâm, Hà Nội 37 Bảng 4.8 Mức độ nhiễm bệnh xoăn vàng cà chua giống cà chua Vân Nội – Đông Anh vụ xuân hè 2017 38 Bảng 4.9 Phát virus kỹ thuật ELISA mẫu cà chua thu thập Đặng Xá – Gia Lâm 40 Bảng 4.10 Phát virus kỹ thuật ELISA mẫu cà chua thu thập vụ xuân hè 2017 42 Bảng 4.11 Phát virus kỹ thuật ELISA mẫu cà chua thu thập Mộc Châu – Sơn La năm 2017 44 Bảng 4.12 Kết kiểm tra phát tospovirus cà chua RT-PCR 46 Bảng 4.13 Kết tìm kiếm BLAST dùng tồn đoạn giải trình tự (NIb3’End) mẫu CL10-1 làm chuỗi hỏi 49 Bảng 4.14 Kết lây nhiễm nhân tạo PVY từ cà chua sang rau muối 50 Bảng 4.15 Kết lây nhiễm nhân tạo PVY từ cà chua sang thuốc 51 Bảng 4.16 Kết lây nhiễm Tospovirus tiếp xúc học từ nguồn cà chua Gia Lâm – Hà Nội 52 Bảng 4.17 Kết lây nhiễm Tospovirus tiếp xúc học từ nguồn cà chua Đà Lạt – Lâm Đồng 54 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân bố tospovirus giới (Papu et al., 2009) 10 Hình 2.2 Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B begomovirus 14 Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A Begomovirus 15 Hình 2.4 Cấu trúc phân tử DNA-B Begomovirus (Hà Viết Cường, 2012) 16 Hình 2.5 Hình thái phân tử potyvirus, phân tử PVY 19 Hình 2.6 Tổ chức gen Potyvirus(Shukla et al., 1998) 20 Hình 4.1 Triệu chứng xoăn vàng cà chua 29 Hình 4.2 Triệu chứng khảm cà chua 29 Hình 4.3 Triệu chứng dương xỉ cà chua 30 Hình 4.4 Triệu chứng Khảm, vàng – đốm hình nhẫn – đốm chết hoại 30 Hình 4.5 Triệu chứng biến vàng – tím gân – lùn cà chua 31 Hình 4.6 Kết ELISA phát virus cà chua ngày 14/4/2017 39 Hình 4.7 Kết sau kiểm tra hai virus TSWV PVY kỹ thuật ELISA 41 Hình 4.8 mẫu cà chua thu thập Mộc Châu – Sơn La năm 2017 43 Hình 4.8 Kết ELISA phát virus cà chua ngày 2/8/2017 45 Hình 4.9 Triệu chứng giống nhiễm Tospovirus cà chua năm 2017 47 Hình 4.10 RT-PCR phát tospovirus cà chua cặp mồi TospoF3/R3 47 Hình 4.11 Triệu chứng lây nhiễm PVY tiếp xúc học rau muối 50 Hình 4.12 Triệu chứng lây nhiễm PVY tiếp xúc học thuốc 51 Hình 4.13 Lây nhiễm Tospovirus biện pháp tiếp xúc học 52 Hình 4.14 Triệu chứng lây nhiễm Tospovirus tiếp xúc học cà chua sau tuần 53 Hình 4.15 Triệu chứng lây nhiễm Tospovirus tiếp xúc học cà chua sau tuần 54 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Thảo Tên luận văn: “Nghiên cứu bệnh virus hại cà chua Hà Nội phụ cận” Ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60 62 01 12 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định thành phần, đặc điểm sinh học virus hại cà chua Hà Nội phụ cận Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, bệnh virus hại cà chua thu thập cánh đồng trồng cà chua Hà Nội tỉnh phụ cận Các mẫu bệnh có triệu chứng đặc trưng làm khơ, sau kiểm tra phương pháp ELISA Sử dụng cặp mồi chung là: Tospo-F1/Tospo-R1 Tospo-F3/Tospo-R3 để phát Tospovirus Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo tiếp xúc học thực nhà lưới trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới Kết kết luận Xác định loại hình triệu chứng bệnh virus hại giống cà chua trồng phổ biến vùng Hà Nội phụ cận gồm: xoăn vàng lá, khảm lá, biến vàng – tím gân – lùn cây, dương xỉ, khảm, vàng – đốm hình nhẫn – đốm chết hoại Trong triệu chứng xoăn vàng xuất phổ biến đồng ruộng Bệnh xoăn vàng cà chua hại phổ biến vùng trồng cà chua Hà Nội, Hải Phòng, Nam Định Bệnh phát triển mạnh từ giai đoạn hoa đến thu hoạch Giai đoạn sinh trưởng phát triển mạnh thân giai đoạn mật độ bọ phấn đồng ruộng tăng cao Đã kiểm tra ELISA mẫu cà chua mang triệu chứng bệnh virus loại kháng huyết Tomato spotted wilt virus (TSWV), Potato virus Y (PVY), Capsicum chlorosis virus (CaCV), Iris yellow spot virus (IYSV), Watermelon silver mottle virus (WSMoV) Tomato mosaic virus (ToMV), xác định virus Potato virus Y (PVY), Capsicum chlorosis virus (CaCV), Tomato spotted wilt virus (TSWV) Watermelon silver mottle virus (WSMoV) Kiểm tra RT-PCR mẫu cà chua có triệu chứng giống nhiễm Tospovirus, xác định mẫu (1 mẫu Gia Lâm mẫu thu Đà Lạt) có phản ứng dương với cặp mồi chung Tospo-F3/R3 Kết giải trình tự mẫu cho thấy Tospovirus nhiễm cà chua Tomato necrotic ringspot virus (TNRV) ix Kết kiểm tra ELISA (Bảng 4.11) cho thấy phản ứng ELISA + xuất virus TSWV, CaCV WSMoV Đối với TSWV, có mẫu phản ứng + mẫu cà chua số Tuy nhiên giá trị OD mẫu (0,951) cao không đáng kể so với ngưỡng (OD=0,894) Đối với CaCV, có mẫu phản ứng + với giá trị OD từ 1,292 tới 2,515 (ngưỡng 1,26) Kết kiểm tra CaCV phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Thị Thảo (BVTV55) thực hiện, tác giả phát 6/48 mẫu cà chua biểu triệu chứng giống bị nhiễm Tospovirus có phản ứng + với CaCV CaCV Tospovirus xác định năm gần công bố xuất Châu Á (Ấn Độ, Thái Lan) Úc (Papu et al., 2009) Đối với WSMoV, có mẫu có phản ứng ELISA + Tuy nhiên giá trị OD mẫu 1,005, cao không đáng kể so với ngưỡng (0,992) Cả virus CaCV, TSWV WSMoV gây nhiều nhiệu chứng có đốm chết hoại, đốm hình nhẫn biến vàng Dựa kết ELISA triệu chứng học, chúng tơi kết luận mẫu cà chua nhiễm với Tospovirus có quan hệ hut gần gũi với CaCV/WSMoV/TSWV Hình 4.8 Kết ELISA phát virus cà chua ngày 2/8/2017 45 4.9 KIỂM TRA PHÁT HIỆN TOSPOVIRUS BẰNG RT-PCR Trong trình điều tra bệnh virus hại cà chua đồng ruộng, thu số mẫu giống bị nhiễm Tospovirus Cây bị bệnh biểu triệu chứng đốm hình nhẫn, chết hoại, biến vàng khơng đều, bị đốm hình nhẫn, biến dạng (Hình 4.9) Do phản ứng ELISA phát TSWV mẫu âm tính nên chúng tơi tiến hành kiểm tra RT-PCR dùng cặp mồi chung để phát Tospovirus Trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới thiết kế Tospo-F1/R1 Tospo-F3/R3 Bốn mẫu cà chua có mẫu thu Gia Lâm – Hà Nội mẫu thu Đà Lạt – Lâm Đồng kiểm tra RTPCR Kết kiểm tra trình bày Bảng 4.12 Kết kiểm tra RT-PCR cho thấy mẫu âm tính với cặp mồi Tospo-F1/R1 Tuy nhiên mẫu thu Gia Lâm mẫu thu Đà Lạt cho phản ứng dương tính với cặp mồi Tospo-F3/R3 (kích thước băng sản phẩm ~ 0.6 kb) Bảng 4.12 Kết kiểm tra phát tospovirus cà chua RT-PCR STT Mẫu Ngày thu thập RT-PCR Đia điểm Triệu chứng Tospo- TospoF1/R1 F3/R3 To-17-1 4/2017 Gia Lâm – Hà Nội To-17-2 4/2017 Gia Lâm – Hà Nội To-17-3 25/5/2017 Đà Lạt – Lâm Đồng To-17-4 25/5/2017 Đà Lạt – Lâm Đồng 46 Đốm hình nhẫn (lá, quả) Đốm hình nhẫn (lá, quả) Biến vàng lá; đốm hình nhẫn Biến vàng lá; đốm hình nhẫn - + - - - + - + (a) (b) (d) (c) (e) (f) Hình 4.9 Triệu chứng giống nhiễm Tospovirus cà chua năm 2017 (a), (b), (c): Mẫu thu Gia Lâm – Hà Nội (d), (e), (f): mẫu thu Đà Lạt – Lâm Đồng Hình 4.10 RT-PCR phát tospovirus cà chua cặp mồi TospoF3/R3  Giải trình tự sản phẩm RT-PCR (Tospo-F3/R3) mẫu cà chua 47 Chúng tiến hành giải trình tự trực tiếp sản phẩm RT-PCR (TospoF3/R3) mẫu cà chua To-17-1 To-17-4 dùng mồi Tospo-F3 Kết giải trình tự thu sản phẩm giải trình tự có chất lượng tốt có kích thước 535 nts (To-17-1) 577 nts (To-17-4) >To-17-1 (535 nts) GCTATAGGTGCCATTGCACGGAGACTGGACAATAAAGGTAAAGG TCCACCAACACACAACATCAGCCTGGTTGCACTGGAATCGAAATTGG GAGGTACATTTAACCCATAAGCAATAACCATAGGAAGTGACATAAGT TTTGAATACATGTCTTGCTGGAGTTTTTGAGTTGTGCATTCTTCAACCA TCTTTGCCATGAGAACTCTGAGTACAGCTTCAGTTCTCTTAAATGTCC ATGTTTTTTCATCAGCATTATCTGAGTTTTGTTCTATCTTTTTGCCGCA AAAAACAAACTGATTGCTCTTGCAGGCTGCAAATATCTGCTTTCTACT CTTTAGTATAGTTATTCCATTATTGAATGTAAATTTTCCGAAGATGTCC TGTTTGTTTTCATCATAAAATTTAGAAAAGCTGAATCCCGGTGTAGCT TCATCAAGCTCTATTTCAATGTCTGCTTCTCCTCCAGCTAGCAATTCCT TGATTTTCTCGTTTGACAAGTTTTTCCTAACGGTAGACATGGGGTTTTA CGGGAACT >To-17-4 (577 nts) CCGAGATCTGCTTCTTGACATTCTGAAATAAGCAAGAGAGAAAG CTATAGGTGCCATTGCAGGGAGACTGGACAATAAAGGTAAAGGTCC ACCAACACACAACATCAGCCTGGTTGCACTGGAATCGAAATTGGGA GGTACATTCAACCCATAAGCAATAACCATAGGAAGTGACATAAGTTT TGAATACATGTCTTGCTGGAGTTTTTGAGTTGTGCATTCTTCAACCAT CTTTGCCATGAGAACTCTGAGTACAGCTTCAGTTCTCTTAAATGTCCA TGTTTTTTCATCAGCATTATCTGAGTTTTTTGCTATCTGTTTGCCGCAA AAAACAAACTGATTGCTCTTGCAGGCTGCAAATATCTGCTTTCTACTC TTTAGTATAGTTATTCCATTATTGAATGTAAATTTTCCGAAGATGTCC TGTTTGTTTTCATCATAAAATTTAGAAAAGCTGAATCCCGGTGTAGCT TCATCAAGCTCTATTTCAATGTCTGCTTCTCCTCCAGCTAGCAATTCC TTGATTTTCTCGTTTGACAAGTTTTTCCTAACGGTAGACATGGGGTTT TACGGGGAA Tiếp theo, sử dụng cơng cụ tìm kiếm trực tuyến BLAST website 48 NCBI, tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự thu Kết tìm kiếm cho thấy virus ngân hàng gen gần gũi với mẫu To-171 To-17-4 mẫu Tomato necrotic ringspot virus (TNRV) với phần trăm đoạn so sánh 99-100 % mức đồng trình tự 93 % TNRV tospovirus xác định lần cà chua Thái Lan năm 2010 (Chiemsombat et al 2010) Kết với kết nghiên cứu Nguyễn Thị Thúy (2016) chứng tỏ Tospovirus gây hại cà chua Việt Nam TNRV Bảng 4.13 Kết tìm kiếm BLAST dùng tồn đoạn giải trình tự (NIb3’End) mẫu CL10-1 làm chuỗi hỏi Mẫu Phần trăm Virus Gen Bank Mã đoạn so sánh (%) Tomato necrotic ringspot virus, isolate T1 KM887842 99 To-17-1 Tomato necrotic ringspot virus Mức đơng trình tự (%) 93 FJ946835 99 93 KM887841 99 93 Tomato necrotic ringspot virus, isolate T1 KM887842 100 93 FJ946835 100 93 KM887841 100 93 Tomato necrotic ringspot virus isolate 94 To-17-4 Tomato necrotic ringspot virus Tomato necrotic ringspot virus isolate 94 Ghi : Trình bày trình tự xuất tìm kiếm BLAST 4.10 ĐÁNH GIÁ TÍNH GÂY BỆNH CỦA PVY BẰNG LÂY NHIỄM NHÂN TẠO TRÊN CÂY CHỈ THỊ Để đánh giá mức độ gây bệnh tìm hiểu đặc điểm sinh học PVY gây hại cà chua Chúng tiến hành thực lây bệnh nhân tạo điều kiện nhà lưới (cây trồng chậu ) kĩ thuật lây sát thương học số thị rau muối, thuốc Dịch virus nghiền chày cối sứ đệm phosphate 0,01M, pH 7.0 Đối với đối chứng không lây để cánh ly để theo dõi Kết trình bày bảng 4.14 49 Bảng 4.14 Kết lây nhiễm nhân tạo PVY từ cà chua sang rau muối Ngày lây Số lây 18/4/2017 Số vết bệnh hình thành sau lây Số lây ( lá) ngày 0 0 3 12 19 (a) (b) Hình 4.11 Triệu chứng lây nhiễm PVY tiếp xúc học rau muối (a): đối chứng; (b): Cây bị nhiễm PVY sau ngày Mẫu cà chua mà sử dụng để lây nhiễm nhân tạo rau muối mẫu cà chua có triệu chứng khảm, biến vàng, có đốm chết hoại thân lá, đốm hình nhẫn mà trước kiểm tra ELISA cho kết ELISA dương tính Sau ngày rau muối xuất đốm chết hoại màu vàng Càng sau, số lượng đốm chết hoại tăng lên, chuyển từ màu vàng sang màu nâu, cuối rụng 50 Bảng 4.15 Kết lây nhiễm nhân tạo PVY từ cà chua sang thuốc Ngày lây Cây lây Số Số biểu triệu chứng sau lây lây ngày 18/4/2017 N.benthamiana 0 23/4/2017 N tabacum -K326 0 Hình 4.12 Triệu chứng lây nhiễm PVY tiếp xúc học thuốc Kết thu sau hai lần lây nhiễm cho thấy: biểu triệu chứng giống thuốc N Benthamiana với triệu chứng: đốm chết hoại màu vàng lá, còi cọc, bị nhăn; với thuốc N tabacum– k326 khơng biểu triệu chứng Như vậy, cho rằng, thuốc N Benthamiana chị thị số loại virus hại cà chua, có PVY Các nghiên cứu cho thấy, loại virus cà chua biểu lên thuốc Kết thu phù hợp với nghiên cứu trước Nhưng thuốc N tabacum– k326 khơng biểu triệu chứng Đó thuốc phản ứng với đệm phosphate thuốc N tabacum– k326 không mẫu cảm với virus 51 4.11 ĐÁNH GIÁ TÍNH GÂY BỆNH CỦA TOSPOVIRUS BẰNG LÂY NHIỄM NHÂN TẠO Các Tospovirus lan truyền tự nhiên bọ trĩ Tuy nhiên Tospovirus lây nhiễm tiếp xúc học với điều kiện sử dụng đệm chiết phù hợp Chúng sử dụng đệm chiết đệm phosphate 0.05 – 0.07M, pH 7.0, chứa 0.1% sodium sulfite, 0.2% 2-mercaptoethanol để chiết mẫu Qui trình lây nhiễm trình bày phần vật liệu minh họa Hình 4.13 Hình 4.13 Lây nhiễm Tospovirus biện pháp tiếp xúc học Bảng 4.16 Kết lây nhiễm Tospovirus tiếp xúc học từ nguồn cà chua Gia Lâm – Hà Nội Nguồn lây nhiễm Thời gian lây nhiễm Cà chua với triệu chứng biến vàng, đốm hình nhẫn An Lạc – Gia Lâm – Hà Nội Cà chua (giống Sông Hồng 1) Thuốc cảnh Lần Ớt (AV1) (16/4/2017) Ớt (AV10) Rau muối Ớt (AV15) Cà chua với triệu chứng biến vàng, đốm hình nhẫn An Lạc – Gia Lâm – Hà Nội Cà chua (giống Lần (23/4/2017) Hồng Loan) Cây lây nhiễm 52 Số lây Số biểu triệu chứng sau lây 14 21 ngày 0 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 (a) (b) (c ) (d) Hình 4.14 Triệu chứng lây nhiễm Tospovirus tiếp xúc học cà chua sau tuần (a): Cây đối chứng; (b), (c), (d): Cây bị nhiễm sau tuần Lần thứ lây nhiễm loạt như: cà chua (giống Sông Hồng 1), thuốc lá, ớt, rau muối khơng có biểu triệu chứng Lần hai, lây nhiễm giống cà chua Hồng Loan có 3/5 biểu triệu chứng: biến vàng có đốm chết hoại Như vậy, Hồng Loan giống cà chua mẫn cảm với virus Sử dụng nguồn cà chua Đà Lạt – Lâm Đồng kiểm tra RT-PCR lên dương tính lây nhiễm lên cà chua thuốc Chúng tơi có kết thể bảng 4.17 hình 4.15 53 Bảng 4.17 Kết lây nhiễm Tospovirus tiếp xúc học từ nguồn cà chua Đà Lạt – Lâm Đồng Nguồn lây nhiễm Cà chua với triệu chứng Biến vàng lá, đốm hình nhẫn Đà Lạt – Lâm Đồng Cây lây nhiễm Số lây Cà chua Ớt Số biểu triệu chứng sau lây 14 ngày 28 ngày 0 Hình 4.15 Triệu chứng lây nhiễm Tospovirus tiếp xúc học cà chua sau tuần Kết cho thấy, sau tuần, 5/5 cà chua biểu triệu chứng đặc trưng: biến vàng, đốm chết hoại, đốm hình nhẫn giống với triệu chứng nguồn lây Như vậy, Tomato necrotic ringspot virus có khả lây nhiễm tiếp xúc học, biểu triệu chứng đặc trưng, phù hợp với nghiên cứu Chiemsombat et al (2010) 54 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Trong trình thực đề tài, rút số kết luận sau: Xác định loại hình triệu chứng bệnh virus hại giống cà chua trồng phổ biến vùng Hà Nội phụ cận gồm: xoăn vàng lá, khảm lá, biến vàng – tím gân – lùn cây, dương xỉ, khảm, vàng – đốm hình nhẫn – đốm chết hoại Trong triệu chứng xoăn vàng xuất phổ biến đồng ruộng Bệnh xoăn vàng cà chua hại phổ biến vùng trồng cà chua Hà Nội, Hải Phòng, Nam Định Bệnh phát triển mạnh từ giai đoạn hoa đến thu hoạch Giai đoạn sinh trưởng phát triển mạnh thân giai đoạn mật độ bọ phấn đồng ruộng tăng cao Đã kiểm tra ELISA mẫu cà chua mang triệu chứng bệnh virus loại kháng huyết TSWV, PVY, CaCV, IYSV, WSMoVvà ToMV, xác định virus PVY, CaCV, TSWV WSMoV Kiểm tra RT-PCR mẫu cà chua có triệu chứng giống nhiễm tospovirus, xác định mẫu (1 mẫu Gia Lâm mẫu thu Đà Lạt) có phản ứng dương với cặp mồi chung Tospo-F3/R3 Kết giải trình tự mẫu cho thấy tosppovirus nhiễm cà chua Tomato necrotic ringspot virus (TNRV) Virus PVY gây hại phổ biến Đông Anh – Hà Nội An Lạc – Gia Lâm kết kiểm tra ELISA cho thấy 75-83 % số mẫu cà chua có biểu triệu chứng bệnh có phản ứng dương tính với PVY Virus CaCV gây hại phổ biến Mộc Châu – Sơn La kết kiểm tra ELISA xác định 44% số mẫu có phản ứng dương tính với CaCV, 11% số mẫu phản ứng dương tính với TSWV WSMoV Đã xác định khả lây nhiễm PVY Tosppovirus cà chua qua lây bệnh nhân tạo phương thức tiếp xúc học 5.2 KIẾN NGHỊ Đề tài thực thời gian ngắn, kết điều tra cịn nhiều hạn chế, nên đề nghị cần tiếp tục nghiên cứu số vấn đề sau: 55 Tiếp tục nghiên cứu bệnh virus gây hại cà chua nhiều loài nhiều loại trồng thuộc nhiều vùng sinh thái khác Tìm biện pháp phòng trừ bệnh virus gây cà chua số loài trồng khác 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Đoàn Thị Ái Thuyền, Lu Việt Dũng, Vũ Triệu Mân (2003) Sử dụng kháng huyết Trung tâm Bệnh Nhiệt đới (ĐHNNI) xản xuất chuẩn đoán số bệnh virus hại trồng Hội thảo bệnh Sinh học phân tử lần thứ Trường Nông Nghiệp I, Hà Nội, ngày 23-25/10/2003 Hà viết Cường (2012), Bài giảng virus thực vật, phytoplasma vàviroid Ngơ Bích Hảo (2002) Phát virus cà chua, ớt cay, ớt ngọt, nhận dạng Tomato mosaic virus Miền Bắc Việt Nam Hội thảo bệnh sinh học phân tử lần Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20/06/2002 NXB Nơng nghiệp, Hà Nội tr 6-11 Nguyễn Thơ (1984) Điều tra nghiên cứu số bệnh virus chủ yếu trồng có giá trị kinh tế (thuốc lá, cà chua, khoai tây) Luận án phó tiến sĩ khoa học Nông Nghiệp, trường đại học Nông nghiệp I, Hà Nội Nguyễn Văn Tuất (2002) Kỹ thuật chuẩn đoán giám định bệnh hại trồng NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Tổng cục thống kê (2012) Niên giám thống kê tóm tắt 2012, NXB Thống kê, Hà Nội Vũ Triệu Mân (1984) Một số kết nghiên cứu virus PVX, PVY khoai tây giống Ackersegen vùng Đồng Miền Bắc Việt Nam Luận án phó tiến sĩ khoa học Nông nghiệp, trường Đại Học Nông nghiệp I – Hà Nội Vũ Triệu Mân (1986) Bệnh virus khoai tây Nhà xuất khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh Nguyễn Thị Phương Thảo (2005) Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 10 Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề (2001) Giáo trình bệnh nơng nghiệp Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Tài liệu tiếng anh : 11 Zitter J A (1993) Diseases caused by viruses Compendium of tomato diseases, APS press, 1993 12 Green S.K (1991) Guidelines for diagnotic work in plant virology Technical Bullentin.No.15 Acian vegetable resech and development center 57 13 Yassin A M and M A Nour (1965) Tomato leaf curl diseases in the Sudan and their relation to tobacco leaf curl Annals of Applied Biology pp 207-217 14 Cohen S and E F Nitzany (1966) Transmission and hots range of the tomato yellow leaf curl virus Phytopathology 56 15 Green S K and G Kalloo (1994) Leaf curl and yllowing viruses of pepper and tomato: an overview Asian Vegetable Research and Development Center Technical Bulletin pp 51 16 Cortez I., J Saaijer, S K Wongjkaew, M A Pereira, R Goldbach, D Peters, and R Kormelink (2001) Identification and characterization of a novel tospovirus species using a new RT-PCR approach Archives of Virology pp 265-278 17 Gent D H., J L Toit., F S Fichtner, K S Mohan, R H Pappu, and F H Schwartz (2006) Iris yellow spot virus: An emerging threat to onion bulb and seed production Plant Disease pp 1468-1480 18 Kennedy G (2007) Thrips and Tospovirus management: an overview Journal of Insect Science 19 Kunkalikar S R., P Sudarsana, P Rajagopalan, B U Zehr, and S K Ravi (2010) Biological and molecular characterization of Capsicum chlorosis virus infecting chilli and tomato in India Archives of Virology pp 1047-1057 20 Naidu R A., S Adkins, S K Ravi, P Chiemsombat, K R Jain, S H Savithri, O Gajanandana, V Muniyappa, and J D Riley (2007) Epidemiology of Tospoviruses in South and Southeast Asia: Current status and future prospects Journal of Insect Science pp 26-27 21 Okuda M., and K Hanada (2001) RT-PCR for detecting five distinct Tospovirus species using degenerate primers and dsRNA template Journal of Virological Methods pp 149-156 22 Okuda M., S Takeuchi, S Taba, K Kato, and K Hanada (2002) Melon yellow spot virus and watermelon silver mottle virus: Otbreak of cucurbit infecting tospovirus in Japan In Proceedings of the Iind International Symposium on Cucurbits, pp 143-148 23 Pappu H R., A R Jones, and K R Jain (2009) Global status of tospovirus epidemics in diverse cropping systems: Successes achieved and challenges ahead Virus Research pp 219-236 24 Persley D M., J E Thomas, and M Sharman (2006) Tospoviruses - an Australian perspective Australasian Plant Pathology pp 161-180 58 25 Rao X., Z Wu, and Y Li (2013) Complete genome sequence of a Watermelon silver mottle virus isolate from China Virus Genes pp 576-580 26 Ravi K S., S A Kitkaru, and S Winter (2006) Iris yellow spot virus in onion: a new tospovirus record from India Plant Pathology pp 288-288 27 Sakurai T., T Inoue and S Tsuda (2004) Distinct efficiencies of Impatiens necrotic spot virus transmission by five thrips vector species (Thysanoptera : Thripidae) of tospoviruses in Japan Applied Entomology and Zoology 39, pp.71-78 28 Seepiban C., O Gajanandana, T Attathom, and S Attathom (2011) Tomato necrotic ringspot virus, a new tospovirus isolated in Thailand Archives of Virology pp.263-274 29 Turina M., L Tavella, and M Ciuffo (2012) Tospoviruses in the Mediterranean area pp 403-437 30 Ullman D (2007) Thrips vectors and tospoviruses: On the edge of adaptation Journal of Insect Science 31 Van Poelwijk, F Prins, and M Goldbach (1997) Completion of the impatiens necrotic spot virus genome sequence and genetic comparison of the L proteins within the family Bunyaviridae J Gen Virol 78 ( Pt 3), pp 543-546 32 Gafni Y (2003) Tomato yellow leaf curl virus Molecular Plant Pathology pp 9-15 33 Gutierrez C (2002) Strategies for geminivirus DNA replication and cell cycle interference Physiological and Molecular Plant Pathology pp 219-230 34 Gutierrez C., E Ramirez-Parra, M M Castellano, P A Sanz-Burgos, A Luque, and R Missich (2004) Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions Veterinary Microbiology pp 111-119 35 Jeske H (2009) Geminiviruses In Tt Viruses - the Still Elusive Human Pathogens, pp 185-226 Edited by E M De Villiers & H ZurHausen Jeske, H (2009) 36 Shukla D D., W C Ward, and B A Brunt (1998) Potyvidae family Description of plant viruses No 336 AAB (Association of Apploed Biologiss) pp 279- 332 37 Ha C., P Revill, M R Harding, M Vu, J.L Dale (2008) "Identification and sequence analysis of Potyviruses infecting crops in Vietnam" Archives of virology pp 45-60 38 Chiemsombat P., M Sharman, K Srivilai, K Campbell, P Persley, and S Attathom (2010) A new tospovirus species infecting Solanum esculentum and Capsicum annuum in Thailand pp 75-78 59 ... điểm sinh học virus hại cà chua Hà Nội phụ cận Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, bệnh virus hại cà chua thu thập cánh đồng trồng cà chua Hà Nội tỉnh phụ cận Các mẫu bệnh có triệu chứng... học virus hại cà chua Hà Nội phụ cận 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Điều tra bệnh virus cà chua trồng Hà Nội phụ cận vụ đông xuân 2016-2017 xuân hè 2017 Thu mẫu bệnh virus cà chua Xác định virus gây bệnh. .. nghiên cứu cà chua nước 2.1.1 Tình hình sản xuất cà chua Việt Nam 2.1.2 Nghiên cứu bệnh virus cà chua nước ta 2.2 Nghiên cứu bệnh virus cà chua giới 2.2.1 Nghiên cứu