803-881 Qi Y., Zhang Y.,W ang z., Yang Y., Yuan Y., Niu S., Pei P., Wang s., Ma Y., Bu D., Zou L., Fang F., Xiao J.,Sun F., Zhang Y.,Wu Y.,Wang s., Xiong H.,Wu X (2006), “Screening of common mitochondrial mutations in Chinese patients with mitochondria! encephaiomyopathies", Mitochondrion, 7, pp 147-150 Szuhai K., Ouweiand J M., Dirks R w , Lemaĩtre M., Truffert J c., Janssen J M., Tanke H J., Holme E., Maassen J A., Raap A K (2001), “Simultaneous A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy number quantification in Myoclonus Epilepsy and RaggedRed Fibers (MERRF) syndrome by a multiplex Molecular Beacon based reai-time fluorescence PCR , Nucleic Acids Research, 29(3), pp 1-6 Truong T H., Nguyen T V A., Nguyen V L„ Pham V A., Phan T N (2014), “Screening of common pointmutations and discovery of new T14727C change in mitochondrial genome of Vietnamese encephaiomyớpaihy patients”, Mitochondrial DNA, 27, pp 441-448 Virgilio R., Ronchi D., Bordoni A., Fassone E., Bonato s., Donadoni c Torgano G., Moggio M , Corti S., Bresolin N., Comi G p (2009), “Mitochondria! DNA G8363A mutation in the tRNA Lys gene: clinical, biochemical and pathological study", Journal Neurol Science, 281(1-2), pp 85-92 Zhang Y., Yang Y L , Sun F., Cai X., Qian N., Yuan Y., Wang z X.,Qị Y.,Xiao J X.,Wang X Y., Zhang Y H., Jiang Y w „ Qin J.,W u X R (2007), “Clinical and molecular survey in 124 Chinese patients with Leigh or Leigh-like syndrome", Journal of Inherited Metabolic Disease, 30(2), pp 265-267 NGHIÊN CỨU CHÁN ĐỐN DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYẺN PHƠI BỆNH TEO c TỦY Ths Nguyễn Thị Thanh Nga (Bộ môn Sinh học Di truyền Yhọc, Học viện Quânỵ) ' sv Trần Van Tuấn, SV Đồng Phú cấu (Sinh viên năm thứ hai, Học viện Quân y) BS Đào Hải Yên (Bênh viện Than khoáng sản) Hướng dắn: PGS.TS Trần Văn Khoa (Bộ môn Sinh học Di truyền Y học, Học viện Quân y) TÓM TẲT Đặt vấn đề: Bệnh teo tủy bệnh thần kinh ơo bị đồng hợp exon gen SMNt nhiễm sắc thể số Trẻ bị bệnh' teo tủy thường có tiên luựng xấu từ vong sơm Vì vậy, vẩn đề phòng tránh chủ động bệnh teo tủy phải ưu tiên hàng đầu Mục tiêu: mục tiêu nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đốn di truyền trước chuyền phơi bệnh teo tủy Đối tượng phương pháp nghiên cưu: 17 bệnh nhi chần đoán bị bệnh teo tủy đồng hợp tử exon gen SMNt va bố mẹ họ; 30 mẫu té bào phôi sính thiết từ phơi dư ngày 3; 04 gia ơình sinh bị bệnh SMA tự nguyện tham gia chẩn đôn di truyền trước chuyền phơi bệnh teo tủy Kỹ thuật PCR- RFLP minisequencing đế phát đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy Phương phâp nhân toàn bộ gen nhằm khuếch đại gen lên hàng nghìn lần Kết quả: Kỹ thuật PCR- RFLP chuẩn hóa để phát đột biến gen SMNt từ mấu toàn phần với hiệu suất la 100% Kỹ thuật có hiệu nhân exon gen SMNt từ tế bào phôi sinh thiết 93,33% Xây dựng đuực quỵ trình chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi bệnh teo tủy kết hợp sử dụng hai kỹ thuật PCR-RFLP va minisequencing Áp dụng quy trình xây dựng 04 cặp vợ chồng tự nguyện tham gia chẩn đoàn di truyền bệnh teo tủy trước chuyển phơi có 03 phôi chuyển, cặp vợ chồng sinh em bé khỏe mạnh, cặp mang thai Kết luận: Lần Việt Nam, xây dựng áp dụng quy trình chần ổoốn di truyền trước chuyển phơi bệnh teo tủy cách sử dụng đồng thời hai kỹ thuật PCR-RFLP minisequencing Từ khóa: Bệnh teo tủy SUMMARY PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS OF SPINAL MUSCULAR ATROPHY Nga Nguyen Thi Thanh*, Tuan Tran Van*, Cau Dong Phu* Yen Dao Hai** (*: Military medical university; **: Coal and Mineral Hospital) Background: Spinal muscular atrophy (SMA) is a severe neurodegenerative autosomal recessive disorder Most o f patients are caused by the homozygous absence o f exon o f the telomeric copy o f the SMN gene (SMNt) on chromosome Until now, no specific treatment for SMA, only to treat the complications o f the disease IS crucial SMA usually presents severe, high mortality rate So, the SMA prevention issues should be top priority Denved from practical needs, we conducted the project “Preimplantation Genetic Diagnosis o f spinal muscular atrophy" with the following objective setting up a preimplantation genetic diagnosis assay o f SMA Materials and Method: This study was earned out on 17 patients and their parents, 30 blastomeres were obtained from surplus 525 embryos in day 3; 04 couples were Clinical PGD o f SMA Completing diagnostic procedures SMA genes by PCR - RFLP and Minisequencing Then, setting up a preimplantation genetic diagnosis protocol o f spinal muscular atrophy on biopsied blastomeres Results: The PCR-RFLP method was completing in fresh blood from 17 patients and their parents to detect the homozygous deletion in exon SMNt gene with the PCR efficiency of 96% The methods were also efficient, providing interpretable result in 93.33% (28/30) o f the blastomeres tested Four couples were treated using this method Three normal embryos were transferred resulting in one unaffected Ih /o h ir f h o n W cit l\J n n o w / n / o o / ỳọJ Ìr a n ni Cat ini Kr Jưj r K s i i t ỈỈKsCÃỈ ir ' o í Ịi fi '/ i/ U< ỊUC f/VẠ ( nl OQ ’ p ro ịA /ạ ¥ * \s c II w th e * iiiv tịr tĩí iiiu i tr ị is / Q Ịir - n a o a f iiliv O u V V /w u u » u i i j c o i O w i a r t u p f / iA u iu P r a ir n n la n t a f in n I r Genetic Diagnosis o f spinal muscular atrophy by using both o f the techniques o f PCR-RFLP and minisequencing in Vietnam, Keywords: spinal muscular atrophy ĐẶT VẮN ĐỀ VÀ MỤC TỈÊU Teo tuỷ (Spina! muscular atrophv - SMA) bệnh thần kinh di truyền lặn đột biến gen SMNt nằm nhiễm sắc thể số Tỷ lệ mắc bệnh SMA ià / 10.000 trẻ đẻ sống tần số người mang gen cộng đồng íà 1/50 Theo cách phân loại hành, dựa vào tuổi khởi phát bệnh mức độ biểu bệnh, bệnh teo tủy chia thành type, type I, type II, type III, type ! II chiếm tỷ lệ chủ yểu thường sớm lứa tuổi học biến chứng suy hô hấp Hiện nay, chưa có phương pháp chữa bệnh SMA mà đỉều trị triệu chứng ià chủ yếu trẻ em mắc bệnh teo tủy đời gánh nặng cho gia đình tâm lý tài Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi bệnh teo tủy” với mục tiêu: Hoàn thiện quy trình phất đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy từ máu toàn phần Xây dựng quy trình phát đột biến gen SMNt gây bệnh teo phôi thụ tinh ong nghiệm Xãy dựng ắp dụng quy trình chẩn đoản di truyền trước chuyển phôi bệnh teo tủy cho gia đình có bị bệnh đo mẫỉ exon 2CQSMNt (Khcmg maDg gen) lổObp — ^ 78bp Hình 1: Hỉnh ảnh minh họa kết đỉện di gel agarose 3% exon SMNt sáu khì ủ với enzym Hinfl ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu - Đối tượng nghiên cứu: 17 bệnh nhi Bệnh viện Nhi Trung ương chẩn đoán bị bệnh teo tủy đồng hợp tử exon gen SMNt bố mẹ họ (51 người), 30 mẫu tế bào phôi sinh thiết từ phồi dư ngày 3, 04 gia đình đâ tự nguyện tham gia PGD bệnh teo tỏy - Các bước hoàn thiện quy trình phát ổột biến gen gây bệnh SMNt từ máu toàn phần Thu mẫu máu toàn phần từ 51 người tham gia nghiên cứu, tách ADN, tiến hành kỹ thuật PCR-RFLP đế nhân phát đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy Kỹ thuật PCR-RFLP + Trình tự mồi nhân exon gen SMNt: F-5’cttccttttattttccttacagggatt-3’ R-5’-gtagggatgtagattaaccttttatct-3’ + Chu trình nhiệt: 960C phút; [940C phút, 540C phút, 720C phút] X 35 chu kỳ; 720C 10 phút, ù sản phẩm PCR vởi enzym Hinfl để phân biệt exon SMNỈ với exon SMNc Điện di gel agarose 3% kiểm tra kết Các bước xây dựng quy trình phát đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy phôi thụ tỉnh ống nahiệm: Tiến hành nhân toàn bộ gen từ 30 mẫu te bào phôi sinh thiết theo bước hướng dẫn kít GenomePlex® Single Ceil Whole Genome Amplification hãng Sigma Lấy sản phẩm bước để tiến hành kỹ thuật PCR-RFLP nhân phát đột biến gen SMNt gây bệnh Các bước xây dựng áp dụng quy trình chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi bệnh teo tủy cho gia đình có bị bệnh Nuôi phôi ngày tiến hành sinh thiết; sau tiến hành nhân tồn bộ gen từ mẫu tế bào phôi sinh thiết theo bước hướng dẫn kít GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification cùa hãng Sigma; tiến hành đồng thời hai kỹ thuật PCR-RFLP minisequencing để phát đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy Kỹ thuật minisequencing + Trình tự mồi nhân exon gen SMNt F-5’agactatcaacttaatttctgatca-3’ R- 5’- caccttccttctttttgattttgt-3’ + Trình tự mồi minisequencing: 5’ccttttattttcctta cag gg ttt-3 ’ Sản phẩm thu thêm vào đơn vị enzyme SAP, ủ theo chu trình nhiệt: 370C 750C 15 phút Điện di mao quản kiểm tra sản phẩm chạy minisequencirtg 526 người mang gen Tương tự, tiến hành gia đỉnh kết qua cho thấy 17 người cua 17 gia đinh phát đồng hợp exon gen SMNt, nghĩa ỉà 17 bệnh nhân bị bệnh teo tủy Kết luận hoàn toàn phù hợp với kết luận chẩn đoán gen cùa Viện Nhi Trung ương Như vậy, chúng tơi hồn thiện quy trình phát đột biến gen SMNÍ gây bệnh SMA từ máu tồn phần Xây dựng quy trình phát đột biến gen SMNt gây bệnh teo tùy tế bào phơi SMNc- Người Ỉ M thường Ngữịt bị bệnh E xon S M N Hình 2: Hình minh họa kết điện di mao quản sản phẩm nhân exon gen SMNt kỹ thuật minỉsequencing vị trí nucleotid 214 exon SMNt c, exon SMNc T vi vậy, với kỹ thuật minisequencing, người binh ỉhường xuất hai đỉnh tương ứng G exon SMNt A exon SMNc, người bị bệnh teo tủy đồng hợp exon SMNt có đỉnh tương ứng A cùa exon gen SMNc Ngoài ra, Đề đánh gỉá xem mẫu tế bào phôi sinh thiết có bị nhiễm ADN ngoại íaỉ hay không, tiến hành nhân polymorphic marker D5S641, D5S1977, D5S629 KẾT QUẢ Hoàn thiện quy trinh phát đột biến gen SMNt gây bệnh teo từ máu toàn phần P* P3 lO O bp p P5 E xa n sen S M N _ A _ Ladder 50bp L adder P2 ' C l 351 i p * *1 s Hình 4: Kết nhân exon gen SMNt từ sản phẩm nhản toàn bọ gen tế bào phôi: P1, P2, P3, P4, P5 tirơng ứng phôi 1, phôi 2, phôi 3, phôi 4, phôi ■W lốO bp bp Ấ 78bp Hình 3: Kết điện di gel agarose 3% sản phẩm nhân exon SMNt ỉừ máu toàn phần gia đỉnh SMA1 Bệnh nhân C1 có sản phẩm nhân exon gen SMNt có băng 160bp 102bp SMNc, nghĩa C1 bị đồng hợp exon gen SMNt nên bị bệnh teo Cịn bổ B1 Mẹ M1 có băng tương ứng exon gen SMNt SMNc nên họ ỉa Trong hỉnh cho thấy mẫu tế bào phôỉ sinh thiết từ mẫu phôi dứ có băng tương ứng exon gen SMNt, nghĩa ỉà phơi bình thường Điều hoàn toàn phù hợp với thực tế vỉ mẫu tế bào phơi sinh thỉet từ phôi dư bỉnh thường Tiếp tục thực với mẫu tế bào phơi cịn lại với hiệu phản ứng nhân exon gen SMNt từ tế bào phôi 93,33% (28/30) Xây dựng áp dụng quy trình chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi bệnh teo tùy cho gia đình có bị bệnh Từ kết đạt trên, xây dựng quy trỉnh chẩn đoán di truyền trước chuyển phơi bệnh íeo tùy thể sơ đồ tổng quát sau: 527 Áp dụng quy trình cho 04 gia đình tự nguyện tham gia nghiên cứu, kết sau: Bảng 1: Kết chần đoán di truyền trước chuyển phơi cùa 04 gia đình tham gia nghiên cứu STT Phôi ngày Phôi binh thưởng Số tế bào phôi chuyển Kết SMA1 Sinh em bé khỏẹ mạnh Phôi không phát triền SMA2 SMA18 SMA19 Mang thai (8 tháng) Đang (iiỉn hành SMNt gậỵ bệnh íeo ỉủy từ tế bào phôi Hơn nữa, lượng mau ẤDN thu nhiều có thề kếí hợp xét nghiệm chẩn đốn di truyền ỉrước chuyền phơi bệnh teo tủy với xéỉ nghiệm sàng lọc bất thường di truyền khác, từ góp phần làm tang tỷ lệ ìhụ thài PGD, bước , chọn giải pháp tiến hành đồng thời hai kỹ thuật PCR-RFLP minisequencing đe phát đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy từ tế bào phôi Một phủ nhận ỉhực hai xét nghiẹm đồng thời để so sánh đối chiếu kết luận chẩn đốn có tính chắn hơn, ổn định Tuy nhiên, với việc chẩn đoán truyền trước chuyển phơi bệnh ỉeo tủy điều chưa đủ SMA bệnh di truyền lặn, nên a trình sình thiết phơi thao tác kỹ thuật khơng tổt bị nhiễm ADN từ vào (từ bố, mẹ hoạc kỹ thuật Hiện nay, kỵ thuậỉ PCR-RFLP dùng phổ biến tồn giới để chẩn đốn gen bệnh teo tủy, có Việt nam, nên có íhể nói kỹ thuật có tính xác ổn định cao Hiệu phản ứng PCR nhân exon gen SMNt từ tế bào phơi thí ngiệm chúng tơi íà 93,33% (28/30) Kết tương đương với kết công bố số tác giả khác ỉrên giới (bảng ): Bảng 2: Hiệu phản ứng PCR nhân exon 7SMNt từ tế bào phôi cùa số tác giả giới Tác giả Dreesen J c „ cs (21 Daniels G cs Năm công bố Kỹ thuật PCR sử dụng — So” mẫu Số tế bào cỏ sản phấm phôi nhân nghiên exon cứu gen SMNt Hiệu PCR viên thao tác) thi chẩn đoán phơi bệnh íhành phơi 1998 ConsecutivePCR 25 25 100% 2001 Nested- PCR 34 31 91% 14 13 92,9% 48 45 93,8% 17 15 88,2% [11 Moutou c cs 2003 Duplex- PCR [5,6] Fiorentino Nested- PCR vả F- cs 2003 minisequencing [3] Girardet Multiplex- PCR A 2008 nested- PCR cs [4] Theo thống kê bảng thi tác giả tiến hành nhân exon gen SMNt trực tiếp từ tế bào phôi, phải tiến hành hai vịng PCR va mẫù tể bào phôi sinh thiếỉ thực xét nghiệm chẩn đoán lần kỹ thuật mà Thực tế, xây dựng quy trình chẩn đốn phải đảm bao hai yếu tồ đọ xác độ ổn định cao Nghĩa là, xét nghiệm chần đoán đỏ phải cỏ lặp lại nên kết hợp nhiều phương pháp đề chẩn đoan Vì vậy, chúng toi xây dựng quy trinh phát độí biến gen SMNt gây bệnh teo tủy từ tế bào phôi qua hai bước bản: Nhẩn toàn gen, khuếch đại gen lên hàng nghìn lần Sử dụng sản phẩm khuếch đại toàn gen iàm mẫu, tiến hành nhân exon gen SMNt hai kỹ thuật PCR-RFLP minisequencing để chẩn đốn bước , chúng tơi chọn giải pháp khuếch đại gen lên hàng nghìn íần trước làm xét nghiệm tiếp có ưu điểm vượt trội hẳn so với việc nhân exon gen SMNt ìrực tiếp từ tế bào phơi như: Lượng mẫu ADN thu nhiều, dùng cho nhiều lần xét nghiệm nhiều kỹ thuật khác nhau, thực tế tiến hành đong thời hai kỹ thuật PCRRFLP minisequencing để phát đột biến gen thường, dẫn đến hậu cấy chuyển phơi bệnh Để tránh nhược điểm đó, chúng tơi lựa chọn polymorphic marker D5S1977, D5S629, D5S641 để đánh gia nhiễm ADN ngoại lai chúng có tính đa hinh đặc trưng cho ca thề cao nên dễ dànẹ phân tích phơi sinh thiết có íính di truyền từ bo mẹ hay không KẾT LUẬN Đã hồn íhiện quy trình phát đột biến gen SMNt gây bệnh íeo tủy từ máu tồn phần hai kỹ thuật PCR-RFLP minisequencing với kha phát cao (17/17 gia đinh) Đa xây dựng quy trinh phát đột biến gen SMNt gâỵ bệnh teo tủy phôi thụ tinh ong nghiệm kỹ thuật PCR-RFLP minisequencing Đã xây dựng đữợc áp dụng thành cơng quy trình chẩn đoẩn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo tủy cho 04 gia đinh: có em bé khơng mang gen, khỏe mạnh đời, cặp mang ìhai 08 ĩháng, cặp theo dõi, từ đỏ làm giảm gánh nặng cho gia đình x i hội TAI LIỆU THAM KHẢO Daniels G et (2001) Six unaffected livebirths following preimplatation diagnosis for spinal muscular atrophy Mol.Hum Reprod., Vol.7, No.10 pp.995-1000 Dreesen J.c et (1998) Preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy Mol.Hum Reprod., VoL4, No.9 pp 881-885 Fiorentino F et al (2003) The minisequencing method: an aitemative strategy for preimpiantation genetic diagnosis of single gene disorders Mol.Hum Reprod., VoL 9, No pp 399-410 Girardet A et a! (2008) Efficient strategies for preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy, Fertility and sterility, Vo! 90, No Moutou c et (2001) Alỉele- specific amplification for preimpiantation genetic diagnosis (PGD) of spinal muscular atrophy Prenatal Diagnosis, 21,498-503 Moutou c et al (2003) Duplex PCR for Preimplantation genetic diagnosis (PGD) of spinal muscular atrophy, Prenatai diagnosis, 23, 685-689 529 ... gen SMNt gâỵ bệnh teo tủy phôi thụ tinh ong nghiệm kỹ thuật PCR-RFLP minisequencing Đã xây dựng đữợc áp dụng thành cơng quy trình chẩn đoẩn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo tủy cho 04 gia... chữa bệnh SMA mà đỉều trị triệu chứng ià chủ yếu trẻ em mắc bệnh teo tủy đời gánh nặng cho gia đình tâm lý tài Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi. .. gia nghiên cứu, kết sau: Bảng 1: Kết chần đốn di truyền trước chuyển phơi cùa 04 gia đình tham gia nghiên cứu STT Phơi ngày Phôi binh thưởng Số tế bào phôi chuyển Kết SMA1 Sinh em bé khỏẹ mạnh Phôi