Kết quả bước đầu nghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá thay đổi hình thái của phôi sau sinh thiết. 60 phôi được chia làm 2 nhóm. Nhóm 1: 30 phôi được sinh thiết vào ngày 3, tiếp tục nuôi cấy và lượng giá hình thái phôi sau sinh thiết, so sánh với 30 phôi nhóm chứng.

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI PHƠI SAU SINH THIẾT ĐỂ CHẨN ĐỐN DI TRUYỀN TRƢỚC CHUYỂN PHƠI Nguyễn Ngọc Diệp*; Nguyễn Thanh Tùng*; Quản Hồng Lâm* TĨM TẮT Việc đánh giá hình thái phơi thụ tinh ống nghiệm chưa phản ánh đầy đủ chất lượng thực phôi Để nâng cao chất lượng điều trị, chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Diagnosis/PGD) yêu cầu quan trọng, cấp thiết thực tiễn Chúng tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá thay đổi hình thái phôi sau sinh thiết 60 phôi chia làm nhóm Nhóm 1: 30 phơi sinh thiết vào ngày 3, tiếp tục nuôi cấy lượng giá hình thái phơi sau sinh thiết, so sánh với 30 phơi nhóm chứng Kết quả: tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phơi sống sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đường kính phơi độ dày màng suốt thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê * Từ khóa: Hình thái phơi; Chẩn đốn di truyền; Chuyển phôi initial results of embryo morphology after biopsy in preimplantation genetic diagnosis Summary In vitro fertilization, morphological assessment not fully reflect the true quality of the embryos To improve the quality of treatment, the preimplantation genetic diagnosis is one of the critical requirements, urgent and practical We conducted a study to examine the assessment of embryo morphology changes after biopsy 60 embryos were divided into groups, group 1: 30 embryo biopsy on day 3, and continue culture, morphology evaluation after biopsy, compared with the control group embryos Results: fragment ratio, embryo survival rate, blastocyst forming rate, the diameter of the embryo and ZP thickness change not significantly * Key words: Embryo morphology; Genetic diagnosis; Embryo implantation ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, việc lựa chọn phôi dựa tiêu chuẩn hình thái phơi Tuy nhiên, việc đánh giá hình thái chưa phản ánh đầy đủ chất lượng thực phôi, dựa vào thơng số hình thái, kết điều trị thụ tinh ống nghiệm bị hạn chế Nhiều phôi có số hình thái cao, khơng làm tổ không tạo trẻ khoẻ mạnh Ngược lại, có phơi có số hình thái hơn, lại tạo em bé bình thường Trong nhiều trường hợp, lý phôi không phát triển, * Häc viện Quân y Ng-ời phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Diệp (nndiep301@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/5/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 20/6/2013 Ngày báo đ-ợc đăng: 24/6/2013 33 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 không làm tổ bị sảy thai sớm chất lượng phơi Ví dụ, bị rối loạn số lượng nhiễm sắc thể gây ảnh hưởng đến sống phát triển phôi [4] Để nâng cao chất lượng điều trị đảm bảo cho đời hệ khoẻ mạnh thể lực, sáng suốt tinh thần, đồng thời sàng lọc số bệnh di truyền, việc chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (PGD) yêu cầu quan trọng, cấp thiết thực tiễn Nguyên tắc kỹ thuật PGD dựa việc thực thụ tinh ống nghiệm (TTTON) để tạo phôi, sau sinh thiết phơi phân tích nhiễm sắc thể ADN kỹ thuật FISH, CGH PCR [2] Kỹ thuật sinh thiết phôi kỹ thuật xâm lấn, đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ, xác Vì vậy, q trình thực ảnh hưởng đến chất lượng phôi Song song với công việc hồn thiện quy trình sinh thiết phơi, chúng tơi tiến hành đánh giá hình thái phơi, đồng thời theo dõi khả phát triển phôi sau sinh thiết Trên sở chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm: Đánh giá thay đổi hình thái phơi sau sinh thiết ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - 60 phơi người dư TTTON Chia đối tượng nghiên cứu thành nhóm: - Nhóm I: 30 phơi sinh thiết vào ngày q trình ni cấy - Nhóm II: 30 phơi khơng sinh thiết (nhóm chứng) * Tiêu chuẩn lựa chọn phôi để sinh thiết: phôi nuôi cấy đến ngày thứ môi trường nuôi cấy TTTON Phôi có tế bào đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương (fragment) < 20% (phôi độ III, độ IV) * Tiêu chuẩn loại trừ: phôi giai đoạn sớm độ I, độ II; tế bào không đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương ≥ 20% Phƣơng pháp nghiên cứu * Kích thích buồng trứng: - Phác đồ dài, sử dụng GnRHa để ức chế hormon FSH, LH tuyến yên, điều hoà xuống 14 ngày, ngày 21 chu kỳ kinh Sau sử dụng rFSH tái tổng hợp kích thích nang trứng - Phác đồ ngắn: dùng FSH từ N2 chu kỳ kinh - Phác đồ GnRH antagonists (Cetrotide, Serono, Mỹ): bệnh nhân (BN) kích thích FSH tái tổng hợp (Gonal-F, Serono), kết hợp với menopur từ ngày thứ chu kỳ kinh Sử dụng antagonist sau - ngày dùng FSH HCG (5.000 - 10.000 IU Profasi, Serono; Pregnyl, Organon) định có nang nỗn có kích thước > 17 mm * Đánh giá thụ tinh q trình ni cấy phơi: Khoảng 16 - 18 sau tiêm tinh trùng vào trứng, đánh giá trứng xem có thụ tinh hay không Nếu thụ tinh tạo thành phôi xuất tiền nhân thể cực Sau đó, đánh giá phôi ghi điểm thời điểm 36; 48 sau thụ tinh thu thập số lượng hình thể nhân, tế bào phơi thể loại mảnh vỡ để đánh giá chất lượng phôi [1, 3] * Sinh thiết tế bào phơi: 34 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Phương pháp chi tiết sinh thiết phôi bào từ phôi thời kỳ phân cắt tia laser sau: dùng kim sinh thiết hút nhẹ nhàng tế bào phôi vào ngày thứ (66 - 68 sau tiêm tinh trùng) phơi có tế bào có số lượng mảnh vỡ khơng q 30% Sau đó, chuyển phơi lại vào mơi trường ni cấy ngày [2] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình thái phơi q trình phát triển sau sinh thiết Bảng 1: Hình thái phơi q trình phát triển sau sinh thiết thời điểm ngày tuổi NGÀY NGÀY NGÀY X ± SD (tỷ lệ mảnh vỡ bào tương) (%) X ± SD (tỷ lệ phơi sống sót) X ± SD (tỷ lệ tạo thành blastocyst) p NHÓM (n = 30) Sinh thiết (I) 8,63 92,22 89,81 p1-2 < 0,01 Chứng (II) 8,82 93,13 90,10 NGÀY Tại thời điểm ngày 3, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, thời điểm ngày 4, tỷ lệ phơi sống sót thời điểm ngày 5, tỷ lệ tạo thành bastocyst nhóm trình phát triển sau sinh thiết khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Đƣờng kính phơi trình phát triển sau sinh thiết Bảng 2: NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY NHÓM (n = 30) X ± SD X ± SD X ± SD Sinh thiết (I) 150,20 ± 7,85 151,50 ± 6,32 152,40 ± 6,42 Chứng (II) 149,50 ± 8,15 152,50 ± 5,32 152,60 ± 7,45 p p1-2 < 0,01 Độ dày màng suốt phơi q trình phát triển sau sinh thiết thời điểm ngày tuổi Bảng 3: NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY X ± SD X ± SD X ± SD Sinh thiết (I) 16,10 ± 1,12 15,80 ± 1,13 15,70 ± 1,14 Chứng (II) 16,80 ± 1,20 16,30 ± 1,20 16,20 ± 1,22 NHÓM (n = 30) p1-2 < 0,01 * Một số hình ảnh phơi q trình sinh thiết ni cấy kính hiển vi đảo ngược Olympus gắn phần mềm máy sinh thiết Saturn Active x400: 36 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Hình 3: Phơi sau sinh thiết 36 Hình 1: Phơi trước sinh thiết Hình 4: Phơi màng sau sinh thiết 48 BÀN LUẬN Hình 2: Phơi sau sinh thiết Phương pháp kích thích buồng trứng hỗ trợ sinh sản thường tạo nhiều trứng để thụ tinh tạo nhiều phôi cho chu kỳ điều trị Những năm trước đây, hầu hết trung tâm điều trị TTTON có xu hướng chuyển nhiều phôi vào buồng tử cung để tăng tỷ lệ có thai, đồng thời làm tăng nguy đa thai Đa thai thường liên quan nhiều đến biến chứng cho mẹ Ví dụ, mẹ bị tiền sản giật, chảy máu sau đẻ, phải cắt bỏ tử cung đái đường mang thai, trẻ sơ sinh dễ bị nhẹ cân, đẻ non, bại não dị tật bẩm sinh Vì vậy, nhiều trung tâm TTTON cố gắng giới hạn số lượng phơi chuyển, chuyển đơn phơi vào buồng tử cung giảm nguy nói trên, ®ã giảm số lượng đa thai đáng kể Tuy nhiên, việc giảm số lượng phôi chuyển lại làm giảm tỷ lệ có thai điều trị hỗ trợ sinh sản Nguồn gốc vấn đề phôi chuyển khơng có khả sống phát triển Để làm tăng tỷ lệ có thai mong muốn, giảm số lượng phôi chuyển vào buồng tử cung, đồng thời giảm tỷ lệ nguy cho mẹ con, điều cần 37 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 thiết phải chọn lọc phơi có khả làm tổ cao để chuyển phôi Phương pháp phổ biến sử dụng đa số trung tâm TTTON để đánh giá phôi tốt hay xấu phần lớn dựa vào số hình thái, ví dụ số lượng, kích thước tế bào phơi, có mặt phân bố mảnh vỡ bào tương, đa nhân tốc độ phân chia phơi Đánh giá phơi theo hình thái nói chưa thể đảm bảo yêu cầu quan trọng khả sống phát triển bình thường phơi, có ưu điểm nhanh dễ dàng thực Đề tài chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi nghiên cứu chất lượng phôi trước làm tổ nhằm bổ sung thêm kỹ thuật sàng lọc phôi, đồng thời sàng lọc số bệnh di truyền trước chuyển phôi Trong khuôn khổ đề tài này, đánh giá biến đổi hình thái cấu trúc phơi sau sinh thiết [9] lĩnh vực Việt Nam, chưa có cơng trình nghiên cứu cách Vì vậy, đề tài có ý nghĩa khoa học thực tiễn, góp phần nâng cao chất lượng điều trị vô sinh Trong nghiên cứu, sử dụng cách phân độ phôi Andres Salumets CS (2001) [10], cách phân độ phôi đơn giản phù hợp với thời gian ngắn - phút quan sát phơi ngồi tủ nuôi cấy Kết nghiên cứu cho thấy cách đánh giá hình thái phơi hồn tồn tiên lượng khả sống phôi sau sinh thiết để chuyển cho bệnh nhân [3] Trong nghiên cứu, chụp ảnh tất phôi trước sau sinh thiết, tính tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phơi sống sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đo độ dày màng suốt đường kính phơi Kết cho thấy cấu trúc hình thái phơi ngày 3, ngày thay đổi trước sau sinh thiết đường kính phơi, độ dày màng suốt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Có thể minh chứng cho quy trình sinh thiết phôi mà sử dụng ổn định, đáng tin cậy Kết nghiên cứu phù hợp với Trương Đình Kiệt tác giả khác giới [2, 5, 6] KẾT LUẬN Qua nghiên cứu bước đầu, rút kết luận sau: Quy trình sinh thiết tia laser kỹ thuật tiến hành cách chu đáo tỉ mỉ, không ảnh hưởng đến cấu trúc trình phát triển phôi Thể tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phơi sống sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đường kính phơi độ dày màng suốt thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê TÀI LIỆU THAM KHẢO Đoàn Thị Hằng Nghiên cứu biến đổi hình thái cấu trúc phơi người ngày 3, ngày trước đông lạnh sau rã đông kỹ thuật thuỷ tinh hóa Luận án Tiến sỹ Y học 2013 Trương Đình Kiệt, Hồ Mạnh Tường Thiết lập quy trình kỹ thuật chẩn đốn di truyền tiền làm tổ (PGD) phôi TTTON Báo cáo đề tài cấp thành phố 4/2011 Nguyễn Thanh Tùng Nghiên cứu hình thái cấu trúc hợp tử giai đoạn tiền nhân phôi hai ngày tuổi bệnh nhân TTTON Luận án Tiến sỹ Y học 2011 Gardner D.K, Lane M Embryo culture Textbook of Assisted Reproductive Techniques 2001, pp.203-222 38 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Hardarson T Hanson C, Sjogren A Human embryos with uneven sized blastomeres have lower pregnancy and implantation rates: indication for aneuploidy and multinucleation Human Reproduction 2001, 16, pp.313-318 Kirstine Kirkegaard, Johnny Juhl Hindkjaer Human embryonic development after blastomere removal: a time-lapse analysis Hum Reprod 2012, Jan, 27 (1), pp.97-105 Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, Winston RM Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification Nature 1990, Apr 19, 344 (6268), pp.768-770 Kyrou D, Popovic-Todorovic B Does the estradiol level on the day of human chorionic gonadotrophin administration have an impact on pregnancy rates in patients treated with recFSH/GnRH antagonist? Hum Reprod 2009, Nov, 24 (11), pp.2902-2909 Joris H, De Vos A, Janssens R, Devroey P, Liebaers I Comparison of the results of human embryo biopsy and outcome of PGD after zona drilling using acid tyrode medium or a laser Fertil Steril 2006, Feb, 85 (2), pp.487-491 10 Salumets A, Hydén-Granskog C, Suikkari AM, Tiitinen A The predictive value of pronuclear morphology of zygotes in the assessment of human embryo quality Hum Reprod 2001, Oct, 16 (10), pp.2177-2181 39 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 40 ... nuôi cấy Kết nghiên cứu cho thấy cách đánh giá hình thái phơi hồn tồn tiên lượng khả sống phôi sau sinh thiết để chuyển cho bệnh nhân [3] Trong nghiên cứu, chụp ảnh tất phôi trước sau sinh thiết, ... thiết 36 Hình 1: Phơi trước sinh thiết Hình 4: Phơi màng sau sinh thiết 48 BÀN LUẬN Hình 2: Phơi sau sinh thiết Phương pháp kích thích buồng trứng hỗ trợ sinh sản thường tạo nhiều trứng để thụ... phơi lại vào mơi trường ni cấy ngày [2] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình thái phơi q trình phát triển sau sinh thiết Bảng 1: Hình thái phơi q trình phát triển sau sinh thiết thời điểm ngày tuổi NGÀY NGÀY