Tình hình nhiễm và một số đặc tính sinh học của virus cúm gia cầm

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ TRANG TÌNH HÌNH NHIỄM VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 VÀ H5N6 TẠI MỘT SỐ CHỢ BUÔN BÁN GIA CẦM THUỘC TỈNH QUẢNG NAM NĂM 2016- 2017 Chuyên ngành: Thú Y Mã ngành: 60 64 01 01 Người hướng dẫn: PGS.TS Tô Long Thành PGS.TS Phạm Ngọc Thạch NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Trang i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Tô Long Thành PGS.TS Phạm Ngọc Thạch tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Nội - Chẩn - Dược, Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Trang ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở Ðầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung virus cúm gia cầm 2.1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 2.1.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm Thế giới 2.1.3 Tình hình bệnh cúm gia cầm Việt Nam 2.1.4 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 2.1.5 Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm 10 2.1.6 Chẩn đoán bệnh 11 2.2 Một số đặc điểm virus cúm A 12 2.2.1 Phân loại danh pháp 13 2.2.2 Ðặc điểm hình thái cấu trúc virus cúm A 14 2.2.3 Các loại kháng nguyên 16 2.2.4 Phương thức biến đổi kháng nguyên HA NA 18 2.2.5 Ðộc lực virus cúm gia cầm 20 2.2.6 Sự xuất lưu hành nhánh virus A/H5N1, A/H5N6 Việt Nam 21 Phần Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu 26 3.1 Ðịa điểm nghiên cứu 26 3.2 Thời gian nghiên cứu 26 iii 3.3 Đối tượng - vật liệu nghiên cứu 26 3.4 Nội dung nghiên cứu 26 3.4.1 Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 26 3.4.2 Xác định số đặc tính sinh học virus cúm A/H5N1, A/H5N6 27 3.5 Phương pháp nghiên cứu 27 3.5.1 Phương pháp phát virus cúm A/H5N1, A/H5N6 27 3.5.2 Phương pháp giải trình tự gen 29 3.5.3 Phương pháp phân lập virus tế bào xơ phơi trứng gà có phơi 30 3.5.4 Xác định số EID50 31 3.5.5 Xác định số TCID50 31 3.5.6 Phương pháp Reed- Meunch 31 3.5.7 Phương pháp HA, HI giám định virus 32 Phần Kết thảo luận 34 4.1 Tình hình chăn ni gia cầm tỉnh Quảng Nam 34 4.2 Chẩn đoán cúm A/H5N1, A/H5N6 35 4.2.1 Chẩn đoán virus cúm týp A 35 4.2.2 Chẩn đoán virus cúm A/H5 37 4.2.3 Chẩn đoán virus cúm A/H5N1, A/H5N6 39 4.2.4 Kết xác định lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo loài 42 4.2.5 Kết xác định lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo tháng 44 4.2.6 Xác định nhánh virus cúm A/H5N1, A/H5N6 47 4.3 Kết xác định số đặc tính sinh học virus cúm A/H5N1 A/H5N6 55 4.3.1 Phân lập giám định virus cúm A/H5N1 A/H5N6 55 4.3.2 Tính thích ứng phơi gà (xác định số EID50 ) 56 4.3.3 Tính thích ứng tế bào xơ phơi gà (chỉ số TCID50) 58 Phần Kết luận kiến nghị 62 5.1 Kết luận 62 5.2 Kiến nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt ADN : Axit deoxyribonucleic AI (Avian Influenza) : Bệnh Cúm gia cầm ARN : Axit ribonucleic BCĐQG : Ban đạo quốc gia CGC : Cúm gia cầm Ct (Cycle Threshold) : Giá trị ngưỡng chu kỳ phản ứng CEF ( Chicken Embryo Fibroblats) : Tế bào xơ phôi gà DEF ( Duck Embryo Fibroblats) : Tế bào xơ phôi vịt EID50( Embryo Infection Dose 50%) : Liều gây nhiễm 50% phôi trứng ELISA Assay) : Phản ứng miễm dịch huỳnh quang gắn enzym FAO (Food and Agriculture Organisation) : Tổ chức Nông Lương Thế giới HA (Hemaglutinin) : Phản ứng ngưng kết hồng cầu HI (Hemagglutination Inhibition) : Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HPAI (Highly Pathogenic Avian Influenza ) : Cúm gia cầm thể độc lực cao IVPI (Intravenous Pathogenicity Index) : Chỉ số gây bệnh qua đường mạch máu LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza) : Cúm gia cầm thể độc lực thấp Mẫu1 : A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5QN2-1073/2017 Mẫu2 : A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5QN2-1071/2017CV OIE (Office International des Epizooties) : Tổ chức Thú y Thế giới rRT-PCR (Realtime Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) : Phản ứng chuỗi Polyme phiên mã ngược thời gian thực TCVN : Tiêu chuẩn quốc gia TCID50( Tissue Culture Infection Dose 50%) : Liều gây nhiễm 50% tế bào (Enzyme-Linked ImmunoSorbent WHO (World Health Organisation ) Tổ chức Y tế Thế giới v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Sự phân bố theo thời gian virus cúm gia cầm Việt Nam 25 Bảng 3.1 Primer probe để phát virus cúm gia cầm A/H5N1, A/H5N6 28 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng Real time RT-PCR 28 Bảng 3.3 Trình tự primer để nhân gen HA 29 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng RT-PCR 30 Bảng 3.5 Bảng tổng hợp số liệu để tính tốn số EID50 TCID50 32 Bảng 4.1 Kết xét nghiệm virus cúm A 35 Bảng 4.2 Kết xét nghiệm cúm A/H5 37 Bảng 4.3 Kết xét nghiệm virus cúm A/H5N1 A/H5N6 40 Bảng 4.4 Kết xét nghiệm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo loài 42 Bảng 4.5 Kết xét nghiệm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 gà theo tháng 44 Bảng 4.6 Kết xét nghiệm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 vịt theo tháng 46 Bảng 4.7 Danh sách mẫu gửi giải trình tự gen 48 Bảng 4.8 Danh sách chủng virus cúm sử dụng làm tham chiếu 49 Bảng 4.9 Kết xét nghiệm phân lập virus 55 Bảng 4.10 Kết thời gian gây chết phôi 57 Bảng 4.11 Kết theo dõi tỷ lệ sống/ chết phôi trứng gây nhiễm virus mẫu1, mẫu2 57 Bảng 4.12 Kết theo dõi virus gây nhiễm lên tế bào CEF 59 Bảng 4.13 Kết theo dõi bệnh tích tế bào CEF gây nhiễm virus mẫu1, mẫu 60 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sự phân bố virus cúm A/H5 Hình 2.2 Cấu trúc virus cúm A 14 Hình 2.3 Sự phân bố khơng gian nhánh virus cúm gia cầm từ tháng 7/2016 tới tháng 6/2017 24 Hình 4.1 Bản đồ tỉnh Quảng Nam 34 Hình 4.2 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A 36 Hình 4.3 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5/số mẫu xét nghiệm 38 Hình 4.4 Tỷ lệ nhiễm virus A/H5/Số mẫu dương tính cúm A 38 Hình 4.5 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 A/H5N6/số mẫu xét nghiệm 40 Hình 4.6 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6/số mẫu dương tính virus cúm A/H5 41 Hình 4.7 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo loài 43 Hình 4.8 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 gà theo tháng 45 Hình 4.9 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 vịt theo tháng 47 Hình 4.10 Cây phả hệ chủng virus cúm A/H5 52 Hình 4.11 Cây phả hệ chủng virus cúm A/H5 nhánh 2.3.2.1c 53 Hình 4.12 Cây phả hệ chủng virus cúm A/H5 nhánh 2.3.4.4b 54 Hình 4.13 Hình ảnh tế bào CEF phân lập chuẩn độ virus 61 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Trang Tên luận văn: Tình hình nhiễm số đặc tính sinh học virus cúm gia cầm A/H5N1 H5N6 số chợ buôn bán gia cầm thuộc tỉnh Quảng Nam năm 2016 – 2017 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 24 15 10 41 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 gà, vịt số chợ Quảng Nam qua để có biện pháp quản lý việc buôn bán gia cầm sống chợ - Xác định độc lực nhánh virus cúm A/H5N1, A/H5N6 lưu hành Quảng Nam biến đổi nhánh virus cúm A/H5N1, A/H5N6 (nếu có) giúp cho việc quản lý dịch bệnh đánh giá hiệu sử dụng vắc xin Quảng Nam Phương pháp nghiên cứu - Xét nghiệm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 phương pháp rRT – PCR từ mẫu swab thu - Lập phả hệ dựa kết giải trình tự gen HA chủng virus cúm A/H5N1 A/H5N6 thu thập địa bàn tỉnh Quảng Nam sử dụng phần mềm Biodit Mega - Nuôi cấy, phân lập virus cúm A/H5N1, A/H5N6 phôi trứng gà tế bào xơ phôi Kết kết luận Kết đánh giá tỷ lệ nhiễm virus cúm cho thấy, virus cúm A/H5N1 A/H5N6 lưu hành gà vịt buôn bán số chợ thuộc địa bàn tỉnh Quảng Nam giai đoạn tháng cuối năm 2016 tháng đầu năm 2017 Tỷ lệ lưu hành virus cúm A 10,46 %, virus cúm A/H5 1,94 %, virus cúm A/H5N1 0,28 % A/H5N6 1,2%.Tỷ lệ lưu hành virus cúm H5N6 cao so với H5N1 tỷ lệ mắc vịt cao gà Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 gia cầm chợ (chợ Điện Bàn, chợ Núi Thành chợ Phú Ninh) cao vào tháng 11 tháng với H5N6, H5N1 tháng 2, thấp vào khoảng từ tháng đến tháng 10 Kết phân tích di truyền (cây phả hệ dựa trình tự gen HA virus cúm thu thập từ chợ buôn bán gia cầm sống địa bàn tỉnh Quảng Nam) cho viii thấy chủng virus cúm A/H5N1 thuộc nhánh virus 2.3.2.1c, chủng virus cúm A/H5N6 thuộc nhánh 2.3.4.4 b Đây nhánh virus lưu hành rộng khắp nước, đặc biệt tỉnh Miền Trung Do đó, sử dụng loại vắc xin NavetVifluvac (do Công ty Navetco sản xuất) vắc xin H5N1 Re-5 (nhập từ Trung Quốc) theo khuyến cáo Cục Thú y để phòng bệnh Cúm gia cầm Quảng Nam Mơi trường thích hợp cho phát triển nhân lên virus CGC môi trường phôi trứng gà môi trường tế bào xơ phôi gà Như vậy, với kết chuẩn độ virus môi trường nuôi dưỡng có hiệu giá tương đồng với nhau: 108 EID50/ml 107,9 EID50/ml, 107,2TCID50/ml 107,4TCID50/ml ix sớm nguy dịch CGC xảy ra, chủ động nâng cao cơng tác phịng chống bệnh CGC 4.3.2 Tính thích ứng phơi gà (xác định số EID50 ) Virus cúm nói chung virus CGC A/H5N1 độc lực cao có khả phát triển tốt phơi gà, phơi gà 9- 10 ngày tuổi thường sử dụng để phân lập CGC độc lực cao cơng tác chẩn đốn để giữ gống virus Tuy nhiên, chủng virus CGC có đặc điểm khác nhân lên phôi trứng, thể gây nhiễm phôi, gây chết phôi chuẩn độ tối ưu chủng virus khác khác Virus có độc lực thấp thường giết chết phôi trứng chậm Để xác định đặc tính thích ứng chủng virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1073/2017 = Mẫu1, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-071/2017= Mẫu2 phôi gà Chúng tiến hành: Phôi trứng lấy từ đà gà khỏe mạnh chưa tiêm vắc xin CGC H5N1 không nhiễm virus CGC tự nhiên để tránh tác động có kháng thể từ gà mẹ tiêm phịng Trứng mua từ ngày tuổi ấp tiếp1 ngày để ổn định phịng thí nghiệm trước sử dụng cho thí nghiệm xác định thích nghi chủng virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN21073/2017, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017 phôi gà Chủng virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1073/2017, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017 chia làm ống nhỏ sau phân lập giữ nhiệt độ -860C Trước tiến hành thí nghiệm hỗn dịch virus kiểm tra vô trùng theo thường quy pha thành nhiều nồng độ từ 10-1-10-8 dung dịch đệm PBS có pH 7,2 Tiến hành gây nhiễm cho phôi trứng với nồng độ từ 10-3-10-8 vào xoang niệu mô phôi trứng, nồng độ gây nhiễm cho phơi với liều 100µl/ phơi, ấp nhiệt độ 370C, theo dõi lần/ ngày cách khoảng vịng ngày, loại phơi chết trước 24 Trong thí nghiệm có sử dụng phôi trứng tiêm dung dịch PBS làm đối trứng âm ấp điều kiện Các phôi trứng chết thời gian theo dõi làm lạnh nhiệt độ 280C vòng 24 mạch máu co lại tiến hành thu hoạch dịch niệu mô Những phôi trứng sống sau thời gian theo dõi thu dịch niệu mô kiểm tra phản ứng HA để xác định khả nhiễm virus phôi trứng xác định số EID50 theo công thức Reed-Muench 56 Bảng 4.10 Kết thời gian gây chết phôi Mẫu Số phôi gây nhiễm 0-24h 25-48h 49-72h 30 30 0 10 10 5 Mẫu1 Mẫu2 73-96h Tổng số phôi chết Tỷ lệ (%) 20 19 67 63 Theo dõi số phôi chết Kết bảng 4.10 cho thấy: Khơng có phơi chết trước 24 giờ, virus bắt đầu giết chết phôi vòng ngày từ sau gây nhiễm Điều phù hợp với nghiên cứu trước (Wanasawaeng cs, 2009) nhận xét virus độc lực cao thường giết chết phơi trứng vịng 48 sau gây nhiễm lên xoang niệu mô Bảng 4.11 Kết theo dõi tỷ lệ sống/ chết phôi trứng gây nhiễm virus mẫu1, mẫu2 Mẫu Mẫu1 Số Số phôi phôi bị không nhiễm nhiễm Tỷ lệ nhiễm Không virus Tổng nhiễm cộng(A+B) (%) A/ virus (B) (A+B) HG pha loãng 10-3 5 20 20 100 10-4 5 15 15 100 10-5 5 10 10 100 10-6 5 83,3 10-7 5 16,7 10-8 5 10 10 ĐC (-) 3 Nhiễm virus (A) 107 (theo cơng thức Reed- Muench) EID50 /0,1ml Mẫu2 Số tích lũy Số phôi gây nhiễm 10-3 5 19 19 100 10-4 5 14 14 100 10-5 5 9 100 10-6 5 80 10-7 5 16,7 10-8 ĐC () 5 10 10 3 EID50 /0,1ml 106,9 (theo công thức Reed- Muench) 57 Ở nồng độ 10-3, tồn phơi trứng (mẫu1, mẫu2) chết vịng 40 sau gây nhiễm Ở nồng độ 10-4, tồn số phơi trứng chết ngày thứ 2, khoảng 40-48 sau nhiễm Ở nồng độ 10-5 giết chết tồn phơi trứng thời gian lâu nồng độ 10-3 10-4, không 72 kể từ nhiễm Ở nồng độ 10-6 có phơi thường chết 72-96 Ở độ pha lỗng mẫu1 có phơi sống, mẫu2 cịn phơi cịn sống Như vậy, nồng độ thường có 1-2 phơi sống Nồng độ pha lỗng cao gây chết phơi 10-7, nhiên có 1/5 phơi chết thời điểm 96 phơi cịn sống mẫu1và mẫu2 Ở nồng độ cao 10-8, toàn số phơi sống bình thường Đối chứng âm: phơi sống khỏe mạnh bình thường Để xác định khả gây nhiễm phôi trứng virus chúng tơi thu dịch niệu mơ tồn số phơi chết sống kiểm tra đặc tính gây ngưng kết hồng cầu (HA) gà Chỉ dịch niệu mô từ trứng chết có khả gây ngưng kết hồng cầu gà với hiệu giá HA 8-9log2, dịch niệu mô trứng sống không gây ngưng kết hồng cầu gà Bên cạnh việc kiểm tra đặc tính gây ngưng kết hồng cầu, mổ trứng, thu phôi để kiểm tra bệnh tích phơi Tồn số phơi chết có triệu chứng xuất huyết lan tràn, phơi cịi cọc, phát triển Phơi đối chứng phát triển bình thường Kết cho thấy virus cúm có khả thích ứng phát triển tốt phơi trứng (kết tính chuẩn độ virus cúm mẫu1 mẫu2 là: 107 EID50 106,9 EID50 liều gây nhiễm 100µl) Chuẩn độ virus môi trường phôi trứng gà 108 EID50/ml 107,9 EID50/ml 4.3.3 Tính thích ứng tế bào xơ phôi gà (chỉ số TCID50) Bên cạnh việc xác định tính thích ứng phơi trứng gà chúng tơi tiến hành song song việc xác định tính thích ứng virus tế bào xơ phôi gà 58 Phôi gà ngày tuổi kiểm tra khỏe mạnh, bình thường, mổ trứng để chế tế bào CEF Tế bào nuôi trai T75 phát triển thảm nuôi dưỡng môi trường MEM với 5% huyết thai bê Tách tế bào CEF từ chai T75 chuyển sang đĩa nuôi cấy 96 giếng để tiến hành chuẩn độ Virus pha lỗng chuẩn độ phơi gà sử dụng nồng -2 độ 10 -10-8 để chuẩn độ virus Mỗi nồng độ virus pha loãng nhiễm cho giếng với lượng 100µl giếng Đĩa tế bào nhiễm virus nuôi tủ ấm 370C 5% CO2 Ni tế bào vịng ngày, theo dõi hàng ngày để quan sát bệnh tích (CPE) (bảng 4.12) Bảng 4.12 Kết theo dõi virus gây nhiễm lên tế bào CEF Số giếng Tổng Theo dõi số giếng có CPE gây Mẫu nhiễm 0-24h Mẫu1 30 Mẫu2 30 số có Tỷ lệ 49-72h 73-96h CPE (%) 10 14 24 80 10 14 24 80 25-48h Từ nồng độ 10-2-10-5 toàn giếng mẫu1 mẫu2 có CPE thảm tế bào bị virus phá hủy vòng 24-72 Ở nồng độ pha lỗng 10-6 mẫu1 có giếng có CPE, cịn mẫu2 có giếng có CPE Ở nồng độ pha lỗng 10-7 có giếng nhiễm virus mẫu1, mẫu2 khơng có giếng nhiễm virus Ở nồng độ pha loãng 10-8 mẫu khơng có giếng tế bào có tượng thảm tế bào bị phá hủy, khơng có CPE, tức khơng có tượng nhiễm virus 59 Bảng 4.13 Kết theo dõi bệnh tích tế bào CEF gây nhiễm virus mẫu1, mẫu2 Mẫu Mẫu1 HG pha lỗng Số giếng gây nhiễm Số giếng có CPE Số tích lũy Số giếng khơng có CPE Nhiễm virus (A) virus Tổng cộng(A+B) (B) virus (%) A/ (A+B) -2 10 5 24 24 100 10-3 5 19 19 100 10-4 5 14 14 100 10-5 5 9 100 10-6 57,1 10-7 25 10-8 5 11 11 ĐC (-) 5 106,2 TCID 50 /0,1ml Mẫu2 Không nhiễm Tỷ lệ nhiễm 10-2 5 24 24 100 10-3 5 19 19 100 10-4 5 14 14 100 10-5 5 9 100 10-6 4 80 10-7 5 6 10-8 5 11 11 ĐC (-) 106,4 TCID 50 /0,1ml Với kết chuẩn độ virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5QN2-1073/2017, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017 thực tế bào CEF, chúng tơi nhận thấy virus thích nghi phát triển môi trường tế bào CEF (kết tính chuẩn độ virus cúm mẫu1 60 mẫu2 là: 106,2TCID50 106,4TCID50 liều gây nhiễm 100µl) Chuẩn độ virus môi trường tế bào CEF 107,2TCID50/ml 107,4TCID50/ml Như vậy, với kết chuẩn độ virus mơi trường ni dưỡng có hiệu giá tương đồng với nhau: 108 EID50/ml 107,9 EID50/ml, 107,2TCID50/ml 107,4TCID50/ml Song song với việc sử dụng tế bào xơ phôi gà (CEF-chicken embrio Fibroblast), sử dụng tế bào xơ phôi vịt (DEF-Duck embrio Fibroblast) tế bào xơ phôi ngan (MDEF-Muscovy Duck embrio Fibroblast) tiến hành việc gây nhiễm chuẩn độ cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD16H5-QN2-1073/2017, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017 Kết cho thấy virus nhiễm phát triển tốt loại tế bào DEF, MDEF (kết chi tiết khơng trình bày) Ngoài ra, virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1073/2017, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017 phát triển tốt mơi trường tế bào dịng MDCK mà khơng cần xử lý tripsine TPCK Hình 4.13 Hình ảnh tế bào CEF phân lập chuẩn độ virus 61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu thu được, rút số kết luận sau: - Tỷ lệ dương tính với type A (gen M5) 10,46 % tỷ tệ dương tính A/H5 1,94 %, với subtype A/H5N1 0,28 %, A/H5N6 1,2% - Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5(2,92%), virus cúm A/H5N1(0,42%), A/H5N6 (1,81%) vịt cao so với gà (ở gà không phát cúm A/H5) - Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 gia cầm chợ (chợ Điện Bàn, Núi Thành, Phú Ninh) cao vào khoảng thời gian từ tháng 11 đến tháng 2, tháng thấp vào khoảng từ tháng đến tháng - Vào thời điểm tiến hành nghiên cứu (6 tháng cuối năm 2016 đến tháng đầu năm 2017), virus cúm A/H5N1, A/H5N6 phát Quảng Nam thuộc subclade 2.3.2.1c 2.3.4.4.b - Mơi trường thích hợp cho phát triển nhân lên virus CGC môi trường phôi trứng gà môi trường tế bào xơ phôi gà Như vậy, với kết chuẩn độ virus mơi trường ni dưỡng có hiệu giá tương đồng với nhau: 108 EID50/ml 107,9 EID50/ml, 107,2TCID50/ml 107,4TCID50/ml 5.2 KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục giám sát tiến hành tìm hiểu thêm subtype HxNy lưu hành chợ buôn bán gia cầm sống Quảng Nam để chủ động phòng chống bệnh có hiệu cao Tăng cường cơng tác giám sát chủ động, vệ sinh, tiêu độc, khử trùng,… chợ buôn ban gia cầm đặc biệt chợ có mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1, A/H5N6 Tiếp tục sử dụng vaccine theo khuyến cáo Cục Thú y với virus CGC nhánh 2.3.2.1c 2.3.4.4b 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài Liệu Tiếng Việt: Ban đạo Quốc gia phòng chống bệnh cúm gia cầm (2005) Báo cáo tổng kết công tác năm phòng chống dịch cúm gia cầm, Hội nghị tổng kết năm phòng chống dịch cúm gà, ngày 18 tháng năm 2005 , Hà Nội Bùi Quang Anh (2005) Báo cáo dịch cúm gia cầm, Hội nghị kiểm kiểm soát dịch cúm gia cầm khu vực châu Á FAO, OIE tổ chức, từ 23 – tháng năm 2005, thành phố Hồ Chí Minh Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ (2004) Bệnh cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn đoán kiểm soát dịch bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr 69 -75 Cục Thú y (2004) Bệnh cúm gia cầm biện pháp phòng chống Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Cục Thú y (2016) Báo cáo kết công tác năm 2016 kế hoạch năm 2017 FAO (2016) Bài học kinh nghiệm năm hoạt động hỗ trợ kỹ thuật tăng cương ứng phó khẩn cấp với cúm gia cầm độc lực cao Việt Nam Lê Thanh Hoà (2004) Họ Orthomyxoviridae nhóm virus cúm A gây bệnh cúm gà người, Viện khoa học công nghệ Lê Thanh Hòa (2006) Y-sinh học phân tử (quyển 1) Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Văn Năm (2004) Kết khảo sát biểu lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh cúm gia cầm số sở chăn ni tỉnh phía bắc Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 11 tr 86-90 10 Nguyễn Đăng Thọ, Nguyễn Hoàng Đăng, Đỗ Thị Hoa Đàm Thị Vui, Nguyễn Thị Điệp Mai Thùy Dương, Nguyễn Viết Không Tô Long Thành (2016) Virus cúm gia cầm độc lực cao H5N6 Việt Nam năm 2014 Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y 13 (1) tr 18-28 11 Nguyễn Tiến Dũng (2004) Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 Việt Năm năm 2003-2004 Khoa học kĩ thuật Thú y 11 tr 6-14 12 Tô Long Thành (2004) Thông tin cập nhật tái xuất bệnh cúm gia cầm nước Châu Á Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(4) tr 87- 93 13 Tô Long Thành (2006) Thông tin cập nhật cúm gia cầm vacxin phòng chống bệnh cúm gia cầm Tạp chí khoa học kĩ thuật thú y tr 66-67 63 14 Tống Xuân Độ (2009) Giám sát lưu hành virus cúm A/H5N1 đánh giá hiệu sử dụng vaccine cúm gia cầm địa bàn tỉnh Quảng Ninh Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tr 69 15 Trương Văn Dung Nguyễn Viết Không (2004) Một số hoạt động nghiên cứu khoa học Viện Thú y Quốc gia bệnh Cúm gia cầm giải pháp khoa học công nghệ thời gian tới Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11 (3) tr 62-68 II Tài Liệu Tiếng Anh: Alexander D J (2000) A review of avian influenza in different bird species Veterinary Microbiology Vol 74 (1) pp 3-13 Aoki F Y., G Boivin and N Roberts (2007) Influenza virus susceptibility and resistance to oseltamivir Antiviral therapy Vol 12 (4 Pt B) pp 603-616 Baigent S J and J W McCauley (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture Virus Research Vol 79 (1) pp 177-185 Bauer T T., S Ewig, A C Rodloff and E E Müller (2006) Acute Respiratory Distress Syndrome and Pneumonia: A Comprehensive Review of Clinical Data Clinical Infectious Diseases Vol 43 (6) Beard C W., W M Schnitzlein and D N Tripathy (1991) Protection of chickens against highly pathogenic avian influenza virus (H5N2) by recombinant fowlpox viruses Avian diseases Vol pp 356-359 Beard C.W Avian Influenza (1998) In Foreign Animal Diseases Richmond, VA: United States Animal Health Association, 71-80 Bender C., H Hall, J Huang, A Klimov, N Cox, A Hay, V Gregory, K Cameron, W Lim and K Subbarao (1999) Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997–1998 Virology Vol 254 (1) pp 115-123 Bosch F., W Garten, H.-D Klenk and R Rott (1981) Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins: primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of Avian influenza viruses Virology Vol 113 (2) pp 725-735 64 Cardona C., K Yee and T Carpenter (2009) Are live bird markets reservoirs of avian influenza? Poultry science Vol 88 (4) pp 856-859 10 Castrucci M R and Y Kawaoka (1993) Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus Journal of virology Vol 67 (2) pp 759-764 11 Chen H., G J D Smith, K S Li, J Wang, X H Fan, J M Rayner, D Vijaykrishna, J X Zhang, L J Zhang, C T Guo, C L Cheung, K M Xu, L Duan, K Huang, K Qin, Y H C Leung, W L Wu, H R Lu, Y Chen, N S Xia, T S P Naipospos, K Y Yuen, S S Hassan, S Bahri, T D Nguyen, R G Webster, J S M Peiris and Y Guan (2006) Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: Implications for pandemic control Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Vol 103 (8) pp 2845-2850 12 Chen L.-M., C T Davis, H Zhou, N J Cox and R O Donis (2008) Genetic compatibility and virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2 influenza A viruses PLoS pathogens Vol (5) pp e1000072 13 Chu D.-H., M Okamatsu, K Matsuno, T Hiono, K Ogasawara, L T Nguyen, L Van Nguyen, T N Nguyen, T T Nguyen and D Van Pham (2016) Genetic and antigenic characterization of H5, H6 and H9 avian influenza viruses circulating in live bird markets with intervention in the center part of Vietnam Veterinary microbiology Vol 192 pp 194-203 14 Claas E C., A D Osterhaus, R Van Beek, J C De Jong, G F Rimmelzwaan, D A Senne, S Krauss, K F Shortridge and R G Webster (1998) Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus The Lancet Vol 351 (9101) pp 472-477 15 Conenello G M., D Zamarin, L A Perrone, T Tumpey and P Palese (2007) A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence PLoS pathogens Vol (10) pp e141 16 Cox N and K Subbarao (2000) Global epidemiology of influenza: past and present Annual review of medicine Vol 51 (1) pp 407-421 17 De Wit E, Fouchier RA (2008) Emerging influenza J Clin Virol 41(1):1-6 Review 65 18 Gambotto A., S M Barratt-Boyes, M D de Jong, G Neumann and Y Kawaoka (2008) Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus The Lancet Vol 371 (9622) pp 1464-1475 19 Hilleman M R (2002) Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control Vaccine Vol 20 (25) pp 3068-3087 20 Horimoto T and Y Kawaoka (2001) Pandemic threat posed by avian influenza A viruses 10.1128/cmr.14.1.129-149.2001: 10.1128/cmr.14.1.129149.2001 Clin Microbiol Rev Vol 14 (1) pp 129-49 21 Horimoto T and Y Kawaoka (1994) Reverse genetics provides direct evidence for a correlation of hemagglutinin cleavability and virulence of an avian influenza A virus Journal of virology Vol 68 (5) pp 3120-3128 22 HUI D S C (2008) Review of clinical symptoms and spectrum in humans with influenza A/H5N1 infection Respirology Vol 13 (s1) 23 Ito T., J N S Couceiro, S Kelm, L G Baum, S Krauss, M R Castrucci, I Donatelli, H Kida, J C Paulson and R G Webster (1998) Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential Journal of virology Vol 72 (9) pp 7367-7373 24 Kayali G., A Kandeil, R El-Shesheny, A S Kayed, M M Gomaa, A M Maatouq, M M Shehata, Y Moatasim, O Bagato and Z Cai (2014) Active surveillance for avian influenza virus, Egypt, 2010–2012 Emerging infectious diseases Vol 20 (4) pp 542 25 Lee Y.-J., H.-M Kang, E.-K Lee, B.-M Song, J Jeong, Y.-K Kwon, H.-R Kim, K.-J Lee, M.-S Hong and I Jang (2014) Novel reassortant influenza A (H5N8) viruses, South Korea, 2014 Emerging infectious diseases Vol 20 (6) pp 1087 26 27 Leung Y C., L.-J Zhang, C.-K Chow, C.-L Tsang, C.-F Ng, C.-K Wong, Y Guan and J M Peiris (2007) Poultry drinking water used for avian influenza surveillance Emerging infectious diseases Vol 13 (9) pp 1380 Liu C.-G., M 28 Liu, F Liu, R Lv, D.-F Liu, L.-D Qu and Y Zhang (2013) Emerging multiple reassortant H5N5 avian influenza viruses in ducks, China, 2008 Veterinary Microbiology Vol 167 (3) pp 296-306 27 Lupiani B and S M Reddy (2009) The history of avian influenza Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases Vol 32 (4) pp 311-323 66 28 Luong G, Palese P (1992) Genetic analysis of influenza virus Curr Opinion Gen Develop 2: 77-81 29 Macken C A., R J Webby and W J Bruno (2006) Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus Journal of General Virology Vol 87 (10) pp 2803-2815 30 Matrosovich M., N Zhou, Y Kawaoka and R Webster (1999) The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties Journal of virology Vol 73 (2) pp 1146-1155 31 Murphy B R (1996) Orthomyxoviruses Fields virology Vol pp 1397-1445 32 Nguyen D T., J E Bryant, C T Davis, L V Nguyen, L T Pham, L Loth, K Inui, T Nguyen, Y Jang and T L To (2014) Prevalence and distribution of avian influenza a (H5N1) virus clade variants in live bird markets of Vietnam, 2011–2013 Avian diseases Vol 58 (4) pp 599-608 33 Nguyen T D., T V Nguyen, D Vijaykrishna, R G Webster, Y Guan, J M Peiris and G J Smith (2008) Multiple Sublineages of Influenza A Virus (H5N1), Vietnam, 2005− 2007 Emerging infectious diseases Vol 14 (4) pp 632 34 Nguyen T, CT Davis, A Balish , P Rivailler, R Loughlin, B Shu, J Jones, I Perry, BK Kapella, J Kile A Klimov, RO Donis (2010) Molecular epidemiology of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses in Vietnamese poultry, 20082009 Poster presentation Option VII meeting in Hongkong, 2010 35 Nguyen T, P Rivailler, C T Davis, T Hoa do, A Balish, N H Dang, J Jones, D T Vui, N Simpson, N T Huong, B Shu, R Loughlin, K Ferdinand, S E Lindstrom, I A York, A Klimov and R O Donis (2012) Evolution of highly pathogenic avian influenza (H5N1) virus populations in Vietnam between 2007 and 2010 Virology 432(2): 405-416 36 OIE FAO (2016) Influenza A Cleavage Sites Truy cập ngày 10/5/2017từhttp://www.offlu.net/fileadmin/home/en/resourcecentre/pdf/Influen za_A_Cleavage_Sites.pdf 37 Offeddu V., B J Cowling and J M Peiris (2016) Interventions in live poultry markets for the control of avian influenza: a systematic review One Health Vol pp 55-64 67 38 Organization W H Evolution of the influenza A (H5) haemagglutinin: WHO/OIE/FAO H5 Working Group reports a new clade designated 2.3 4.4 [cited 2015 Jan 19] 39 Pfeiffer D U., M J Otte, D Roland-Holst, K Inui, N Tung and D Zilberman (2011) Implications of global and regional patterns of highly pathogenic avian influenza virus H5N1 clades for risk management The Veterinary Journal Vol 190 (3) pp 309-316 40 Phan M Q., W Henry, C B Bui, D H Do, N V Hoang, N T Thu, T T Nguyen, T D Le, T Q Diep, K Inui, J Weaver and J Carrique-Mas (2012) Detection of HPAI H5N1 viruses in ducks sampled from live bird markets in Vietnam Epidemiology and Infection Vol 141 (3) pp 601-611 41 Prel A., G Le Gall-Recule and V Jestin (2008) Achievement of avian influenza virus-like particles that could be used as a subunit vaccine against low-pathogenic avian influenza strains in ducks Avian Pathology Vol 37 (5) pp 513-520 42 Römer-Oberdörfer A., J Veits, D Helferich and T C Mettenleiter (2008) Level of protection of chickens against highly pathogenic H5 avian influenza virus with Newcastle disease virus based live attenuated vector vaccine depends on homology of H5 sequence between vaccine and challenge virus Vaccine Vol 26 (19) pp 2307-2313 43 Scholtissek C., J Stech, S Krauss and R G Webster (2002) Cooperation between the hemagglutinin of avian viruses and the matrix protein of human influenza A viruses Journal of virology Vol 76 (4) pp 1781-1786 44 Sims L., T Ellis, K Liu, K Dyrting, H Wong, M Peiris, Y Guan and K Shortridge (2003) Avian influenza in Hong Kong 1997–2002 Avian diseases Vol 47 (s3) pp 832-838 45 Soares Magalhães R J., A Ortiz-Pelaez, K L L Thi, Q H Dinh, J Otte and D U Pfeiffer (2010) Associations between attributes of live poultry trade and HPAI H5N1 outbreaks: a descriptive and network analysis study in northern Vietnam BMC Veterinary Research Vol (1) pp 10 46 Stubb, E.L (1965) Fowl plague In H.E Biester, and L.H Schwarte (eds), Disease of Poultry 5th ed Iowa State Univeristy Press, Ames, pp 813-822 68 47 Sturm-Ramirez K., D Hulse-Post, E Govorkova, J Humberd, P Seiler, P Puthavathana, C Buranathai, T Nguyen, A Chaisingh and H Long (2005) Are ducks contributing to the endemicity of highly pathogenic H5N1 influenza virus in Asia? Journal of virology Vol 79 (17) pp 11269-11279 48 Subbarao K and T Joseph (2007) Scientific barriers to developing vaccines against avian influenza viruses Nature Reviews Immunology Vol (4) pp 267-278 49 Subbarao K., A Klimov, J Katz, H Regnery, W Lim, H Hall, M Perdue, D Swayne, C Bender and J Huang (1998) Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness science Vol 279 (5349) pp 393-396 50 Swayne D E (2012) Impact of Vaccines and Vaccination on Global Control of Avian Influenza Avian Diseases Vol 56 (4s1) pp 818-828 51 Thanh N T L., N H T Vy, H T A Xuyen, H T Phuong, P N Tuyet, N T Huy, B Nguyen-Van-Yen, H M Lam and M F Boni (2017) No Evidence of On-farm Circulation of Avian Influenza H5 Subtype in Ca Mau Province, Southern Vietnam, March 2016 – January 201 PLoS Currents Vol 52 Tumpey T M., D L Suarez, L E Perkins, D A Senne, J.-g Lee, Y.-J Lee, I.-P Mo, H.-W Sung and D E Swayne (2002) Characterization of a highly pathogenic H5N1 avian influenza A virus isolated from duck meat Journal of virology Vol 76 (12) pp 6344-6355 53 Uiprasertkul M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A Kongchanagul, K Ungchusak, S Angkasekwinai, K Chokephaibulkit, K Srisook, N Vanprapar and P Auewarakul (2007) Apoptosis and Pathogenesis of Avian Influenza A (H5N1) Virus in Humans Emerging Infectious Diseases Vol 13 (5) pp 708-712 54 Wagner R., M Matrosovich and H D Klenk (2002) Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections Reviews in medical virology Vol 12 (3) pp 159-166 55 Wan X.-F., L Dong, Y Lan, L.-P Long, C Xu, S Zou, Z Li, L Wen, Z Cai and W Wang (2011) Indications that live poultry markets are a major source of human H5N1 influenza virus infection in China Journal of virology Vol 85 (24) pp 13432-13438 56 Wan X.-F., T Nguyen, C T Davis, C B Smith, Z.-M Zhao, M Carrel, K Inui, H T Do, D T Mai and S Jadhao (2008) Evolution of highly pathogenic 69 H5N1 avian influenza viruses in Vietnam between 2001 and 2007 PloS one Vol (10) pp e3462 57 Wanasawaeng W., N Bunpapong, W Leelamanit and R Thanawongnuwech (2009) Growth characteristics of the H5N1 avian influenza virus in chicken embryonic eggs and MDCK cells The Thai Journal of Veterinary Medicine Vol 39 (3) pp 281-286 58 Wasilenko J L., C W Lee, L Sarmento, E Spackman, D R Kapczynski, D L Suarez and M J Pantin-Jackwood (2008) NP, PB1, and PB2 viral genes contribute to altered replication of H5N1 avian influenza viruses in chickens Journal of virology Vol 82 (9) pp 4544-4553 59 Webby R and P Thomas (2006) Influenza and the challenge for immunology Nat Immunol Vol (5) pp 449455 60 Who, Oie, H Fao and G Evolution Working (2008) Toward a Unified Nomenclature System for Highly Pathogenic Avian Influenza Virus (H5N1) 10.3201/eid1407.071681: Diseases 10.3201/eid1407.071681 Vol 14 Emerging (7) pp Infectious e1-e1.at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2600337/ 61 WHO (2017) Avian Influenza Weekly Update Number 573, 24 February 2017 62 Wu H., X Peng, L Xu, C Jin, L Cheng, X Lu, T Xie, H Yao and N Wu (2014) Novel reassortant influenza A (H5N8) viruses in domestic ducks, eastern China Emerging infectious diseases Vol 20 (8) pp 1315 63 Xu X., K Subbarao, N J Cox and Y Guo (1999) Genetic characterization of the pathogenic influenza A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) virus: similarity of its hemagglutinin gene to those of H5N1 viruses from the 1997 outbreaks in Hong Kong Virology Vol 261 (1) pp 15-19 64 Yu H., Z Feng, X Zhang, N Xiang, Y Huai, L Zhou, Z Li, C Xu, H Luo and J He (2007) Human influenza A (H5N1) cases, urban areas of People’s Republic of China, 2005–2006 Emerging infectious diseases Vol 13 (7) pp 1061 65 Zhu Q., H Yang, W Chen, W Cao, G Zhong, P Jiao, G Deng, K Yu, C Yang and Z Bu (2008) A naturally occurring deletion in its NS gene contributes to the attenuation of an H5N1 swine influenza virus in chickens Journal of virology Vol 82 (1) pp 220-228 70 ... dương tính cúm A 38 Hình 4.5 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 A/H5N6 /số mẫu xét nghiệm 40 Hình 4.6 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 /số mẫu dương tính virus cúm A/H5 41 Hình 4.7... lập chuẩn độ virus 61 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Trang Tên luận văn: Tình hình nhiễm số đặc tính sinh học virus cúm gia cầm A/H5N1 H5N6 số chợ buôn bán gia cầm thuộc tỉnh... 100% nhiễm virus (HA dương tính) độ pha lỗng khơng nhiễm virus (HA âm tính) Số trứng bị nhiễm virus (HA dương tính) Số trứng khơng nhiễm virus (HA âm tính) Số tích lũy (cộng dồn) Nhiễ m virus