đánh giá sự kháng viêm của dầu mù u trong quá trình làm lành vết thương

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG ĐÁNH GIÁ SỰ KHÁNG VIÊM CỦA DẦU MÙ U TRONG QUÁ TRÌNH LÀM LÀNH VẾT THƯƠNG Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS HUỲNH KIM HIỆU Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG ĐÁNH GIÁ SỰ KHÁNG VIÊM CỦA DẦU MÙ U TRONG QUÁ TRÌNH LÀM LÀNH VẾT THƯƠNG Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: Chuyên ngành Cơ quan công tác STT Họ tên Nguyễn Văn Linh Đại Học Cần Thơ Huỳnh Kim Hiệu Đại học Y Dược TP.HCM Trịnh Thị Diệu Thường Đại Học Y Dược TPHCM Đơn vị phối hợp chính: -Nơi thực đề tài: Đại Học Y Dược TPHCM MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ĐỐI TƯƠNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 50 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ECM Extracellular Matrix TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinases VEGF Vascular endothelial growth factor TNF Tumor necrosis factors TGF Transforming growth factor ROS Reactive oxygen species PI Povidone-Iodine PDGF Platelet-derived growth factor IFN Interferon MPO Myeloperoxidase MMP Matrix metalloproteinases IL Interleukin ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay IC Inhibitory concentration HPLC High-performance liquid chromatography HE Hematoxylin and eosin FGF Fibroblast growth factors DANH MỤC HÌNH Hình 1: Giai đoạn viêm trình lành vết thương(Singer & Clark, 1999) 12 Hình 2: Tương tác thị phân tử trình lành vết thương 18 Hình 3: Cây mù u (Calophyllum inophyllum) 24 Hình 4: Chuột nhắt trắng (Mus musculus var albino) 27 Hình 5: Tạo vết thương da chuột 30 Hình 6: Sắc ký đồ HPLC mẫu chuẩn dầu mù u A: mẫu chuẩn, B: dầu mù u 35 Hình 7: Chỉ số IC50 36 Hình 8: Kích thước gan chuột 37 Hình 9: Cấu trúc mô học gan chuột 37 Hình 10: Trọng lượng chuột gan chuột 37 Hình 11: Kích thước thận chuột 38 Hình 12: Cấu trúc mô học thận chuột 38 Hình 13: Biểu đồ so sánh trọng lượng chuột thận chuột 38 Hình 14: Hiệu làm lành vết thương dầu mù u so với nhóm khác 39 Hình 15: Cấu trúc mơ vết thương nhóm đối chứng, PI dầu mù u 40 Hình 16: Kết nhuộm Masson trichrome 40 Hình 17: Tỷ lệ collagen da chuột sau 14 ngày 41 Hình 18: Kết thử nghiệm hoạt tính MPO nhóm 42 Hình 19: So sánh kích thước lách nhóm 42 Hình 20: Các đặc điểm lách chuột nhóm điều trị 43 Hình 21: Định lượng cytokine huyết chuột 44 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Tóm tắt giai đoạn trình lành vết thương Bảng 2: Giai đoạn cầm máu trình lành vết thương Bảng 3: Giai đoạn viêm trình lành vết thương 10 Bảng 4: Những cytokine liên quan đến trình lành vết thương 14 Bảng 5: Vai trò loại tế bào liên quan đến lành vết thương 15 Bảng 6: Yếu tố ảnh hưởng đến trình lành vết thương 18 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Việt Nam quốc gia có y học cổ truyền phát triển từ lâu đời đóng vai trị đặc biệt quan trọng nghiệp chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Y học cổ truyền nước ta phát triển chủ yếu dựa sở lý luận kinh nghiệm y dược học Trung Hoa Đây y học có vai trị ảnh hưởng lớn thực tế nghiên cứu điều trị không nước ta, mà nhiều nước khu vực châu Á Các thuốc y học cổ truyền phần lớn dựa vào kinh nghiệm giá thành phải Vì thế, thuốc y học cổ truyền đáng bảo tồn phát triển, đặc biệt quốc gia phát triển nước ta Chính tính ưu việt lý để xem trọng nguồn dược liệu quý giá thiên nhiên Vì cần có nhiều nghiên cứu, sở y văn để chứng minh công nhận thuốc nâng cao nhận thức cộng đồng việc đảm bảo nguồn thuốc an toàn, quy cách, quy trình quy chuẩn Các thuốc nam phân bố rộng rãi khắp nước ta thuận lợi việc chữa phịng bệnh nhân dân Sóc Trăng địa phương có y học cổ truyền lâu đời, có văn hóa giao thoa với dân tộc Kinh, Hoa Khmer, chưa có điều tra, thống kê, nghiên cứu khoa học thức thuốc quý tỉnh nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng cỏ chỗ để trị bệnh theo tinh thần cơng tác chăm sóc sức khỏe Thiên nhiên nguồn cung cấp dược liệu từ ngàn năm có vai trị thiết yếu việc chăm sóc sức khỏe ban đầu cho 80% dân số nước phát triển Nhiều loại chiết xuất từ chúng sử dụng y học để điều trị vết thương Các chất có hiệu làm lành vết thương tái tạo mô thông qua nhiều chế phức tạp Y học cổ truyền sử dụng số dược liệu để điều trị vết thương cho kết tốt hạn chế tối đa tác dụng phụ Lành vết thương cấp tính q trình phức tạp đặc trưng giai đoạn nối tiếp nhau: cầm máu, viêm, tăng sinh tái tạo mơ[1] Nếu q trình bị gián đoạn vết thương cấp tính có nguy chuyển thành vết thương mạn tính, khả điều trị lành hồn tồn vơ khó khăn Nghiên cứu loại dược liệu có khả làm lành vết thương phát triển nơi có khoa học y sinh đại y học cổ truyền giới Ở nước ta, y học cổ truyền sử dụng dầu mù u chất có khả kháng khuẩn, kháng oxy hóa, kháng viêm sử dụng để điều trị vết thương từ lâu Tuy nhiên, vai trò kháng viêm dầu mù u trình lành vết thương chưa hiểu rõ Nếu trình viêm xảy q mức khơng kiểm sốt tạo tình trạng vết thương mạn tính, dẫn đến loạt bệnh có liên quan viêm khớp dạng thấp, chí phát triển thành ung thư Y học cổ truyền tỉnh Sóc Trăng sử dụng dược liệu để làm lành vết thương điều trị số bệnh da Trong đó, dầu mù u sử dụng để điều trị vết thương, vết lở loét bệnh nhân bị tai biến mạch máu não, bệnh nhân tiểu đường Mặc dù, giới có nhiều cơng trình cơng bố tác dụng dược lý dầu mù u chưa có tiêu chuẩn, chứng nhận hay đánh giá an toàn sử dụng dầu mù u thuốc y học cổ truyền để điều trị vết thương chưa hiểu rõ chế làm lành vết thương dầu mù u Cơ chế phân tử trình lành vết thương Phân loại vết thương Vết thương phân loại sau: dựa vào nguyên nhân gồm có vết thương hở, vết thương kín dựa dựa vào sở sinh lý vết thương có vết thương cấp tính vết thương mạn tính Vết thương hở: Vết thương hở phân loại dựa đối tượng gây nên vết thương Các loại vết thương hở là: Vết mổ, rạch gây vật sắc nhọn dao, thủy tinh vỡ Vết bỏng (bỏng nước sôi, acid, lửa ) Các vết cắt, vết thương xuất thường xuyên không thường xuyên, nhiên sống tránh khỏi bị vết thương thông thường Các vết trầy da, vết thương bề mặt lớp da bề mặt bị đi, vết trầy xảy có cọ xát da với bề mặt gồ ghề Chấn thương phần mơ thể, vết thương xảy tai nạn, phẫu thuật cắt phần thể Ngồi cịn có vết thương bị đâm, đạn bắn[2] Vết thương kín: Vết máu tụ hay cịn goi tụ máu da, vết thương có nguyên nhân da bị va đập có nguyên nhân bệnh lý sốt xuất huyết Thông thường vết thương da (vết thương kín) tự khỏi mà khơng cần có biện pháp điều trị Vết thương cấp tính: Nhiều ngun nhân gây vết thương cấp tính, bao gồm: bề mặt nhám cào cọ xát lên bề mặt da; vật sắc nhọn, chẳng hạn đinh, đâm vào thể; vật sắc cạnh, chẳng hạn lưỡi dao, cắt vào da gây vết thương cấp tính Quá trình lành vết thương xảy bình thường Vết thương mạn tính: Vết thương mạn tính vết thương chậm liền, khó liền khơng thể liền Việc xử trí vết thương mạn tính khó khăn, vết thương không liền được, ảnh hưởng lớn tới chất lượng sống người bệnh Vết thương khơng lành chậm lành thiếu nhiều yếu tố cần thiết để lành vết thương Các yếu tố bao gồm: nguồn cung cấp máu, oxy chất dinh dưỡng đầy đủ cho vết thương, bệnh tiểu đường, suy giảm miễn dịch, suy dinh dưỡng[3] Quá trình lành vết thương Các giai đoạn chữa lành vết thương Da cấu tạo chủ yếu từ hai lớp: lớp bề mặt hay gọi lớp biểu bì có chức rào cản mơi trường, lớp hạ bì bên chứa mơ liên kết tạo nên đặc tính học da Lớp biểu bì gồm lớp biểu mơ keratimocyte xen kẽ với nang lông tuyến[4] Bên cạnh vai trò bảo vệ thể, da có chức điều hịa cảm giác Cụ thể hơn, da bảo vệ tránh khỏi tác động học, áp suất, hạn chế ảnh hưởng nhiệt độ, xạ, chống nhiễm vi sinh vật Da đóng vai trị quan trọng tổng hợp vitamin D nhiều trình sinh lý điều chỉnh nhiệt độ cân chất dịch thể Dưới da có hệ thống tế bào thần kinh, giúp da phát phát thay đổi mơi trường Q trình lành vết thương cấp tính trình phức tạp, đặc trưng giai đoạn nối tiếp giai đoạn cầm máu, viêm, tăng sinh tái tạo cấu trúc[1] Các giai đoạn trình sinh học xảy theo chuỗi thích hợp, vào thời gian cụ thể tiếp tục theo chu kỳ Bảng 1[1, 5] Bảng 1: Tóm tắt giai đoạn trình lành vết thương Giai đoạn Cầm máu Quá trình Co mạch Hình thành cục máu đơng Tiểu cầu tế bào miễn dịch phóng thích cytokine Viêm yếu tố tăng trưởng Các tế bào bạch cầu trung tính, đại thực bào đơn nhân tiến hành xâm lấn Lớp hạ bì: Các yếu tố tăng trưởng phóng thích đại thực bào nguyên bào sợi Nguyên bào sợi xâm lấn tăng sinh Tăng sinh Tổng hợp fibronectin collagen Hình thành mạch Lớp biểu bì: Tế bào sừng xâm lấn, tăng sinh biệt hóa Đóng góp từ tế bào gốc nang lông Tổ chức cấu trúc lại chất ngoại bào Tái cấu trúc Hình thành nguyên bào sợi Vết thương co lại Tế bào chết theo chương trình apotosis Giai đoạn cầm máu Quá trình lành vết thương bắt từ lúc cầm máu Biểu hiện tượng đơng máu hình thành cục máu đông hết chảy máu Ở mức độ tế bào, thành phần trung gian quan trọng tượng đơng máu fibrin, tiểu cầu mạch máu Vai trò thành phần q trình lành vết thương khơng kết thúc máu ngừng lại Thay vào đó, thành phần tham gia vào phức hợp chưa tổng hợp chuỗi tái tạo kiện xảy suốt trình lành vết thương Ngay sau bị thương, cục máu đơng hình thành nhìn thấy Các cục máu đơng khơng góp phần cầm máu mà cịn có tác dụng mạng lưới bảo vệ tạm thời tế bào viêm, nguyên bào sợi, yếu tố tăng trưởng đến nơi bị thương Thành phần cục máu đơng nhìn thấy với vùng da xung quanh; vết sẹo mờ, kích thước vết sẹo nhỏ, vết sẹo ngang với da xung quanh không lồi không lõm; vết chân may mờ Khi so sánh với nhóm PI nhóm đối chứng dầu mù u có hiệu lành vết thương tốt thẩm mỹ Hình 14: Hiệu làm lành vết thương dầu mù u so với nhóm khác Đánh giá mô học phương pháp nhuộm HE Kết đánh giá mô học vết thương phương pháp nhuộm HE (độ phóng đại 4X) (Hình 15) (mũi tên vị trí vết thương, bar=500µm) cho thấy: sau ngày vết thương nhóm đối chứng nhìn vết thương bắt đầu lành, cấu trúc mơ lớp trung bì hạ bì cịn hở; nhóm PI mức độ hồi phục tốt nhóm đối chứng; nhóm mù ù vết thương lành nhanh Sau 14 ngày, nhóm đối chứng vết thương chưa lành nhóm PI mù u vết thương lành hoàn toàn Nhóm chuột mù u hình thành hồn tồn lớp biểu bì hạ bì vào ngày thứ 14 Dầu mù u Hình 15: Cấu trúc mơ vết thương nhóm đối chứng, PI dầu mù u Định lượng collagen mơ da Hình 16: Kết nhuộm Masson trichrome Kết nhuộm Masson trichrome (Hình 16) cho thấy mô da chuột điều trị PI đối chứng có lượng collagen nhiều so với mơ da chuột điều trị dầu mù u (sợi collagen nhuộm màu xanh, mũi tên vị trí vết thương, độ phóng đại 4X, bar=1cm) Qua kết này, cho thấy dầu mù u có khả làm giảm khả hình thành sẹo trình lành vết thương Tỷ lệ collagen mô so sánh phần mềm ImageJ thể Hình 17 Kết phân tích, cho thấy tỷ lệ collagen mơ da chuột điều trị dầu mù u thấp so với nhóm đối chứng nhóm PI Kết cho thấy collagen tạo thành vết thương điều trị dầu mù u so với nhóm đối chứng nhóm PI Tỷ lệ collagen tính phần mềm ImageJ, thống kê ANOVA chiều phần mềm GraphPad Prism v.6 Giá trị tính Mean ± SD (n=5) (*P