LUẬN VĂN THẠC SỸ HOÀN CHỈNH (Y DƯỢC) đặc điểm sinh học phân tử của haemophilus influenzae typ b phân lập từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ, mẫu giáo

138 59 0
LUẬN VĂN THẠC SỸ HOÀN CHỈNH (Y DƯỢC) đặc điểm sinh học phân tử của haemophilus influenzae typ b phân lập từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ, mẫu giáo

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

TÀI LIỆU TRẮC NGHIỆM, BÀI GIẢNG PPT CÁC MÔN CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT CÓ TẠI “TÀI LIỆU NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT” ;https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC). DÀNH CHO SINH VIÊN CÁC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC VÀ CÁC TRƯỜNG KHÁC, GIÚP SINH VIÊN HỆ THỐNG, ÔN TẬP VÀ HỌC TỐT KHI HỌC TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC)

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Giống vi khuẩn Haemophilus loại vi khuẩn ký sinh đường hô hấp người số loài động vật Loài H influenzae nguyên số bệnh nhiễm trùng người (có thể từ viêm đường hơ hấp viêm màng não) H.influenzae typ b (Hib) giới xác định nguyên chớnh gõy viờm màng não vi khuẩn, đặc biệt trẻ em tuổi [24], [89] Tại nước phát triển khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, châu Úc hầu hết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mang Hib họng cao trẻ nhỏ, đặc biệt trẻ chăm sóc trung tâm giữ trẻ ban ngày mang Hib đến 15% [52], [69] Bên cạnh đó, Hib đánh giá nguyên nhân hàng đầu gõy cỏc bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ viêm màng não, viêm phổi để lại di chứng tỷ lệ tử vong cao (khoảng 10%) Gánh nặng bệnh tật Hib giảm đáng kể nhờ có vacxin phòng bệnh nước [89] Tuy nhiên, số nước giới sau đánh giá trình thực phịng bệnh Hib vacxin cho thấy tỷ lệ thất bại vacxin không nhỏ Xuất phát từ vấn đề này, có nhiều nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử (phổ biến sử dụng kỹ thuật PFGE) Hib tiến hành để đỏnh giá dịch tễ học phân tử vi khuẩn dựa nghiên cứu so sánh với đặc điểm chủng Hib phõn lập từ người khỏe mạnh người tiếp xúc mang vi khuẩn [82], [100], [105], [111], [112] Tại Việt Nam, số nghiên cứu đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn H influenzae nói chung [1] Hib nói riêng [7], tỷ lệ mắc viêm màng nóo H.influenzae (chưa có điều kiện xác định typ huyết thanh) trẻ tuổi [6], [22] Cho thấy tỷ lệ trẻ tuổi mang H.influenzae chiếm khoảng 21,4% - 35,5% [8], Hib chiếm khoảng 15,0% - 17,5% [7] H.influenzae nguyên hàng đầu gây viêm màng nóo (50 - 60% trường hợp viêm màng nóo xác định vi khuẩn) trẻ nhỏ [6] Từ năm 1994 đến 2004, số nghiên cứu Ngô Thị Thi, Phan Lê Thanh Hương cộng đưa tỷ lệ viêm màng nóo Hib trẻ tuổi Hà Nội số tỉnh phớa Bắc [11], tìm hiểu phân bố theo biotype, genotype (phân loại PFGE) gen mã hóa tổng hợp enzym lactamase Hib phân lập từ trẻ viêm màng não tuổi thực [10] Tuy nhiên, số lượng chủng Hib sử dụng nghiên cứu hạn chế chưa có so sánh với chủng Hib phõn lập trẻ khỏe mạnh Vì vậy, để góp phần tìm hiểu nguồn gốc, đặc điểm sinh học phân tử chủng Hib gõy viêm màng não cho trẻ tuổi trẻ khỏe mạnh lứa tuổi mẫu giáo có mang Hib Chúng tơi thực đề tài: “Đặc điểm sinh học phân tử Haemophilus influenzae typ b phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh nhà trẻ, mẫu giáo”, nhằm thực mục tiêu: Xác định biotype, genotype, khả sinh enzym  -lactamase mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo tuổi Xác định tỷ lệ, biotype, genotype, khả sinh enzym  -lactamase mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo So sánh đặc điểm sinh học Hib gây viêm màng não trẻ tuổi với Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Haemophilus influenzae typ b (Hib) 1.1.1 Haemophilus influenzae: lịch sử tên gọi Haemophilus influenzae (H.influenzae) phân lập lần Richard Pfeiffer từ đờm bệnh nhân bị viêm phổi đại dịch cúm năm 1890 Lúc đó, vi khuẩn hiểu lầm nguyên nhân gây bệnh cúm nên gọi trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria) Mãi đại dịch cúm xảy năm 1918-1919, người ta biết H.influenzae thành viên hệ vi khuẩn ký sinh đường hô hấp lúc gây bệnh Năm 1933, phát virus cúm nguyên bệnh cúm, vai trò H.influenzae làm sáng tỏ: virus cúm gây bệnh cúm, H.influenzae vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau tế bào đường hô hấp bị tổn thương nặng virus cúm Xuất phát từ yếu tố lịch sử có liên quan đến bệnh cúm (influenzae: bệnh cúm) nhu cầu đòi hỏi yếu tố phát triển có mặt máu (Haemophilus: ưa mỏu) nờn vi khuẩn có tên gọi H.influenzae [19], [43], [89] 1.1.2 Đặc điểm sinh học H.influenzae typ b (Hib) 1.1.2.1 Hình thể cấu trúc [19], [89] H influenzae lồi vi khuẩn nhỏ nhất, cịn gọi cầu trực khuẩn vi khuẩn có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5m) uốn cong hai đầu trơng hình cầu Tuy nhiên chúng dịch não tuỷ, hình thể H influenzae kéo dài gấp vài lần so với chiều dài thơng thường (Hình 1.1) H influenzae bắt màu Gram õm, khơng di động khơng hình thành nha bào Thành tế bào vi khuẩn có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự thành vi khuẩn Gram õm khác Tuy nhiên, H influenzae phân loại thành nhóm: loại khơng vỏ polysaccharide (non-typeable khụng xác định typ huyết thanh) loại có vỏ (typeable xác định typ huyết thanh) Loài H influenzae có vỏ bọc phân loại tiếp tục theo typ huyết (serotype) từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên vỏ polysaccharide gen qui định [19], [43], [89] Vỏ bọc typ b dạng trùng hợp ribose, ribitol phosphate, gọi polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP) Những polysaccharide bề mặt có liên quan chặt chẽ với độc lực vi khuẩn, đặc biệt H influenzae typ b (Hib), nguyên nhân nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm viêm màng nóo (chiếm 90% ca nhiễm khuẩn xõm hại Hib) Bạch cầu đa nhân Hib Hình 1.1 Hình thể Hib tiêu nhuộm Gram dịch não tuỷ kính hiển vi quang học (độ phóng đại ì 1000) [99] Trên thực tế, nhuộm Gram bệnh phẩm dịch nóo tủy mà vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái nhiều bạch cầu đa nhõn đõy dấu hiệu quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm màng nóo H influenzae [89] 1.1.2.2 Sức đề kháng [127] H influenzae loại vi khuẩn chịu đựng với yếu tố ngoại cảnh Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, để khô lạnh giá Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn cách dễ dàng Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đốn vi khuẩn nên vận chuyển phịng thí nghiệm vịng giờ, khơng q nhiệt độ phịng thí nghiệm (24 - 28oC) Nếu tăm bệnh phẩm phải giữ môi trường vận chuyển (mơi trường bảo quản), giữ nhiệt độ - oC tối đa 24 môi trường 1.1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy [19] Điều kiện nuôi cấy: H influenzae loại vi khuẩn khó ni cấy Chỳng khụng mọc trờn cỏc mụi trường nuôi cấy thông thường, mọc môi trường có sẵn hai yếu tố X V Yếu tố X có lẽ khơng phải chất túy mà hỗn hợp chất có chứa sắt (như hemin hematin) H influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp số enzym catalase, peroxidase cytochrom hệ thống vận chuyển điện tử Máu sản phẩm máu, kể hemin nguồn nguyên liệu truyền thống sử dụng để sản xuất yếu tố X Thạch máu (5%) có khả cung cấp đủ lượng yếu tố X mà H influenzae cần thiết phát triển Khi dùng hematin tinh chế nồng độ cần thiết 0,1 - 1,0 g/ml Yếu tố V NAD NADP có mặt máu, phần chúng nằm bên tế bào Mặt khác, máu nhiều loài động vật có enzym NADase có tác dụng phõn hủy NAD, nên máu tươi khơng có NAD dạng tự Thạch chocolate, NAD giải phóng khỏi tế bào enzym NADase bị nhiệt phá huỷ Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết 0,2 - 1,0 g/ml H influenzae hiếu khí, địi hỏi mơi trường ni cấy có CO (2 - 5%) phân lập Mọc tốt trờn mụi trường chocolate Levinthal nhiệt độ khoảng 23 - 390C, tối ưu 370C Không mọc thạch máu cừu; mọc trờn cỏc loại thạch mỏu khỏc (ví dụ máu thỏ) thỡ khụng gõy tan máu khuẩn lạc nhỏ nhiều so với chocolate cựng cỏc điều kiện nuôi cấy Cũng thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc H influenzae mọc xung quanh khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm to, vùng xa khuẩn lạc khơng mọc, bé Hiện tượng gọi tượng “vệ tinh” (satellitism), khả tiết yếu tố V vi khuẩn bội nhiễm giúp H influenzae phát triển thạch mỏu thụng thường Hình 1.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc H influenzae mọc xung quanh khuẩn lạc S aureus trờn môi trường thạch máu thỏ Môi trường nuôi cấy đặc điểm khuẩn lạc: Để ni cấy H influenzae, có loại mơi trường được sử dụng [19], [43], [89], [127]: - Thạch chocolate có khơng có 300g bacitracin/ml mơi trường (có tác dụng ức chế số vi khuẩn khác, đặc biệt liên cầu) để phõn lập H.influenzae Đõy loại môi trường thường sử dụng nuôi cấy phõn lập vi khuẩn - Thạch máu thỏ tươi 7% thạch Levinthal Sau nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm khí trường 5% CO2 (nếu khơng có tủ ấm CO2, mơi trường ni cấy đặt chuông thủy tinh đốt nến chuông Sau nến tắt, khí trường bên chng - 5% CO 2) 37oC thời gian 18 - 24 Hình 1.3: Khuẩn lạc H influenzae mọc trờn mụi trường chocolate Sau 16 - 18 nuôi cấy, H influenzae phát triển thành khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ - 2mm khụng gõy tan huyết Vi khuẩn Hib ln có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh ánh sáng chiếu vào có đường kính lớn Ngồi ra, mơi trường ni cấy vi khuẩn thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol) Sau 24 - 48 giờ, trạng thái vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải tính chất bắt màu Gram thay đổi Trên môi trường lỏng, H influenzae thường phát triển làm đục mơi trường Tình trạng vỏ xảy sớm mơi trường thạch, muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm ni cấy thích hợp (18 giờ) Tính chất sinh hóa đặc trưng H influenzae: Tính chất sinh hóa đặc trưng H influenzae nhu cầu đòi hỏi bắt buộc yếu tố phát triển X V môi trường ni cấy Tính chất xác định thử nghiệm XV thử nghiệm "vệ tinh" [19], [127]: (1) (2) Hình 1.4: Thử nghiệm với khoanh giấy X, V XV (1); thử nghiệm "vệ tinh" (2), cho thấy H influenzae đòi hỏi bắt buộc phải có yếu tố X V cho phát triển H influenzae phân biệt với loại Heamophilus khác đặc điểm sau đây: Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học để phân biệt H influenzae với Haemophilus khác [127] Tính chất Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO2 Loài H influenzae + + + H parainfluenzae + H hemolyticus + + + H parahemolyticus + + ± H aphrophilus + + H paraphrophilus + + 1.1.3 Đặc điểm phân loại theo typ huyết (serotype) typ sinh học (biotype) H influenzae 1.1.3.1 Đặc điểm phân loại H influenzae theo typ huyết [19], [43], [89] Năm 1930, H influenzae xác định thành nhúm chớnh, lồi khơng vỏ (khụng xỏc typ huyết - non typeable) lồi có vỏ (xác định typ huyết - typeable) Dựa tính đặc hiệu kháng nguyên vỏ polysaccharide, vi khuẩn H influenzae có vỏ chia thành typ huyết từ a đến f Theo hầu hết nghiên cứu cho thấy vi khuẩn H influenzae gây bệnh thuộc loại có vỏ, nhiều H influenzae typ b 1.1.3.2 Đặc điểm phân loại H influenzae theo typ sinh học (biotype) Bảng 1.2: Phân loại H influenzae theo typ sinh học Killian [43] Biotype Các tính chất hố học Test Urease Test Indol Ornithin decarboxylase (ODC) I + + + II + + - III + - - IV + - + V - + + VI - - + VII - + - VIII - - - Kilian đưa phương pháp sử dụng số thử nghiệm sinh hoá để xác định biotype đặc điểm sinh học loài Haemophilus dựa kết thử nghiệm: tìm khả sinh indol, hoạt động hai enzym urease decarboxylase vi khuẩn Trước đây, Kilian nghiên cứu chia H influenzae thành biotype từ I đến IV Những biotype độc lập với typ huyết vi khuẩn đó, chủng khơng có vỏ cho kết tương tự với ba phản ứng sinh hoá Sau này, với thử nghiệm tương tự, Kilian bổ sung thêm biotype từ V đến VIII Vì vậy, H influenzae chia làm typ theo tiêu chuẩn Killian [43] 1.1.4 Miễn dịch [28], [89] 10 Kháng thể (Kháng kháng nguyên thân) Kháng nguyên thân (LPS protein màng ngoài) Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate) Kháng thể (Kháng kháng nguyên vỏ) Đại thực bào Đại thực bào Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vỏ kháng nguyên thân [89] Miễn dịch tự nhiên thể Hib đa dạng, bao gồm hợp tác phức tạp nhiều thành phần hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố miễn dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa q trình hoạt hóa phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả thực bào, diệt vi khuẩn đại thực bào tế bào đa nhân, 5) Chức miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T Trong khó đánh giá rạch rịi chế miễn dịch quan trong chế bảo vệ thể vật chủ Tuy nhiên, hầu hết cá thể có khả miễn dịch bảo vệ năm đầu đời mà không mắc bệnh nhiễm khuẩn Hib lan tràn Khả 124 chủng Hib phân lập từ nghiên cứu Sau đỏnh giá tương đồng mẫu ADN chủng vi khuẩn dựa vào băng (band) ADN điện di đồ đưa mối liên quan chủng vi khuẩn Hib phân lập mức độ khác nhau: phân biệt (indistinguishable) hay xếp vào nguồn gốc, có mối liên quan gần (closely related), có liên quan (possibly related) khác hồn tồn (different) Vì vậy, đõy kỹ thuật hữu ích nghiên cứu xác định nguồn gốc chủng vi khuẩn gây bệnh [10], [12], [122], [123] - Tại Việt Nam, dựa vào phương pháp PFGE, Phan Lê Thanh Hương cộng có nghiên cứu xác định Hib gõy viêm màng nóo với nguồn lây mang tính gia đình [10] - Trên giới, điển hình Nhật Bản Hiroshi Wantanabe cộng cho thấy có lây truyền chủng H.influenzae không định typ huyết (non-typeable) đề khỏng ampicillin-khụng sản xuất βlactamase trẻ em bố mẹ chúng dựa nghiên cứu 15 gia đình [122] Bên cạnh đó, Saito cộng cho thấy lan truyền Hib từ trẻ mắc viêm màng nóo vi khuẩn sang cho người chăm sóc chưa tiêm vacxin với tỷ lệ cao [103] Ngồi ra, với mục đích này, số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PFGE để đỏnh giá khác biệt đặc điểm ADN chủng H.influenzae phân lập từ nguồn gốc khác Cụ thể, nghiên cứu Patricia Ezekiel Moor cộng đánh giá khác cấu trúc ADN chủng Hib phân lập từ thổ dân đối tượng thổ dân Úc [82] 4.4.1.3 Sử dụng nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng H.influenzae gây bệnh nhiễm trùng PFGE kỹ thuật đỏnh giá cơng cụ hữu ích áp dụng nghiên cứu dịch tễ học phân tử loài vi khuẩn [107], [115], [116] Đối 125 với vi khuẩn H.influenzae, có nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử nhiều khía cạnh khác Cụ thể, nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng H.influenzae phân lập từ vùng hầu họng trẻ khoẻ mạnh nhà trẻ trại trẻ mồ côi [90], chủng H.influenzae đề kháng ampicillin không sinh enzym β-lactamase [48] hay chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo [79] Tất nghiên cứu dựa sở phân loại genotype H.influenzae theo kỹ thuật PFGE kết hợp với đặc điểm đối tượng địa điểm nghiên cứu để đỏnh giá mặt dịch tễ học [48], [79], [100] 4.4.2 Tỷ lệ phân bố genotype chủng Hib gõy viêm màng nóo 102 chủng Hib chúng tơi phõn lập từ bệnh nhi mắc viêm màng nóo nhiều vùng khác thuộc khu vực miền Bắc thăm khám điều trị bệnh viện Nhi Trung ương Do đó, chủng Hib nghiên cứu xác định có nguồn gốc khác địa lý Tuy nhiên, kết phân tích kỹ thuật PFGE cho thấy hầu hết chủng vi khuẩn phõn bố vào ba nhóm genotype chớnh, A (48,4%), B (20,1%), C (21,7%) chủng riêng lẻ không xếp loại chiếm 5,9% Tương tự, nghiên cứu Anna Skoczyn´ska đặc điểm vi khuẩn Hib gây viêm màng nóo Ba Lan thu 233 chủng Hib từ 64 trung tâm, đại diện cho Ba Lan vòng năm (1997 - 2004) Những chủng vi khuẩn này, sau phân tích kỹ thuật PFGE cho thấy chủng Hib gây viêm màng nóo tập trung chủ yếu vào nhóm genotype A (97,4%) số genotype riêng lẻ B, C, D, E, F[4] (chỉ chiếm 2,6%) [108] Điều gợi ý cho thấy chủng Hib gõy viêm màng nóo ln tập trung vào vài nhúm genotype định cho dù có phõn lập nhiều vùng khác Yếu tố thời gian phõn lập Hib đánh giá nghiên cứu Kết cho thấy thời gian phõn lập không ảnh hưởng nhiều 126 đến biến đổi genotype chủng vi khuẩn Hib: chủng kiểu A phân lập vào thời gian từ 2004 đến 2007 có liên quan gần với chủng phân lập khoảng thời gian từ 2001 - 2003, có liên quan (liên quan xa) với kiểu A2 thời gian phân lập chủng Hib thuộc kiểu A A2 (2004-2007) Có lẽ, kiểu A2 gồm chủng có khả sinh -lactamase kiểu A A1 khơng có khả sinh enzym Như vậy, thời gian năm, chủng vi khuẩn Hib gây bệnh có biến đổi chút gen không nhiều, chúng luụn cú mối liên quan gần với Hiện tượng khác từ - band (liên quan xa hay có liên quan) lại xảy chủng khác khả sinh enzym -lactamase, nghĩ đến việc số chủng Hib nhận thêm đoạn gen sinh -lactamase theo chế transposon [23], [119] cú thêm phân đoạn plasmid mang gen quy định tổng hợp -lactamase nên làm biến đổi kiểu gen vi khuẩn Hib Bởi vì, tượng xảy làm thay đổi vị trí cắt enzym giới hạn SmaI Hầu hết nghiên cứu đỏnh giá khả gây bệnh Hib xác định số yếu tố độc lực vi khuẩn Yếu tố độc lực phần lớn dựa vào cấu trúc vỏ polysaccharide vi khuẩn typ sinh học (biotype) Trong đó, typ huyết b typ sinh học I, II đóng vai trị gây bệnh chủ yếu Tuy nhiên, số nghiên cứu xác định sâu vai trị độc lực Hib Những yếu tố độc lực khác phải kể đến như: yếu tố bám (pili), khả sống sót môi trường thể với chất dinh dưỡng đặc trưng khả xâm nhập vào tế bào Cụ thể, gen có vai trị độc lực H.influenzae bao gồm: vùng gen Cap mã hóa vỏ polysaccharide, nhóm gen hif mã hóa yếu tố bám pili, nhóm gen hmw1 hmw2 mã hóa yếu tố bỏm cú trọng lượng phân tử lớn nhóm gen quy tổng hợp enzym tryptophanase Vì vậy, chủng Hib gây bệnh 127 quan thường có tương đồng gen độc lực, dẫn đến kết cho thấy chủng Hib gây viêm màng não với kiểu genotype có tính tập trung vào số ớt nhúm genotype định (trong genotype nhóm có liên quan với giống hồn tồn gen) phù hợp với khoa học [60], [61] Ngồi ra, kết luận khu vực nghiên cứu (các tỉnh miền Bắc Việt Nam), chủng Hib tồn luân chuyển cộng đồng Chú thích: [4] Genotype A, B, C quy ước đặt cho phân loại PFGE nghiên cứu Vì vậy, genotype A B nghiên cứu khác với genotype A B nghiên cứu khác) 4.4.3 Phân bố tỷ lệ genotype chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo Phân tích 52 chủng Hib chúng tơi phõn lập trẻ khỏe mạnh tuổi nghiên cứu kỹ thuật PFGE thu 36 genotype Kết đồng nghĩa với chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh phân bố vào rải rác vào nhiều genotype khác không tập trung vào cỏc nhúm genotype định Trên giới, nhiều nghiên cứu cho thấy H.influenzae nói chung Hib nói riêng phõn lập từ nguồn khác thường có khác biệt ADN Cụ thể với nghiên cứu Henri Dabernat năm 2003 dịch tễ học phõn tử H.influenzae phõn lập từ trẻ chăm sóc nhà trẻ nước Pháp, với 663 chủng H.influenzae sau phõn tích kỹ thuật PFGE cho 366 genotype; đó, hầu hết chủng H.influenzae phõn lập nằm rải rác vào nhiều genotype khác khơng tập trung vào nhóm định [41] Tương tự, nghiên cứu khác Saito cộng Nhật Bản năm 1999 178 chủng H.influenzae phõn lập khơng có liên quan mặt dịch tễ học kỹ thuật PFGE, sau phõn tích thu 165 genotype khác 128 [103] Vì vậy, thấy khác biệt chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo với chủng Hib phõn lập từ họng trẻ khỏe mạnh hay chủng có liên quan dịch tễ học Đó Hib gõy viêm màng nóo có genotype mang tớnh tập trung (tương đồng), cũn Hib phõn lập từ họng trẻ khỏe mạnh thường có kiểu genotype rải rác khơng có tớnh tập trung Theo Gilsdorf, thay đổi gen tác động chọn lọc tự nhiên sở để xác định độc lực H.influenzae Cụ thể, ADN H.influenzae xảy đột biến nhận đoạn gen độc lực dẫn đến khác biệt gen chủng vi khuẩn Sự đa dạng đột biến tạo vừa có vai trị thuận lợi phản ánh khả sống sót môi trường khác [50] Điều cho thấy chủng Hib gõy viêm màng nóo thường có tương đồng gen độc lực Hơn nữa, chủng Hib gõy viêm màng nóo phải tương đồng gen quy định đặc điểm giúp cho vi khuẩn sống sót dịch não tủy để gõy bệnh Cho nên, chủng Hib gõy viêm màng nóo thường có phõn loại genotype tương đồng khác với chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi 4.4.4 Mối liên quan genotype (kiểu PFGE ADN) với khả sinh -lactamase chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Sau phõn tớch kết PFGE, xác định enzym β-lactamase chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo trẻ khỏe mạnh tuổi, chúng tơi sử dụng thuật tốn thống kê (Chi-square test, Fisher’s exact test) để đỏnh giá mối liên quan genotype với khả sinh -lactamase Kết cho thấy khơng có mối liên quan có ý nghĩa thống kê đặc điểm phõn loại genotype khả sinh enzym -lactamase chủng Hib phõn lập (p > 0,05) 129 Trên thực tế, người ta chứng minh gen TEM-1 thuộc hai transposon có ký hiệu Tn2 hay Tn3 gen ROB-1 đóng vai trị mó hóa enzym -lactamase [119] Cả hai enzym nằm plasmid nên di truyền theo chế plasmid lan truyền theo chế transposon [23] (hình 4.3) Trong đó, nhân lên plasmid thường nhịp nhàng với ADN nhiễm sắc thể vi khuẩn, plasmid bảo tồn "tương đối" qua hệ Những vi khuẩn có khả sinh enzyme -lactamase xác định vi khuẩn nhận plasmid mang đoạn gen mã hóa enzyme này, đặc biệt F-plasmid (F: Fertility- factor) (1) Chú thích: (1): Tn3 “nhảy” vào F-plasmid có khả tiếp hợp với vi khuẩn khác (2): Tn3 hình thành cấu trúc “thịng lọng” tách khỏi F-plasmid (2) (3): Tn3 giải phóng từ F-plasmid “nhảy” sang ADN khác (3) Hình 4.3 Cơ chế di truyền tranposon Tn3 Vì vậy, vi khuẩn H.influenzae thuộc genotype bị nhiễm plasmid mang gen mó hoỏ enzyme -lactamase tạo nên chủng vi 130 khuẩn khỏng nhúm thuốc -lactam mà genotype quy định khả sinh enzym Thêm vào đó, chế di truyền transposon gen nhảy (jumping gene) Cho nên, Tn3 nhảy từ plasmid thơng thường sang F-plasmid truyền sang tế bào vi khuẩn khác theo chế tiếp hợp (conjugation) dẫn đến tượng tế bào vi khuẩn nhận gen đề kháng (TEM-1) [23], [119] 4.4.5 Mối liên quan genotype (kiểu PFGE ADN) với biotype chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Sau phân tích mối liên genotype biotype chủng Hib phân lập được, thấy tất chủng vi khuẩn có chung genotype ln nằm biotype Điều giải thích chủng Hib genotype có đặc điểm phân tích ADN theo kỹ thuật PFGE giống (PFGE kỹ thuật có khả phân biệt tốt có tính ổn định phân loại vi khuẩn [115]) Tuy nhiên, so sánh mối liên quan nhóm genotype với phân bố theo biotype chủng Hib chúng tơi thấy khơng có ý nghĩa thống kê Sở dĩ có kết khác biệt cấu trúc phân tử ADN genotype xếp nhóm [115], [116] Theo tiêu chuẩn Tenover (cụ thể áp dụng nghiên cứu này), chủng Hib có genotype khác - biến cố đột biến xếp chung vào nhóm genotype Những đột biến thường gặp như: đột biến điểm (mất cặp thêm cặp base vào phân tử ADN), đột biến đoạn (ADN đoạn ADN ngắn) đột biến thêm đoạn (ADN nhận thêm đoạn ADN ngắn) [115] Vì vậy, thay đổi cấu trúc ADN dẫn đến sai khác cấu trúc gen quy định enzym đóng vai trị phân loại biotype H.influenzae nói chung Hib nói riêng, làm cho Hib nhóm genotype (khác genotype) lại xếp 131 vào biotype khác Ngoài ra, số chủng Hib nghiên cứu chưa thực đủ lớn để nghiên cứu đỏnh giá tất tỷ lệ nên kết cho thấy nhóm genotype chủng Hib phân lập khơng có liên quan đến phân loại biotype Tuy nhiên, số chủng Hib thực nghiên cứu đủ lớn chắn thấy nhóm genotype có liên quan đến phân loại biotype, đặc điểm kiểu hỡnh luụn quy định đặc điểm kiểu gen 4.4.6 Mối liên quan genotype chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Sau phân tích tồn chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo kỹ thuật PFGE, kết cho thấy: 01 chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype giống 01 chủng phân lập từ bệnh nhi 02 chủng Hib khác phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype liên quan gần với 02 chủng phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo Trong đó, tất chủng thuộc genotype khơng xếp loại (KXL) 52 chủng Hib phõn lập từ bệnh phẩm dịch ngoáy họng trẻ khỏe mạnh tuổi Sở dĩ có kết chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh luụn cú genotype tản mạn không tập trung vào số nhúm genotype định, chủng Hib gõy viêm màng nóo ln tập trung nhiều vào vài nhúm genotype Hầu hết nghiên cứu xác định Hib loại vi khuẩn có độc lực, kể chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh Tuy nhiên, chủng Hib gõy viêm màng nóo cần phải chứa nhiều loại gen độc lực đặc trưng Trong nghiên cứu này, thấy hầu hết chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh giống có mối liên quan genotype chung nguồn gốc phân lập, ngoại trừ genotype nhóm genotype loại gồm chứa chủng khác nguồn gốc Điều giải thích tượng lây nhiễm chéo Hib trẻ nuôi dưỡng 132 nhà trẻ, mẫu giáo Đặc điểm phù hợp với nhiều nghiên cứu khác giới [100], [122] báo cáo, điển hình nghiên cứu Raquel Sa - Leao Bồ Đào Nha cho thấy có tỷ lệ cao vi khuẩn H.influenzae lan truyền những đứa trẻ ni dưỡng trung tõm chăm sóc ban ngày [105] Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi cho thấy tỷ lệ cao (24,5%) trẻ khỏe mạnh nhà trẻ, mẫu giáo mang vi khuẩn Hib; số trẻ mang Hib độc lực mà khơng có biểu bệnh, đõy nguồn lõy quan trọng sang trẻ khác khó tránh 4.5 So sánh đặc điểm sinh học chủng Hib gây viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Nghiên cứu cho thấy phõn bố tỷ lệ chủng Hib gây viêm màng nóo Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi theo biotype, khả sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym β-lactamase mức độ nhạy cảm với kháng sinh khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, phõn bố chủng Hib theo genotype hầu hết có khác chủng phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo chủng phõn lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi; có 01 chủng Hib (không xếp loại) 02 chủng (không xếp loại) phõn lập từ trẻ khỏe mạnh lần lượt: có genotype với 01 chủng gõy viêm màng nóo có mối liên quan gần gen với 02 chủng gõy viêm màng nóo Vì vậy, đánh giá đặc điểm biotype, khả sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym β-lactamase, mức độ nhạy cảm với kháng sinh Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh khơng có khác Sự khác chủng Hib phõn lập từ hai nguồn gốc thể phõn bố genotype Điều minh chứng cho thấy để gõy bệnh viêm màng nóo, chủng Hib không phụ thuộc vào đặc điểm biotype, serotype mà cũn phải cần nhiều đến yếu tố độc lực khác [50] 133 4.6 Tỷ lệ vi khuẩn Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi nhà trẻ, mẫu giáo Hiện có nhiều nghiên cứu xác định tỷ lệ trẻ khỏe mạnh tuổi có mang vi khuẩn H.influenzae nói chung Hib nói riêng Tuy nhiên, tỷ lệ khác phụ thuộc vào nhiều yếu tố Những yếu tố ảnh hưởng chính, bao gồm: kiện sống trẻ (như sống nơi đông đúc, tập trung nhiều người chăm sóc nhà trẻ hay trại trẻ mồ cơi) làm gia tăng tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn Hib; ngược lại, hiệu việc tiêm chủng vacxin đặc hiệu liệu pháp điều trị kháng sinh lại làm tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn Hib giảm đáng kể [28] Tại Việt Nam, hầu hết nghiên cứu tỷ lệ mang vi khuẩn H.influenzae (chưa có điều kiện định typ huyết thanh) trẻ em 60 tháng cộng đồng số tỉnh miền Bắc Lê Huy Chính cộng Kết cho thấy: tỷ lệ trẻ tuổi mang vi khuẩn H.influenzae chiếm 21,4% (trẻ 12 tháng); 35,5% (trẻ 13 - 24 tháng); 32,5% (trẻ 25 - 36 tháng); 27,7% (trẻ 37 - 48 tháng); 31,6% (trẻ 49 - 60 tháng); khơng có khác biệt tỷ lệ trẻ mang H.influenzae nhóm tuổi khác (p > 0,05) [4] Tuy nhiên, nghiên cứu Phạm Văn Ca Lê Đăng Hà năm 2003 Vị Xuyên (Hà Giang) Vân Đồn (Quảng Ninh) cho thấy tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang H.influenzae 24,0% 14,7%; tỷ lệ vi khuẩn H.influenzae Hib tương ứng 73,1% 76,7% [7] Trên giới, phần lớn nghiên cứu trẻ khỏe mạnh mang H.influenzae định typ huyết Nghiên cứu Staphanie H Factor cộng tỷ lệ trẻ tuổi có mang Hib Châu Á, cho thấy tỷ lệ chung 6% Trong đó, tỷ lệ trẻ mang Hib chiếm: 3% (ở trẻ – tháng); 10% (ở trẻ - 11 tháng); 5% (trẻ 12 - 23 tháng); 8% (ở trẻ 24 - 35 tháng); 4% (ở trẻ 36 - 47 tháng) 5% (ở trẻ 48 - 59 tháng) [56] Bên cạnh đú, Gúmez 134 Elizabeth cộng nghiên cứu dịch tễ học trẻ khỏe mạnh mang Hib Santo Domingo, nước cộng hòa Dominic cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib: 1,5% (ở trẻ tháng); cao 12,5% (ở trẻ - 11 tháng); 6% (ở trẻ 12 23 tháng); 7,9% (ở trẻ 24 - 35 tháng); 9,8% (ở trẻ 36 - 47 tháng) [62] Thêm vào đó, Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu Muge Oguzkaya - Artan cộng cho thấy tỷ lệ trẻ nhỏ lứa tuổi - mang Hib với tỷ lệ 4,2% [87]; Sao Paulo Brazil, Lucia Ferro Bricks với 1200 trẻ nhỏ tuổi chăm sóc 29 Nhà trẻ Taubatộ (trong đó, 213 trẻ khơng tham dự, cịn lại 987) cho thấy 172 trẻ phân lập H.influenzae (17,4%), có 73 chủng Hib Nghĩa tỷ lệ trẻ mang Hib nhà trẻ nghiên cứu 7,4% [36] Vì vậy, hầu hết nghiên cứu nước nước cho thấy tỷ lệ mang H.influenzae nói chung, Hib nói riêng trẻ chăm sóc nhà trẻ - mẫu giáo thường cao (khoảng 15,0% - 25%) Trong đó, tỷ lệ mang Hib thấp lứa tuổi tháng, tỷ lệ cao lứa tuổi từ tháng - tuổi (đặc biệt nhóm tuổi - 11 tháng) giảm dần tuổi trưởng thành [7], [8], [56], [63], [87] Điều kiện sống đông đúc hộ, trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày góp phần làm cho tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trẻ nhỏ cao cách đáng kể Một số nghiên cứu cho thấy có xảy nhiễm khuẩn xâm lấn Hib, tỷ lệ mang vi khuẩn đứa trẻ khác nhóm 58% trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày 91% nhà giữ trẻ nhỏ Tương tự, gia đình, có trường hợp bị nhiễm bệnh xảy ra, tỷ lệ nhiễm khuẩn khảo sát 6070% anh em ruột 20% bậc cha mẹ [28], [77] Tuy nhiên, số nghiên cứu khác cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn Hib cao số trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày cho dù khơng có trường hợp mắc bệnh xảy Điều cho thấy vi khuẩn Hib lây truyền trẻ mang vi khuẩn khơng có triệu chứng Mặc dù thực tế cho thấy tỷ lệ trẻ 135 mang Hib thường 5%, tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày báo cáo chiếm khoảng 15-25% [56], [76], [87], [128] Điển hình nghiên cứu lâu dài 18 tháng trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày Dallas, người ta thấy khơng có trường hợp mắc bệnh tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trung bình 10%, đó: trẻ từ 18-35 tháng tuổi tỷ lệ mang vi khuẩn 71%, 48% trẻ từ 3671 tháng tuổi Điều gợi ý nguồn vi khuẩn lứa tuổi mẫu giáo bị lây từ lứa tuổi bé Sự xâm chiếm vi khuẩn tỵ hầu tồn hàng tháng [76] Nghiên cứu tiến hành trẻ tuổi số nhà trẻ - mẫu giáo, với điều kiện hoàn toàn không mắc bệnh đường hô hấp, chưa sử dụng vacxin phịng Hib khơng sử dụng loại kháng sinh vòng 15 trước ngày lấy bệnh phẩm tăm bụng ngoỏy họng để nuôi cấy xác định Hib Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn H.influenzae nói chung chiếm 43,8% cao so với nghiên cứu nước Lê Huy Chính năm 2007 [8] Phạm Văn Ca năm 2003 [7], phù hợp với kết nghiên cứu Mỹ [63] Tỷ lệ vi khuẩn Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi chiếm 24,5% cao so với nghiên cứu Phạm Văn Ca (13,5% - 17,5%), tương tự số nghiên cứu giới [65] Điều giải thích đối tượng trẻ khỏe mạnh nghiên cứu thu thập nhà trẻ, mẫu giáo nên tỷ lệ mang Hib thông thường cao trẻ thu thập cộng đồng [56], [128] Ngồi ra, tỷ lệ khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) theo giới, theo nhóm tuổi hay điều kiện nhà trẻ - mẫu giáo điều tra Điều gợi ý cho thấy trẻ tuổi mang Hib ln có tỷ lệ cao hầu hết tất nhà trẻ - mẫu giáo có lây 136 truyền Hib trẻ thuộc nhóm tuổi khác nên dẫn đến khơng có khác biệt tỷ lệ mang vi khuẩn nhóm tuổi KẾT LUẬN 4.1 Tỷ lệ loại biotype chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), chủ yếu tập trung biotype II (lần lượt là: 70,6%; 48,1%) biotype I (lần lượt là: 16,7%; 26,9%), biotype khác (III, IV, V) chiếm tỷ lệ khơng đáng kể 4.2 Tỷ lệ chủng Hib có khả sinh enzym β-lactamase phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (lần lượt là: 50,0%; 46,2%); gen mã hóa enzym chủ yếu TEM-1 (lần lượt là: 98,0%; 95,8%), ROB-1 chiếm tỷ lệ không đáng kể (lần lượt là: 2,0%; 4,2%) 4.3 Kết xác định mức độ nhạy cảm với số kháng sinh Hib: - Những chủng Hib phân lập nhạy cảm tốt với số loại kháng sinh: cephalosporin hệ 3, clarithromycin, azithromycin, rifampicin (100%) ampicillin/sulbuctam (97,1% Hib gõy viêm màng não; 98,1% với chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) - Hib phân lập đề kháng nhiều kháng sinh ampicillin (50,0% Hib gây viêm màng nóo 48,1% Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) choloramphenicol (54,9% Hib gây viêm màng não 137 44,2% Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) Khả đề kháng hai loại kháng sinh có liên quan với khả sinh enzym β-lactamase Hib 4.4 Phõn bố genotype (theo kỹ thuật PFGE) Hib gõy viêm màng não có tớnh tập trung vào nhúm genotype chính, chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype tản mạn vào nhiều gentype khác Trong đó, 1,9% (01) chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có chung genotype với 01 chủng Hib gõy viêm màng não 3,9% (02) chủng Hib khác phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype liên quan gần gen với genotype 02 chủng Hib khác gõy viêm màng não 4.5 Giữa chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng não trẻ khỏe mạnh khơng có khác biệt đặc điểm phõn loại biotype, khả sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym mức độ nhạy cảm với kháng sinh Tuy nhiên, chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng não trẻ khỏe mạnh có khác biệt với phõn loại theo genotype 4.6 Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo điều tra mang Hib chiếm 24,5% Tỷ lệ khơng có liên quan đến giới, nhóm tuổi trẻ điều kiện nhà trẻ, mẫu giáo (thành thị hay nông thôn) 138 KIẾN NGHỊ Tiến hành tiờm chủng mở rộng vacxin cộng hợp Hib cho trẻ từ sau 02 tháng tuổi Để điều trị có hiệu phịng ngừa phát triển lây lan chủng vi khuẩn Hib kháng thuốc cần coi trọng công tác xét nghiệm điều trị theo kháng sinh đồ Đảm bảo hiệu điều trị diệt khuẩn: cần thu thập chủng vi khuẩn Hib gõy bệnh, theo dõi thay đổi tính nhạy cảm với kháng sinh để phát chủng có gen kháng thuốc đột biến (thuộc chủng BLNAR) Tiến hành thu thập số chủng Hib từ bệnh nhi viêm màng não từ trẻ khỏe mạnh tuổi địa điểm với số lượng nhiều để đỏnh giá phát tán genotype gây viêm màng não cho trẻ tuổi cộng đồng ... ? ?Đặc điểm sinh học phân tử Haemophilus influenzae typ b phân lập từ b? ??nh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh nhà trẻ, mẫu giáo? ??, nhằm thực mục tiêu: Xác định biotype, genotype, khả sinh enzym... trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo So sánh đặc điểm sinh học Hib g? ?y viêm màng não trẻ tuổi với Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn 3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Haemophilus influenzae. .. nh? ?y cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ b? ??nh nhi viêm màng nóo tuổi Xác định tỷ lệ, biotype, genotype, khả sinh enzym  -lactamase mức độ nh? ?y cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ trẻ

Ngày đăng: 18/03/2021, 19:30

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa bởi kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [89]

  • Chú thích:

  • - M (marker): thang mẫu ADN.

  • - Mã chủng được xếp tương ứng với mỗi mẫu PFGE.

  • ĐẶT VẤN ĐỀ

  • Chương 1

  • 1.1.2.2. Sức đề kháng [127]

  • H. influenzae là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh. Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng.

  • 1.1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy [19]

  • Điều kiện nuôi cấy:

  • 1.1.3. Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh (serotype) và typ sinh học (biotype) của H. influenzae

  • 1.1.3.1. Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ huyết thanh [19], [43], [89]

  • 1.1.3.2. Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ sinh học (biotype)

  • Bảng 1.2: Phân loại H. influenzae theo typ sinh học của Killian [43]

  • Biotype

  • Các tính chất hoá học

  • I

  • +

  • II

  • +

  • III

  • -

  • IV

  • -

  • V

  • VI

  • +

  • VII

  • VIII

  • Kilian đã đưa ra phương pháp sử dụng một số thử nghiệm sinh hoá để xác định biotype và đặc điểm sinh học của các loài Haemophilus dựa trên kết quả của 3 thử nghiệm: tìm khả năng sinh indol, hoạt động của hai enzym urease và decarboxylase của vi khuẩn. Trước đây, Kilian nghiên cứu và chia H. influenzae thành 4 biotype từ I đến IV. Những biotype này độc lập với typ huyết thanh của vi khuẩn đó, bởi vì các chủng không có vỏ cũng cho kết quả tương tự với ba phản ứng sinh hoá ở trên. Sau này, cũng với những thử nghiệm tương tự, Kilian đã bổ sung thêm 4 biotype từ V đến VIII. Vì vậy, H. influenzae được chia ra làm 8 typ theo tiêu chuẩn của Killian [43].

  • 1.1.4. Miễn dịch [28], [89]

  •  Miễn dịch tự nhiên của cơ thể đối với Hib rất đa dạng, bao gồm một sự hợp tác phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố miễn dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa và quá trình hoạt hóa các phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả năng thực bào, diệt vi khuẩn bởi những đại thực bào và tế bào đa nhân, 5) Chức năng miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T. Trong đó khó có thể đánh giá rạch ròi cơ chế miễn dịch nào là quan trong nhất trong những cơ chế bảo vệ cơ thể vật chủ. Tuy nhiên, hầu hết các cá thể có được khả năng miễn dịch bảo vệ trong những năm đầu của cuộc đời mà không mắc bệnh nhiễm khuẩn Hib lan tràn. Khả năng miễn dịch thu được một cách tự nhiên này, đó là kết quả của đáp ứng với sự xâm nhiễm họng - mũi của Hib cũng như sự xâm nhiễm không triệu chứng ở ruột của hệ vi khuẩn đường ruột bình thường, dẫn đến có phản ứng chéo với kháng nguyên Hib. Mối liên quan tỷ lệ nghịch giữa nguy cơ mắc bệnh nhiễm khuẩn do Hib đặc thù đối với tuổi và nồng độ kháng thể tự nhiên kháng Hib có được trong những năm tháng đầu của cuộc đời. Đặc điểm này cũng đã nêu lên được tầm quan trọng của kháng thể trong việc bảo vệ cơ thể khỏi bệnh nhiễm khuẩn lan tràn do Hib. Hiện tượng trên được mô tả đầu tiên bởi Fothergill và Wright năm 1933 [47], người ta biết trẻ sơ sinh đã có được kháng thể diệt khuẩn immunoglobulin G (IgG) từ mẹ, kháng thể này yếu dần đi trong những tháng tuổi đầu tiên, đồng thời với nguy cơ nhạy cảm theo tuổi giữa tháng tuổi thứ 6 cho đến 2 - 4 tuổi nên để bảo vệ cơ thể cần phải thông qua việc gây miễn dịch chủ động.

  • Mặc dù đặc điểm miễn dịch tự nhiên đối với vi khuẩn Hib là miễn dịch đáp ứng với vài loại kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn này, song kháng thể kháng polysaccharide vỏ thuộc typ b (PRP) dường như có tầm quan trọng nhất. Đối với loài H. influenzae typ b, 90% tổng số những kháng thể kháng PRP có khả năng hoạt hóa bổ thể giúp tăng hoạt động thực bào và diệt vi khuẩn nhờ opsonin hóa để bảo vệ cơ thể. Ở người, trước khi có kháng sinh, việc sử dụng thụ động globulin miễn dịch chống lại Hib đã là phương pháp để điều trị hiệu quả bệnh nhiễm khuẩn lan tràn này. Tuy nhiên, kháng nguyên vỏ của Hib lại không được nhận biết bởi đại thực bào và tế bào lympho T nhưng lại kích thích cỏc dũng tế bào lympho B đặc hiệu, do đó được gọi là kháng nguyên độc lập với tế bào T. Vì vậy, kháng nguyên vỏ của Hib sẽ bị hạn chế về khả năng đáp ứng miễn dịch, không hoạt hóa được các tế bào lympho T hỗ trợ đặc hiệu. Tế bào T hỗ trợ tác động đến sự chín muồi, biệt hóa và tăng sinh các tế bào B để những tế bào này trở thành tương bào sản xuất kháng thể. Tế bào T hỗ trợ cũng có thời gian sống dài và tạo nên trí nhớ miễn dịch cần thiết cho đáp ứng tăng cường tiếp theo khi cơ thể tiếp xúc trở lại với kháng nguyên này. Kết quả của những đáp ứng kháng thể thiếu sự tham gia của tế bào T thì hiệu lực miễn dịch sẽ thấp. Để khắc phục nhược điểm này, trong sản xuất vacxin, thành phần PRP đã được cộng hợp (liên kết cộng hóa trị) với nhiều loại protein có tính sinh miễn dịch làm tăng cường khả năng nhận biết của đại thực bào và tế bào T, để có những ưu điểm như sau:

  • 1) Tạo được nồng độ kháng thể cao hơn, đặc biệt ở trẻ nhỏ.

  • 2) Khi nhắc tiêm nhắc lại, vacxin sẽ kích thích miễn dịch tăng lên, vì thế đõy là một phương pháp làm tăng tối đa tính miễn dịch.

  • 3) Đáp ứng miễn dịch chín muồi hơn, đặc thù hơn bởi sự chiếm ưu thế của các kháng thể IgG-1.

  • 4) Việc dùng trước hay dùng đồng thời các protein mang (dạng hapten-như độc tố uốn ván hoặc bạch hầu) đã tăng cường đáp ứng của tế bào T, nhờ đó làm tăng tối đa đáp ứng miễn dịch với PRP khi cộng hợp với chất mang.

  • 1.1.5. Khả năng gõy bệnh viêm màng nóo của Hib

  • 1.1.6. Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm viêm màng não do Hib

  • + Tiến hành xác định biotype (typ sinh học) các chủng Hib phân lập được bằng thanh xác định tính chất sinh vật hóa học Api 10s (bioMộrieux) [12].

  • 1.2. Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib, tình hình viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi trong nước và trên thế giới

  • 1.2.1. Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib

  • Những nước khỏc trờn thế giới, hầu hếu các nghiên cứu đều cho thấy Hib là căn nguyên chủ yếu gây viêm màng não. Điển hình như nghiên cứu ở Mỹ năm 1990 cho thấy 3 vi khuẩn hàng đầu gây viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi là: Hib, S. pneumoniae, N. meningitidis lần lượt chiếm tỷ lệ là 45%, 18% và 14% [94]; tại Oman năm 2008 vi khuẩn Hib, S. pneumoniae, N.meningitidis gây viêm màng não lần lượt chiếm tỷ lệ là 22%, 15% và 11% [89]. Tuy nhiên, hiện nay ở những nước phát triển đã đưa vacxin phòng Hib vào chương trình tiêm chủng quốc gia thì tỷ lệ viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi giảm xuống rất thấp, có thể xuống gần 0% [58]

  • Tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não do Hib hiện nay đã giảm một cách đáng kể ở những nước đã đưa vacxin phòng Hib vào chương trình tiêm chủng quốc gia. Minh chứng cho vấn đề này, một số nghiên cứu tại Isarel, Đài Loan cho thấy tỷ lệ mắc viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi giảm xuống còn khoảng 5/100.000 sau khi sử dụng vacxin phòng Hib tại các nước này [93].

  • + Tại Việt Nam, Phan Lê Thanh Hương cho thấy tỷ lệ tử vong của viêm màng não do Hib là 3% và các di chứng nặng do Hib (như: điếc - nghễnh ngãng, mù - giảm thị lực, chậm phát triển tâm thần, động kinh, não úng thủy và trạng thái thực vật) chiếm 13% [11]. Điều này cho thấy gánh nặng bệnh tật do Hib gây ra rất lớn không những cho gia đình bệnh nhân mà còn cho toàn xã hội.

  • + Trên thế giới, một điều tra phân tích kết quả của 229 nghiên cứu về viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi, cho thấy tỷ lệ tử vong trung bình là 13,8% (với trung vị 10% và dao động trong khoảng 0,0 - 65%). Trong đó, tỷ lệ chết trung bình là 17,3% ở các nước đang phát triển, so sánh với 3,2% ở các nước công nghiệp. Ngoài ra, tỷ lệ chết thấp ở châu Âu là 4,1% và cao ở châu Phi là 27,6% [128].

  • + Yếu tố miễn dịch: [28]

  • Sự cảm thụ với những nhiễm khuẩn do Hib gia tăng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, nguyên nhân trực tiếp bởi cơ thể không có đầy đủ kháng thể kháng PRP. Nồng độ kháng thể kháng PRP trong huyết thanh liên quan đến lứa tuổi, do đó mức độ cảm thụ đối với Hib cũng tương quan trực tiếp với lứa tuổi. Trẻ sơ sinh có kháng thể thu được tạm thời IgG kháng PRP do mẹ truyền qua rau thai, rồi giảm dần sau tháng thứ nhất. Miễn dịch tự nhiên thu được thường không xảy ra trước lứa tuổi từ 2 đến 4 tuổi. Vì vậy, trẻ em ở lứa tuổi giữa 2 tháng đến 2 tuổi có nguy cơ cao nhất dễ mắc bệnh xâm nhập do Hib. Cho nên, trên thực tế, tỷ lệ viêm màng não do Hib không đồng đều ở các nhóm tuổi mà gặp nhiều nhất ở lứa tuổi dưới 23 tháng [10], [11], [94].

  • Kháng thể kháng PRP thu được không phải là kết quả duy nhất do sự định cư của Hib trên bề mặt niêm mạc. Nhiều trẻ em phát triển tự nhiên kháng thể kháng PRP mặc dù không nhiễm các chủng typ b. Điều này có thể do kết quả định cư của những vi khuẩn cú cỏc kháng nguyên vỏ gây phản ứng chéo với Hib, như nhiễm vi khuẩn đường ruột Escherichia coli K100. Trẻ em dưới 2 tuổi có nồng độ kháng thể kháng PRP thấp hoặc không phát hiện thấy đáp ứng với nhiễm khuẩn do Hib hoặc vacxin vỏ PRP. Những kháng thể kháng lại kháng nguyên thân (antisomatic) hay loại kháng nguyên protein được đáp ứng do lây nhiễm các chủng H. influenzae không có vỏ cũng có thể bị phản ứng chéo được với các chủng H. influenzae có vỏ. Miễn dịch thụ động do kháng thể có tác dụng lên trên phần oligosaccharide của Haemophilus có tác dụng bảo vệ trong gây bệnh thực nghiệm, nhưng sự hiện diện của chúng trong huyết thanh ở giai đoạn cấp của một số trẻ sơ sinh bị nhiễm khuẩn do Hib cũng khêu gợi rằng chúng không có tác dụng bảo vệ trong bệnh cảnh lâm sàng [28].

  • + Vai trò của vacxin đặc hiệu trong phòng bệnh viêm màng não do Hib:

  • Vacxin phòng Hib được triển khai lần đầu tiên vào cuối năm 1985 nhằm để giải quyết 3 mối quan tâm chính, đó là: tỷ lệ tử vong cao bởi bệnh nhiễm trùng do Hib gây ra, di chứng nặng nề ở những trẻ viêm màng não do Hib xảy ra với tỷ lệ cao và sự gia tăng đề kháng của vi khuẩn này với các kháng sinh thông dụng. Kháng thể kháng PRP trong huyết thanh được biết là yếu tố căn bản để bảo vệ cơ thể trước nguy cơ tấn công của Hib. Vỡ vậy, các nỗ lực đã được thực hiện để tăng nồng độ kháng thể trong máu bằng cách sử dụng vacxin sản xuất từ vỏ polysaccharide tinh chế. Trong khi vacxin PRP có hiệu quả trong bảo vệ trẻ từ 18 tháng tuổi trở lên chống lại các bệnh nhiễm trùng xâm hại do Hib (hiệu quả ước tính đạt 90%), nhưng không có tác dụng bảo vệ với lứa tuổi bé hơn, đõy là lứa tuổi có tỷ lệ mắc bệnh do Hib cao nhất [94].

  • Hiện tượng vacxin PRP không có khả năng bảo vệ cho trẻ ở lứa tuổi nhỏ hơn đối với Hib được giải thích do cấu trúc hóa học vỏ polysaccharide của vi khuẩn này. PRP, một dạng trùng hợp của các đường pentose, không kích thích được đáp ứng miễn dịch độc lập của tế bào lympho T và không phải là một kháng nguyên mạnh, đặc biệt là ở trẻ nhỏ. Ngoài ra, kháng nguyên carbohydrate, chẳng hạn như kháng nguyên polysaccharide của vỏ tế bào một số vi khuẩn được mô tả là kháng nguyên typ 2 không phụ thuộc lympho T (TI-2 antigen: T cell independent type 2 antigen). Tuy nhiên, đối với nhiều kháng nguyên được xếp vào loại phụ thuộc hay không phụ thuộc lympho T dựa nhiều vào kiểu đáp ứng miễn dịch hơn là sự liên quan của lympho T trong kích thích đáp ứng miễn dịch đó. Ở trẻ nhỏ, kháng thể đáp ứng với kháng nguyên không phụ thuộc lympho T thấp, chủ yếu đáp ứng với tỷ lệ cao loại kháng thể IgM và không có hỗ trợ đáp ứng miễn dịch khi lặp lại các liều kháng nguyên [28], [109].

  • Biến đổi kháng nguyên polysaccharide thành kháng nguyên phụ thuộc lympho T để trẻ nhỏ có thể đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn, đòi hỏi kháng nguyên này phải được liên kết đồng hóa trị với một số phân tử protein, do đó vacxin cộng hợp (conjugated vaccine) ra đời. Hầu hết những kết quả nghiên cứu về sự khác biệt của vacxin cộng hợp, cho thấy kháng nguyên khi được liên kết với phân tử protein sẽ có khả năng kích thích được đáp ứng miễn dịch phụ thuộc lympho T. Cho dù kháng nguyên polysaccharide được gắn với một phân tử protein, cấu trúc bị thay đổi nhưng kháng nguyên này vẫn mang tính đặc hiệu cao và có khả năng kích thích miễn dịch mạnh hơn so với kháng nguyên tinh chất ban đầu. Vacxin cộng hợp có khả năng đem đến miễn dịch chống lại Hib cho trẻ dưới 6 tháng [31].

  • Có 4 loại vacxin phòng Hib đã trải qua đỏnh giỏ trờn lâm sàng: PRP-D (Connaught Laboratories), PRP-T (Pasteur – Meriéux), PRP-OMPC (Merck Sharp and Dohme) và HbOC (Praxis Biologicals). Mỗi loại vacxin này có sự khác nhau về một hay vài đặc điểm như: loại phân tử protein cộng hợp với kháng nguyên polysaccharide, kích thước của bán kháng nguyên polysaccharide, loại liên kết giữa kháng nguyên với protein cộng hợp và tỷ lệ của polysaccharide với protein. Những khác biệt về hóa lý như vậy đều có ảnh hưởng đến khả năng kích thích miễn dịch của từng loại vacxin. Thêm vào đó, sự khác nhau về liều vacxin và khoảng cách giữa các liều cũng ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch hay khả năng bảo vệ của cơ thể.

  • Nồng độ kháng thể trong huyết thanh được sinh ra do vacxin cần thiết để chống lại Hib chưa được biết chính xác. Đõy là vấn đề đưa ra rất phức tạp khi với một nồng độ kháng thể tương đương vẫn có thể có hoạt động chức năng khác nhau [53]. Sự duy trì nồng độ ngưỡng của kháng thể kháng PRP trong huyết thanh có thể không cần thiết nếu những đứa trẻ được gây miễn dịch đáp ứng có hiệu quả khi phơi nhiễm với Hib.

  • Những nghiên cứu về hiệu lực của vacxin cho thấy PRP-D, PRP-T, PRP-OMPC và HbOC có thể ngăn chặn được hơn 90% các bệnh nhiễm trùng do Hib [31], [32], [112]. Tuy nhiên, PRP-D được chứng minh là không có hiệu quả trong thử nghiệm về hiệu lực ở trẻ em vùng Alaska [126]. Vì vậy, sự lựa chọn giữa vacxin không phù hợp có thể bị chỉ trích ở những vựng dõn cư, ở đú có áp lực về bệnh nhiễm trùng rất cao và tỷ lệ mắc bệnh nhiều nhất gặp ở lứa tuổi nhỏ. Tại những quần thể này, vacxin cộng hợp có khả năng kích thích miễn dịch mạnh ngay liều đầu tiên là lựa chọn tốt nhất [28]. Cho nên, những đứa trẻ nhỏ nhất với nguy cơ mắc Hib cao nhất sẽ có cơ hội sớm nhất đạt được miễn dịch đủ khả năng bảo vệ cơ thể. Ngoài ra, trong hầu hết các quần thể dân cư, sự lựa chọn vacxin còn phải dựa trên các yếu tố khác, đặc biệt quan trọng nhất là giá cả.

  • 1.3. Mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh thông dụng của Hib

  • Những kháng sinh thường được dùng trong điều trị Hib trên lâm sàng đó là: nhóm β - lactam (ampicilin, sulbactum/ampicilin, ceftriaxon, cefaclor, cefotaxim, cefpodoxim), nhóm macrolide (azithromycin, clarithromycin) và cỏc nhúm khỏc (chloramphenicol, levofloxacin, rifampicin…). Từ những năm 1970, tỷ lệ kháng ampicillin do sản xuất enzym β-lactamase của H. influenzae đã tăng lên trên toàn thế giới, cụ thể lên tới 20 - 30% đã được một số nghiên cứu báo cáo [42], [63]. Ngoài ra, sự đề kháng với các kháng sinh khác như co-trimoxazole, tetracycline và chloramphenicol cũng đã được đưa ra. Tỷ lệ lớn nhất các chủng Hib đa khỏng đó được mô tả ở Tây Ban Nha và Bỉ [113]. Hiện nay, tỡnh hình đề kháng của Hib đối với kháng sinh ngày càng ra tăng mạnh mẽ, phức tạp và có sự khác nhau ở từng nước riêng biệt thể hiện qua một số nghiên cứu. Đặc điểm về khả năng đề kháng đa dạng của Hib phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó phải kể đến thói quen và sự lạm dụng thuốc trong điều trị [54]. Tuy nhiên, những loại kháng sinh như: ceftriaxon, cefaclor, cefotaxim, cefpodoxim, meropenem, levofloxacin, rifampicin dùng trong điều trị vẫn có hiệu quả với mức độ nhạy cảm khá cao.

  • Số đoạn ADN (band) khác nhau

  • Mối liên quan

  • 0

  • Không thể phân biệt được (Indistinguishabble)

  • 2 - 3

  • Có mối liên quan gần (Closely related)

  • 4 - 6

  • Có thể có liên quan (Possibly related)

  •  7

  • Khác nhau hoàn toàn (Different)

  • Chương 2

  • 2.1. Đối tượng nghiên cứu

  • Tất cả các chủng vi khuẩn có đặc điểm sinh học sau:

  • 2.2. Địa điểm nghiên cứu

  • - Phòng Vi khuẩn Hô hấp, Khoa Vi khuẩn - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

  • - Khoa Vi sinh, Khoa Truyền nhiễm - Bệnh viện Nhi Trung ương.

  • - Một số nhà trẻ, mẫu giáo tại Hải Dương và Hà Tây (nay thuộc Hà Nội).

  • Thời gian tiến hành nghiên cứu từ 7/2006 đến 10/2009.

  • 2.3. Phương pháp nghiên cứu

  • 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu

  • 2.3.2. Nội dung các bước nghiên cứu

  • 2.3.2.1. Đối với những chủng Hib phân lập từ trẻ bệnh:

  • Toàn bộ 102 chủng Hib gõy bệnh viêm màng nóo được phõn tích theo các bước sau đõy:

  • - Xác định biotype, khả năng sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa tổng hợp enzym β-lactamase.

  • - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh thông dụng theo phương pháp E-test (Mục đích của phần nghiên cứu này nhằm cung cấp những thông tin về mức độ nhạy cảm với kháng sinh và nồng độ ức chế tối thiểu của mỗi kháng sinh đối với Hib gõy viêm màng nóo. Qua đõy, kết quả nghiên cứu sẽ giúp ích cho các bác sỹ lõm sàng trong công tác điều trị).

  • - Phõn tích cấu trúc ADN của Hib dựa trên phương pháp PFGE để xác định phõn loại genotype.

  • 2.3.2.2. Đối với các chủng Hib phân lập từ nhóm trẻ khoẻ mạnh:

  • Để xác định tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib, chúng tôi thu thập đối tượng trẻ dựa theo những tiêu chuẩn sau đõy:

  • + Trẻ không có tiền sử mắc bệnh nhiễm trùng đường hô hấp và không có tiền sử điều trị kháng sinh 15 ngày trở lại.

  • Trong đó:

  • p: là tỷ lệ trẻ khỏe mạnh tại các nhà trẻ, mẫu giáo có mang Hib được ước tớnh là p = 0,26 (26%) (Kết quả này chúng tôi có được sau khi tiến hành điều tra thử tại một nhà trẻ, mẫu giáo. Trong tổng số 50 trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi, chúng tôi phõn lập được 13 chủng Hib, tương ứng với 26%)

  • : Mức độ tin cậy = 0,05.

  • Z1-/2: Hệ số tin cậy (tra bảng với  = 0,05) = 1,96.

  • ε: Hệ số chính xác, chấp nhận ε = 0,25.

  • Thay vào công thức ta có: n = 174,94; cỡ mẫu nhỏ nhất là 175, do đó lấy mẫu là 212. Mẫu nghiên cứu được thu thập theo bốn nhóm tuổi, cụ thể: dưới 24 tháng tuổi, 24 - 35 tháng tuổi, trên 36 – 47 tháng tuổi, trên 48 - 59 tháng tuổi (lần lượt với số lượng: 54, 52, 55 và 51).

  • - Phân lập Hib từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi:

  • + 212 mẫu bệnh phẩm (tăm bụng) ngoỏy họng của 212 trẻ dưới 5 tuổi ở 04 nhà trẻ (tại Hải Dương 02 nhà trẻ (01 ở nông thôn, 01 ở thành phố) và Hà Tây (nay thuộc Hà Nội) 02 nhà trẻ (01 ở nông thôn, 01 ở thành phố)) được giữ trong những ống nghiệm vô khuẩn chứa 1ml canh thang não - tim (BHI) ở nhiệt độ phòng và vận chuyển trong 4 giờ về phòng thí nghiệm.

  • + Nuôi cấy, phân lập và xác định Hib tại phòng “Phòng Vi khuẩn Hô hấp” - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

  • - Xác định biotype, khả năng sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa tổng hợp enzym β-lactamase.

  • - Xác định mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh thông dụng theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán Kirby - Bauer (Mục đích của phần nghiên cứu chúng tôi chỉ xem xét những thông tin chung về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng Hib phõn lập được từ trẻ khỏe mạnh nên không xác định nồng độ ức chế tối thiểu của mỗi kháng sinh đối với Hib).

  • - Phõn tích cấu trúc ADN của Hib dựa trên phương pháp PFGE để xác định phõn loại genotype (52 chủng).

  • 2.3.2.3. So sánh đặc điểm sinh học, xác định mối liên quan giữa những chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo và Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • - Xác định mối liên quan giữa đặc điểm phõn loại biotype, khả năng sinh enzym β-lactamase, gen quy định enzym β-lactamase giữa những chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh.

  • - So sánh đặc điểm sinh học giữa những chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh.

  • 2.4. Vật liệu và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

  • 2.4.1. Vật liệu

  • 2.4.1.1. Sinh phẩm, hoá chất, dụng cụ dùng trong kỹ thuật phân lập xác định biotype vi khuẩn Hib

  • - Que cấy, nước muối vô trùng, lam kớnh.

  • - Thanh E-test của các loại kháng sinh:

  • Ampicillin, ampicillin/sulbactum, cefaclor, cefotaxim, ceftriaxon, chloramphenicol, erythromycin, clarithromycin, azithromycin, rifampicin(*) (Hóng AB Bio-Disk, Sweeden).

  • - Khoanh giấy kháng sinh, với các loại kháng sinh tương tự trên(*) (Hóng Bio-rad, France).

  • Sinh phẩm (Invitrogen Co. Singapore)

  • Hoá chất

  • Dụng cụ, máy móc phục vụ kỹ thuật PCR

  • - Máy li tâm lạnh (Biofuge, USA).

  • - Máy điều nhiệt tự động (Master Cycler - Eppendorf, Germany)

  • - Bộ điện di ngang (Fisher Scientific, USA).

  • - Máy chụp ảnh gel (UVP, USA) và phim Kodak cỡ 667.

  • 2.4.1.4. Sinh phẩm, hoá chất, dụng cụ, máy móc dùng trong PFGE

  • Sinh phẩm

  • Hoá chất

  • Ethidium bromide dùng để nhuộm các đoạn ADN.

  • Dụng cụ, máy móc phục vụ cho kỹ thuật PFGE

  • 2.4.2.1. Lấy bệnh phẩm [127]

  • Bệnh phẩm là mẫu tăm bông ngoáy họng, được lấy ở họng miệng bằng tăm bông cán gỗ vô trùng.

  • Quy trình lấy bệnh phẩm: [99]

  • 2.4.2.2. Phân lập và xác định biotype của các chủng Hib nghiên cứu

  • - Xác định serotype (typ huyết thanh) Hib bằng phương pháp ngưng kết với kháng huyết thanh mẫu, theo phương pháp sau: [12], [128]

  • - Dùng pippett vô khuẩn hút huyền dịch vi khuẩn, nhỏ vào 3 hốc cần làm phản ứng (Ure, Indol và ODC) của bộ sinh vật hoá học Api 10s.

  • - Để 24 giờ, sau đó đọc kết quả theo tiêu chuẩn của Kilian [11].

  • 2.4.2.4. Xác định gen mó hoỏ tổng hợp enzym -lactamase (TEM hoặc ROB):

  • Được thực hiện với các chủng Hib có test cefinase (+), gồm các bước:

  • Tiến hành tách chiết ADN 

  • Theo phương phỏp tỏch chiết nhanh ADN của Pitcher và cộng sự [98]:

  • - Lấy khoảng 8 khuẩn lạc vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy vào trong 50l nước cất hai lần vô trùng và khuấy đều bằng máy Vortex. Sau đó, đun sôi trong vòng 3 phút rồi ly tâm với 12.000/phút  3 phút.

  • - ADN khuôn mẫu này được bảo quản trong tủ -700C nếu không tiến hành phản ứng ngay.

  • Tiến hành phản ứng PCR [10], [65]

  • - Quá trình khuyếch đại:

  • Phản ứng khuếch đại cho gen ROB và TEM đều có thể tích cuối cùng là 10l, chứa: 50M (mỗi) primer; 10mM deoxynucleotide triphosphates; 25mM MgCl2; 1l (10  reaction buffer); 0.5 U Taq ADN polymerase và 0,2 l DNA mẫu. Quá trình khuếch đại gồm các thông số: Sau bước biến tính ban đầu ở 94oC trong 5 phút, Giai đoạn 1: Biến tính (94oC trong 30 giây); Giai đoạn 2: Gắn mồi (55oC trong 30 giây); Giai đoạn 3: Kéo dài (72oC trong 30 giây). Quá trình này được thực hiện với 35 chu kỳ, sau đó được ủ 7 phút ở 72oC và sau đó giữ ở 4oC cho đến khi phân tích [65].

  • Điện di

  • - Điện di với hiệu điện thế 100V, cường độ 80mA, thời gian 20 phút.

  • - Luụn có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc

  • Nhuộm ADN và đọc kết quả

  • - Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromide 1% pha loãng trong nước cất (trong 10 phút), sau đó vớt bản gel ra ngâm vào nước cất 10 phút để khử ethidium bromide bỏm khụng đặc hiệu vào thạch.

  • Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn

  • Các bước tiến hành

  • + Huyền dịch vi khuẩn được ly tâm ở 8000 vũng/phỳt  5phút.

  • + Loại bỏ nước nổi và tạo huyền dịch mới bằng 1ml EDTA; chuyển vào một tube nhỏ, trộn đều cẩn thận và ly tâm tiếp ở 8000 vũng/phỳt  5phút.

  • + Loại bỏ nước nổi và cho 130 l Pett IV vào, sau đó trộn đều cẩn thận và giữ ở 37oC/1 giờ (có thể giữ ở 4oC một vài ngày trước khi tiếp tục làm).

  • + Để thạch trong khuôn đông lại ở nhiệt độ phòng 30-45 phút. Bước này có thể thực hiện nhanh hơn bằng cách để ở 4oC sau 20 phút.

  • + Giữ ở 37oC trong nồi cách thủy qua đêm.

  • Phân hủy protein

  • Kết thúc ngày thứ 2

  • Phân cắt các mẫu bằng enzym giới hạn (SmaI)

  • Nói cách khác:

  • 0,0003ml  số bệnh phẩm (Ví dụ là 30) = 0,009ml EDTA.

  • - Cách trình bày kết quả:

  • Nhiều mẫu ADN giới hạn thu được sau khi phõn tích các chủng Hib bằng kỹ thuật PFGE. Trong đó, những kiểu ADN của mỗi chủng Hib có mẫu phõn tích PFGE giống hệt nhau thì được xếp chung vào một genotype. Nếu giữa các genotype chỉ khác nhau bởi 2 - 3 band ADN, được xem là có mối liên quan gần với nhau về gen. Nếu giữa các genotype chỉ khác nhau bởi 4 - 6 band ADN, được xem là có thể có mối liên quan với nhau về gen. Nếu giữa các genotype khác nhau ≥ 7 band ADN, được xem là không có mối liên quan với nhau về gen.

  • Nhiều kiểu ADN giới hạn thu được từ kỹ thuật PFGE, trong đó những kiểu ADN bao gồm phần nhiều chủng Hib khác nhau tập hợp lại và có cấu trúc ADN giống hệt nhau được xác định là những chủng dịch hoặc là những chủng phổ biến và được xếp vào các genotype chớnh là A, B, C... Thêm vào đó, giữa các genotype này phải không được có mối liên quan về gen với nhau. Những chủng còn lại có liên quan về cấu trúc ADN với một trong những genotype phổ biến A, B, C..., được xếp vào những genotype phụ, ít phổ biến hơn. Cụ thể, cách phân loại như sau (hình 2.7):

  • + Những mẫu ADN giới hạn không phân biệt được với mẫu của typ A (hoặc B...) thì được xếp vào typ A (hoặc B...).

  • + Những mẫu ADN giới hạn khỏc cú mối liên quan gần hoặc có thể có liên quan với typ A (hoặc B...), được xếp vào các typ phụ (Subtype) của A như: A1, A2… (hoặc B1, B2...).

  • + Những mẫu ADN giới hạn không giống hoặc không có mối liên quan gần hay không có liên quan về ADN với bất kỳ một chủng nào khác được xem là genotype không xếp loại (KXL).

  • nj: là số chủng trong genotype thứ j.

  • 2.5. Xử lý kết quả

  • Chương 3

  • KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

  • 3.1. Kết quả phõn tích các chủng Hib phân lập được từ bệnh nhi viêm màng nóo

  • 3.1.1. Kết quả xác định biotype của các chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não

  • Bảng 3.1: Phân bố tỷ lệ từng loại biotype của các chủng Hib gõy viêm màng nóo

  • Kết quả

  • Biotype

  • I

  • II

  • III

  • IV

  • V

  • Tổng

  • Số lượng

  • 17

  • 72

  • 9

  • 3

  • 1

  • 102

  • Tỷ lệ (%)

  • 16,7

  • 70,6

  • 8,8

  • 2,9

  • 1,0

  • 100

  • Nhận xét: Trong số 102 chủng Hib gây viêm màng não ở trẻ dưới 5 tuổi được xác định thuộc 5 biotype (I, II, III, IV, V). Trong đó, số lượng chủng Hib thuộc biotype II chiếm tỷ lệ cao nhất (70,6%), tiếp theo là biotype I (16,7%), các biotype III, IV và V có tỷ lệ thấp lần lượt: 8,8%; 2,9% và 1,0%.

  • 3.1.2. Tỷ lệ chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo có enzym β-lactamase và loại gen mó hoỏ

  • - Tỷ lệ các chủng Hib có khả năng sản xuất enzym -lactamase

  • Bảng 3.2: Tỷ lệ chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não có khả năng sản xuất enzym -lactamase

  • Kết quả

  • -lactamase

  • Số lượng

  • Tỷ lệ (%)

  • p

  • Dương tớnh (+)

  • 51

  • 50

  • Chi-square test

  • (Test proportion: 0,5)

  • Âm tớnh (-)

  • 51

  • 50

  • Tổng

  • 102

  • 100

  • Nhận xét: Kết quả cho thấy có 51 (50%) chủng Hib gõy viêm màng nóo cho trẻ dưới 5 tuổi có khả năng sinh enzym β-lactamase. Chủng Hib sinh enzym β-lactamase và không sinh β-lactamase chiếm tỷ lệ ngang nhau, tức là không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

  • - Tỷ lệ từng loại gen mó hoỏ tổng hợp enzym -lactamase

  • Bảng 3.3: Tỷ lệ từng loại gen mó hoỏ tổng hợp enzym -lactamase của các chủng Hib có enzym -lactamase phân lập được từ trẻ viêm màng não

  • Gen đề kháng

  • Số lượng

  • Tỷ lệ (%)

  • p

  • TEM-1

  • 50

  • 98,0

  • Chi-square test

  • (Test proportion: 0,5)

  • ROB-1

  • 1

  • 2,0

  • Tổng

  • 51

  • 100

  • Nhận xét: Bảng 3.3 cho thấy, hầu hết gen quy định tổng hợp enzym β-lactamase của các chủng Hib gây viêm màng nóo là TEM-1 (98,0%) và gen ROB-1 chiếm tỷ lệ rất nhỏ (2,0%), tức là chủng Hib có -lactamase (+) chủ yếu do gen TEM-1 mã hóa (p < 0,05).

  • 3.1.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của một số loại kháng sinh đối với các chủng Hib gây viêm màng não và tỷ lệ đề kháng

  • Tiến hành xác định nồng độ ức chế tối thiểu, mức độ nhạy cảm với 10 loại kháng sinh thông dụng (ampicillin, ampicillin/sulbactum, cefaclor, cefotaxim, ceftriaxon, cefpodoxime, chloramphenicol, clarithromycin, azithromycin, rifampicin) với 102 chủng vi khuẩn Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não, kết quả cho thấy:

  • (Chú ý: Một số đồ thị thể hiện nồng độ ức chế tối thiểu và mức độ nhạy cảm đối với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo đề cập ở Phụ lục 2, mục 2)

  • - Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của một số loại kháng sinh đối với các chủng Hib gây viêm màng não và tỷ lệ đề kháng

  • Bảng 3.4. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 10 loại kháng sinh đối với 102 chủng vi khuẩn Hib và tỷ lệ đề kháng

  • Kháng sinh

  • MIC (àg/ml)

  • Điểm giới hạn của NCCLS

  • Tỷ lệ kháng

  • (%)

  • Phạm vi

  • (MIC)

  • 50%

  • 90%

  • Nhạy

  • (MIC)

  • Kháng

  • (MIC)

  • Ampicillin

  • 0,125 - >256

  • 8

  • 256

  • 1

  • 4

  • 50%

  • β - LA(+)

  • 2 - >256

  • >256

  • >256

  • 100%

  • β - LA(-)

  • 0,125 - 0,5

  • 0,25

  • 0,5

  • 0

  • Ampicillin/sulbactum

  • 0,125 - 4

  • 1

  • 2

  • 2,9%

  • β - LA(+)

  • 0,125 - 4

  • 1

  • 2

  • 5,8%

  • β - LA(-)

  • 0,125 - 0,5

  • 0,25

  • 0,5

  • 0

  • Chloramphenicol

  • 0,5 - 64

  • 16

  • 64

  • 2

  • 8

  • 54,9%

  • β - LA(+)

  • 8 - 64

  • 16

  • 64

  • 90%

  • β - LA(-)

  • 0,5 - 64

  • 1

  • 32

  • 20%

  • Cefaclor

  • 1 - 4

  • 2

  • 2

  • 8

  • 32

  • 0%

  • Cefotaxim

  • <0,016-0,064

  • 0,016

  • 0,032

  • 2

  • 0%

  • Ceftriaxone

  • <0,016-0,032

  • <0,016

  • <0,016

  • 2

  • 0%

  • Cefpodoxime

  • 0,016 - 0,064

  • 0,064

  • 0,064

  • 0%

  • Azithromycin

  • 1 - 8

  • 4

  • 4

  • 8

  • 0%

  • Clarithromycin

  • 4 - 32

  • 16

  • 32

  • 16

  • 64

  • 0%

  • Rifampicin

  • 0,064 - 256

  • 0,25

  • 0,5

  • 3

  • > 4

  • 0%

  • Chú thích:

  • β - LA (+): chủng Hib có enzym β - lactamase

  • β - LA (-): chủng Hib không có enzym β - lactamase

  • MIC 50%: tại nồng độ đó ức chế được 50% số chủng được xét nghiệm

  • MIC 90%: tại nồng độ đó ức chế được 90% số chủng được xét nghiệm

  • Biểu đồ 3.1: Đồ thị biểu diễn kết quả MIC của các chủng Hib gây viêm màng não với ampicillin theo khả năng sinh enzym β-lactamase

  • Nhận xét: Biểu đồ 3.1 cho thấy nồng độ kháng sinh ampicillin ức chế tối thiểu đối với vi khuẩn Hib có enzym β - lactamase (+) tăng lên 1000 lần so với nồng độ này ở vi khuẩn Hib không có enzym β - lactamase.

  • Biểu đồ 3.2: Đồ thị biểu diễn kết quả MIC của các chủng Hib gây viêm màng não với ampicillin/sulbactum theo khả năng sinh enzym β-lactamase

  • Nhận xét: Biểu đồ 3.2 cho thấy nồng độ của kháng sinh phối hợp (ampicillin/sulbactum) ức chế tối thiểu đối với vi khuẩn Hib có β - lactamase (+) tăng gấp 4 lần so với nồng độ này ở vi khuẩn Hib không có β - lactamase.

  • Biểu đồ 3.3: Đồ thị biểu diễn kết quả MIC của các chủng Hib gây viêm màng não với chloramphenicol theo khả năng sinh enzym β-lactamase

  • Nhận xét: Biểu đồ 3.3 cho thấy nồng độ kháng sinh chloramphenicol ức chế tối thiểu đối với vi khuẩn Hib có β - lactamase (+) tăng gấp 16 lần so với nồng độ này ở vi khuẩn Hib không có β - lactamase.

  • Bảng 3.5: Tỷ lệ chủng Hib gây viêm màng nóo sinh enzym β-lactamase và khả năng đề kháng ampicillin

  • Ampicillin

  • -lactamase

  • Nhạy cảm

  • Đề kháng

  • Tổng

  • Số lượng

  • %

  • Số lượng

  • %

  • Số lượng

  • %

  • Dương tớnh (+)

  • 0

  • 100

  • 51

  • 0

  • 51

  • 50

  • Âm tớnh (-)

  • 51

  • 0

  • 0

  • 100

  • 51

  • 50

  • p

  • p < 0,05

  • 102

  • 100

  • Nhận xét: Bảng 3.5 cho thấy khả năng đề kháng ampicillin của Hib có liên quan với enzym β-lactamase (p < 0,05; Fisher’s exact test). Cụ thể, tất cả những chủng Hib gõy viêm màng nóo có enzym β-lactamase đều kháng ampicillin (BLPAR: Beta-lactamase producing ampicillin resistance) và những chủng không có enzym này đều nhạy cảm với ampicillin.

  • Bảng 3.6: Tỷ lệ chủng Hib gây viêm màng não sinh enzym β-lactamase và khả năng đề kháng chloramphenicol

  • Chloramphenicol

  • -lactamase

  • Nhạy cảm

  • Đề kháng

  • Tổng

  • Số lượng

  • %

  • Số lượng

  • %

  • Số lượng

  • %

  • Dương tớnh (+)

  • 5

  • 10

  • 46

  • 90

  • 51

  • 50

  • Âm tớnh (-)

  • 41

  • 80

  • 10

  • 10

  • 51

  • 50

  • p

  • p < 0,05

  • 102

  • 100

  • Nhận xét: Bảng 3.6 cho thấy hầu hết các chủng Hib kháng chloramphenicol thuộc loại có enzym β-lactamase, nghĩa là khả năng đề kháng chloramphenicol của vi khuẩn Hib gây viêm màng não có liên quan với khả năng sinh enzym β-lactamase của vi khuẩn này (p < 0,05; Chi-quare test).

  • 3.1.4. Kết quả xác định genotype của các chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo bằng kỹ thuật PFGE

  • Chú thích: Mỗi cột dọc (hình 3.1) là kết quả điện di phân tử ADN của một chủng vi khuẩn Hib (phõn lập từ bệnh phẩm của 01 bệnh nhi) đã được cắt thành cỏc phõn đoạn (band) bởi enzym giới hạn. Mỗi cột được đánh số theo mã số vi khuẩn, cột đầu và cuối bảng là thang ADN chuẩn (đó xác định kích thước phân tử).

  • Bảng 3.7: Phân loại kiểu gen theo tiêu chuẩn Tenover của 102 chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi mắc viêm màng nóo

  • Kiểu gen

  • (ký hiệu)

  • Số lượng (%)

  • Mối liên quan về ADN với chủng phổ biến

  • Ghi chú

  • A

  • 24 (23,5)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Phân lập từ năm 04 – 07

  • A1

  • 19 (18,6)

  • Có liên quan gần với A

  • (khác A từ 2 - 3 band)

  • Phân lập từ năm 01 - 03

  • A2

  • 6 (5,9)

  • Có thể có liên quan

  • (khác A từ 4 - 6 band)

  • Phân lập năm 04, 05, 07

  • B

  • 4 (3,9)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Phân lập năm 05, 06

  • B1

  • 10 (9,8)

  • Có liên quan gần với B

  • (khác B từ 2-3 band)

  • Phân lập năm 05, 06

  • B2

  • 7 (6,9)

  • Có thể có liên quan B

  • (khác B từ 4 - 6 band)

  • Phân lập năm 06, 07

  • C

  • 3 (2,9)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Phân lập năm 01

  • C1

  • 4 (4,9)

  • Có liên quan gần với C

  • (khác từ 2 - 3 band)

  • Phân lập năm 01, 02

  • C2

  • 15 (14,7)

  • Có thể có liên quan với C

  • (khác C từ 4 - 6 band)

  • Phân lập năm 01, 02, 03, 04

  • D

  • 4 (3,9)

  • Có liên quan gần với nhau

  • (khác nhau 2 - 3 band)

  • Phân lập năm 01, 02, 03

  • Không xếp loại (KXL)

  • 6 (5,9)

  • Có kiểu PFGE riêng lẻ và không có mối liên quan về ADN với nhau và các kiểu trên.

  • Phân lập năm 01, 02

  • Tổng

  • 102 (100%)

  • Biểu đồ 3.4: Phân bố tỷ lệ từng nhóm genotype của các chủng Hib phân lập được từ bệnh nhi viêm màng não

  • Nhận xét: Biểu đồ 3.4 cho thấy 102 chủng Hib được phân lập từ 102 bệnh nhi viêm màng não thuộc về 4 nhóm genotype chủ yếu (A, B, C và D) và một số lượng ít (5,9%) chủng Hib thuộc genotype không xếp loại. Trong đó, những chủng Hib trong cùng một nhóm genotype (kiểu gen) hoàn toàn giống nhau về gen hoặc có liên quan với nhau về gen và không có mối liên quan về gen với những chủng thuộc nhóm genotype khác. Cụ thể ở bảng 3.7:

  • - Đỏnh giá mối liên quan giữa đặc điểm phân loại biotype và khả năng sinh enzym β-lactamase

  • Bảng 3.8: Mối liên quan giữa biotype và khả năng sinh -lactamase của những chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi mắc viêm màng nóo

  • Nhận xét: Bảng 3.8 cho thấy những chủng Hib xếp cùng vào một biotype có thể có khả năng sinh -lactamase khác nhau. Cụ thể, biotype I có số chủng Hib sinh -lactamase là 70,6%; biotype II là 41,7% và các biotype khác có số lượng rất nhỏ nờn khụng thực hiện so sánh thống kê. Vì vậy, kết quả cho thấy đặc điểm phân bố theo biotype và khả năng sinh enzym -lactamase của các chủng Hib gây viêm màng não độc lập với nhau (p > 0,05).

  • - Đỏnh giá mối liên quan giữa đặc điểm phân loại genotype và khả năng sinh enzym β-lactamase của các chủng Hib gây viêm màng não

  • Bảng 3.9: Phân loại kiểu gen của những chủng Hib gây viêm màng não có enzym β-lactamase

  • Kiểu PFGE

  • Số lượng chủng (%)

  • Mức độ liên quan

  • A

  • 02 (3,9)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • A2

  • 06 (11,8)

  • Có thể có liên quan với A

  • B

  • 04 (7,85)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • B1

  • 10 (19,6)

  • Liên quan gần với B

  • B2

  • 07 (13,7)

  • Có thể có liên quan với B

  • C

  • 03 (5,9)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • C1

  • 4 (7,85)

  • Liên quan gần với C

  • C2

  • 15 (29,4)

  • Có thể có liên quan với C

  • Tổng

  • 51 (100%)

  • Nhận xét: Bảng 3.9 cho thấy những chủng Hib có enzym β-lactamase (+) thuộc 3 kiểu gen chính (A, B và C): kiểu A chỉ chiếm 3,9% (2 chủng); 6 chủng (11,8%) có thể có liên quan với A (A2); kiểu B chiếm 7,85% (4 chủng), 10 chủng (19,6%) liên quan gần B (B1), 7 chủng (13,7%) có thể có liên quan với B (B2); kiểu C chiếm 5,9% (3 chủng), 4 chủng (7,85%) liên quan gần với C (C1), 15 chủng (29,4%) có thể có liên quan với C (C2).

  • Bảng 3.10: Phân loại kiểu gen của những chủng Hib gây viêm màng não không có enzym β-lactamase

  • Kiểu PFGE

  • Số lượng chủng (%)

  • Mức độ liên quan

  • A

  • 22 (43,1)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • A1

  • 19 (37,2)

  • Liên quan gần với A

  • D

  • 04 (7,9)

  • Liên quan gần với nhau

  • KXL

  • (Không xếp loại)

  • 06 (11,8)

  • Không có liên quan với nhau và các genotype khác

  • Tổng

  • 51 (100%)

  • Nhận xét: Bảng 3.10 cho thấy 51 chủng Hib có enzym β- lactamase (-) gồm 2 genotype (kiểu gen) chính, đó là genotype A và A1 (liên quan gần với genotype A) chiếm đa số (43,1% và 37,2%); genotype D (gồm những chủng có liên quan gần với nhau) chiếm tỷ lệ thấp hơn (7,9%), những genotype riêng lẻ không xếp loại chiếm 11,8% (6 chủng).

  • - Đỏnh giá mối liên quan giữa đặc điểm phân loại biotype và nhúm genotype của các chủng Hib gây viêm màng não

  • Bảng 3.11: Mối liên quan giữa nhóm genotype và biotype của những chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi mắc viêm màng nóo

  • Nhóm genotype

  • Biotype

  • A

  • B

  • C

  • D

  • KXL

  • Tổng (%)

  • I

  • 1

  • 5

  • 7

  • 1

  • 3

  • 17 (16,7)

  • II

  • 42

  • 13

  • 11

  • 3

  • 3

  • 72 (70,6)

  • III

  • 6

  • 2

  • 1

  • 0

  • 0

  • 9 (8,8)

  • IV

  • 0

  • 1

  • 2

  • 0

  • 0

  • 3 (2,9)

  • V

  • 0

  • 0

  • 1

  • 0

  • 0

  • 1 (1,0)

  • Tổng (%)

  • 49 (48,0)

  • 21 (20,6)

  • 22 (22,6)

  • 4 (3,9)

  • 6 (5,9)

  • 102 (100)

  • p > 0,05 (Chi square test và Fisher test, so sánh từng cặp)

  • Nhận xét: Bảng 3.11 cho thấy các chủng Hib gây bệnh chủ yếu tập trung ở hai typ sinh học II (70,6%), I (16,7%) và có 3 kiểu gen chính là A (48,0%), B (20,6%) và C (22,6%); typ sinh học III chỉ chiếm 8,8%, hai typ IV và V rất ít (2,9 và 1,0%). Khi xác định mối liên quan, chúng tôi không tính nhúm khụng xếp loại (KXL) vì trong đó là những kiểu gen khác nhau và đơn lẻ không đặc trưng cho một nhóm nào. Sử dụng Chi-square test và Fisher-test để đánh giá sự liên quan giữa nhúm kiểu gen (genotype) và typ sinh học (biotype) bằng cách so sánh từng cặp. Kết quả cho thấy các nhúm kiểu gen (genotype) không có sự liên quan với typ sinh học (p > 0,05).

  • 3.2. Kết quả phân tích các chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh

  • 3.2.1. Đặc điểm các chủng vi khuẩn Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • - Đặc điểm trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi tham gia nghiên cứu:

  • Bảng 3.12: Đặc điểm trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi tại các nhà trẻ, mẫu giáo tham gia nghiên cứu

  • Đỏnh giá

  • Đặc điểm trẻ

  • Số lượng

  • Tỷ lệ (%)

  • p

  • Giới

  • Nam

  • > 0,05

  • Nữ

  • Địa danh phân lập

  • Thành phố

  • > 0,05

  • Nông thôn

  • Nhóm tuổi

  • > 0,05

  • Bảng 3.13: Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh được gửi tại các nhà trẻ, mẫu giáo có mang H.influenzae (Hi) nói chung và Hib nói riêng ở vùng mũi họng

  • Trẻ lành

  • Kết quả

  • Mang vi khuẩn Hi

  • Không mang vi khuẩn Hi

  • Tổng

  • Hib

  • Hi khác

  • Tổng Hi

  • Số lượng

  • 52

  • 41

  • 93

  • 119

  • 212

  • Tỷ lệ (%)

  • 24,5

  • 19,3

  • 43,8

  • 56,2

  • 100

  • Đỏnh giá

  • Đặc điểm trẻ

  • Số lượng

  • Tỷ lệ trẻ mang Hib (%)

  • p

  • Trẻ

  • Hib

  • Giới

  • Nam

  • > 0,05

  • Nữ

  • Địa danh phân lập

  • Hải Dương

  • > 0,05

  • Hà Tây (nay thuộc Hà Nội)

  • Thành phố

  • > 0,05

  • Nông thôn

  • Nhóm tuổi

  • > 0,05

  • Kết quả

  • Biotype

  • I

  • II

  • III

  • IV

  • V

  • Tổng

  • Số lượng

  • 14

  • 25

  • 5

  • 6

  • 2

  • 52

  • Tỷ lệ (%)

  • 26,9

  • 48,1

  • 9,6

  • 11,5

  • 3,8

  • 100

  • 3.2.3. Tỷ lệ chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi có sinh enzym β-lactamase và loại gen mó hoỏ

  • - Tỷ lệ các chủng Hib có khả năng sinh enzym -lactamase

  • Bảng 3.16: Khả năng sinh enzym -lactamase của những chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • p

  • Dương tớnh (+)

  • Chi-square test

  • (Test proportion: 0,5)

  • Âm tớnh (-)

  • Nhận xét: Kết quả cho thấy, tỷ lệ các chủng Hib phõn lập được từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi có khả năng sinh enzym β-lactamase là 46,2%. Vì vậy, tỷ lệ chủng Hib có khả năng sinh enzym β–lactamase không khác biệt có ý nghĩa thống kê với chủng Hib không có khả năng sinh enzym này (p > 0,05).

  • - Tỷ lệ từng loại gen mã hóa tổng hợp -lactamase của các chủng Hib

  • Bảng 3.17: Tỷ lệ từng loại gen mã húa tổng hợp enzym -lactamase của các chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • Gen đề kháng

  • p

  • TEM-1

  • 23

  • 95,8%

  • Chi-square test

  • (Test proportion: 0,5)

  • ROB-1

  • 1

  • 4,2%

  • Tổng

  • 24

  • 100

  • Nhận xét: Kết quả cho thấy, hầu hết gen quy định tổng hợp β-lactamase của các chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi là TEM-1 (95,8%) và gen ROB-1 chiếm tỷ lệ rất nhỏ (4,2%) (p < 0,05).

  • 3.2.4. Kết quả xác định mức độ nhạy cảm với một số loại kháng sinh thông dụng của các chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh

  • - Kết quả xác định mức độ nhạy cảm với một số loại kháng sinh thông dụng của các chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh

  • Bảng 3.18: Kết quả kháng sinh đồ của những chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh với một số loại kháng sinh thông dụng

  • Kháng sinh

  • Mức độ nhạy cảm (số lượng/%)

  • S (susceptible)

  • I (intermidiate)

  • R (resistant)

  • 27 (51,9%)

  • 0

  • 25 (48,1%)

  • 0

  • 0

  • 24 (100%)

  • 27/96,4%

  • 0

  • 1 (3,6%)

  • 51 (98,1%)

  • 0

  • 1 (1,9%)

  • 24 (100%)

  • 0

  • 0

  • 27 (96,4%)

  • 0

  • 1 (3,6%)

  • 52 (100%)

  • 0

  • 0

  • 52 (100%)

  • 0

  • 0

  • 52 (100%)

  • 0

  • 0

  • 52 (100%)

  • 0

  • 0

  • 28 (53,9%)

  • 1 (1,9%)

  • 23 (44,2%)

  • 2 (8,3%)

  • 1 (4,2%)

  • 21 (87,5%)

  • 26 (92,9%)

  • 0

  • 2 (7,1%)

  • 51 (98,1%)

  • 1 (1,9%)

  • 0

  • 51 (98,1%)

  • 1 (1,9%)

  • 0

  • 52 (100%)

  • 0

  • 0

  • Chú thích: S (susceptible)- vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh; I (intermidiate)- vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh ở mức trung gian; R (resistant)- vi khuẩn kháng kháng sinh.

  • Nhận xét: Tiến hành xác định mức độ nhạy cảm với 10 loại kháng sinh thông dụng (ampicillin, ampicillin/sulbactum, cefaclor, cefotaxim, ceftriaxon, cefpodoxime, chloramphenicol, clarithromycin, azithromycin, rifampicin) của 52 chủng vi khuẩn Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ, mẫu giáo bằng kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán (Kirby - Bauer); kết quả cho thấy: Một số kháng sinh như clarithromycin, azithromycin và rifampicin vẫn nhạy cảm cao (lần lượt 98,1%, 98,1% và 100%) với Hib. Không có chủng Hib kháng kháng sinh cephalosporin các thế hệ. Tuy nhiên, đối với kháng sinh ampicillin: 100% chủng Hib có β-lactamase (+) và 3,6% chủng Hib β-lactamase (-) đề kháng; đối với kháng sinh chloramphenicol: 87,5% chủng Hib có β-lactamase (+) và 7,1% chủng β-lactamase (-) đề kháng; chỉ có 3,6% chủng Hib có β-lactamase (-) kháng kháng sinh ampicillin/sulbactum.

  • Bảng 3.19: Tỷ lệ chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi sinh enzym β-lactamase và khả năng đề kháng ampicillin

  • Ampicillin

  • -lactamase

  • Nhạy cảm

  • Đề kháng

  • Tổng

  • Số lượng

  • %

  • Số lượng

  • %

  • Số lượng

  • %

  • Dương tớnh (+)

  • 0

  • 0

  • 24

  • 100

  • 24

  • 46,2

  • Âm tớnh (-)

  • 27

  • 96,4

  • 1

  • 3,6

  • 28

  • 53,8

  • p

  • < 0,05; Fisher’s exact test

  • 52

  • 100

  • Nhận xét: Kết quả cho thấy, tất cả những chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi có enzym β-lactamase đều kháng ampicillin (BLPAR: Beta-lactamase producing ampicillin resistance) và chỉ có một chủng không có enzym này đề kháng với ampicillin. Vì vậy, khả năng đề kháng ampicillin của Hib có liên quan chặt chẽ đến khả năng sinh β-lactamase (p < 0,05).

  • Bảng 3.20: Tỷ lệ những chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi sinh enzym β–lactamase và khả năng đề kháng chloramphenicol

  • Chloramphenicol

  • -lactamase

  • Nhạy cảm

  • Đề kháng

  • Tổng

  • Số lượng

  • %

  • Số lượng

  • %

  • Số lượng

  • %

  • Dương tớnh (+)

  • 3

  • 12,5

  • 21

  • 87,5

  • 24

  • 46,2

  • Âm tớnh (-)

  • 26

  • 92,9

  • 2

  • 7,1

  • 28

  • 53,8

  • p

  • < 0,05; Fisher’s exact test

  • 52

  • 100

  • Nhận xét: Kết quả bảng 3.20 cho thấy khả năng đề kháng kháng sinh chloramphenicol của các chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có liên quan với khả năng sinh enzym β-lactamase của vi khuẩn này (p < 0,05).

  • Hình ảnh 3.2: Kết quả phõn tớch bằng kỹ thuật PFGE của những chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh ở một số nhà trẻ, mẫu giáo được điều tra

  • Nhận xét: Trong tổng số 52 chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi của nghiên cứu được tiến hành phõn tích bằng kỹ thuật PFGE thu được 38 genotype. Điều này giải thích cho thấy những chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh được phõn bố rải rác vào nhiều genotype khác nhau và không tập trung vào các nhúm genotype nhất định.

  • Bảng 3.21: Phân bố tỷ lệ theo genotype của 52 chủng Hib phân lập được từ trẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi dựa trên tiêu chuẩn của Tenover

  • Kiểu gen

  • (ký hiệu)

  • Số lượng (%)

  • Mối liên quan về ADN với

  • chủng phổ biến

  • A’

  • 5 (9,6)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Giống nhau

  • A’1

  • 1 (1,9)

  • Có liên quan gần với A’

  • Giống A’

  • B’

  • 3 (5,8)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Giống nhau

  • B’1

  • 2 (3,8)

  • Giống nhau hoàn toàn và

  • có liên quan gần với B’

  • Giống nhau và giống B’

  • C’

  • 3 (5,8)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Giống nhau

  • C’1

  • 1 (1,9)

  • Có liên quan gần với C’

  • Giống C’

  • C’2

  • 1 (1,9)

  • Có thể có liên quan với C’

  • Giống C’

  • D’

  • 2 (3,8)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Giống nhau

  • E’

  • 3 (5,8)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Giống nhau

  • F’

  • 2 (3,8)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Giống nhau

  • G’

  • 2 (3,8)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • Khác nhau

  • H’

  • 2 (3,8)

  • Có liên quan gần với nhau

  • Giống nhau

  • I’

  • 2 (3,8)

  • Có liên quan gần với nhau

  • Giống nhau

  • J’

  • 3 (5,8)

  • Có liên quan gần với nhau

  • Khác nhau

  • Không xếp loại (KXL)

  • 20 (38,5)

  • Có kiểu PFGE riêng lẻ và không có mối liên quan về ADN với nhau và các kiểu trên.

  • Ở nhiều nhà trẻ, mẫu giáo khác nhau

  • Tổng

  • 52 (100%)

  • 3.2.6. Đỏnh giá mối liên quan giữa đặc điểm phân loại biotype, genotype, khả năng sinh enzym β-lactamase và mức độ đề kháng với kháng sinh của các chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh

  • 52 chủng Hib phõn lập được từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi, sau khi phõn tích các đặc điểm phân loại biotype, genotype, khả năng sinh β-lactamase và mức độ nhạy cảm với kháng sinh sẽ tiếp tục được đánh giá để tỡm mối liên quan giữa những đặc điểm này.

  • - Đỏnh giá mối tương quan giữa đặc điểm phân loại biotype và khả năng sinh enzym β-lactamase

  • Bảng 3.22: Mối liên quan giữa biotype và khả năng sinh -lactamase của những chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh

  • Nhận xét: Kết quả cho thấy những chủng Hib có cùng một biotype (typ sinh học) có thể có khả năng sinh -lactamase khác nhau. Cụ thể, biotype I có số chủng Hib sinh -lactamase là 50%; biotype II là 52% và các biotype khác có số lượng rất nhỏ nên không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, đặc điểm phõn bố biotype và khả năng sinh -lactamase của các chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh độc lập với nhau (p > 0,05; Chi-square test, Fisher’s exact test).

  • - Đỏnh giá mối tương quan giữa đặc điểm phân loại genotype và khả năng sinh enzym β-lactamase

  • Bảng 3.23: Phân loại genotype của các chủng Hib không sinh enzym β-lactamase phõn lập từ trẻ khỏe mạnh theo tiêu chuẩn Tenover

  • Kiểu gen

  • (ký hiệu)

  • Số lượng chủng (%)

  • Mức độ liên quan

  • A’

  • 2 (7,1)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • B’

  • 3 (10,7)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • B’1

  • 2 (7,1)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • C’

  • 3 (10,7)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • C’1

  • 1 (3,6)

  • Liên quan gần với C’

  • D’

  • 2 (7,1)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • G’

  • 1 (3,6)

  • H’

  • 2 (7,1)

  • Liờn quan gần với nhau

  • J’

  • 2 (7,1)

  • Liờn quan gần với nhau

  • KXL

  • (Không xếp loại)

  • 10 (35,7)

  • Không có liên quan với nhau và các genotype khác

  • Tổng

  • 28 (100)

  • Nhận xét: Kết quả cho thấy những chủng Hib không có khả năng sinh enzym β-lactamase nằm rải rác ở nhiều genotype khác nhau và không tập trung chủ yếu vào genotype nào.

  • Bảng 3.24: Phân loại genotype của các chủng Hib có khả năng sinh enzym β-lactamase phõn lập từ trẻ khỏe mạnh theo tiêu chuẩn Tenover

  • Kiểu gen

  • (ký hiệu)

  • Số lượng chủng (%)

  • Mức độ liên quan

  • A’

  • 3 (12,5)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • A’1

  • 1 (4,2)

  • Liên quan gần với A’

  • C’2

  • 1 (4,2)

  • Có thể có liờn quan với C’

  • E’

  • 3 (12,5)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • F’

  • 2 (8,3)

  • Giống nhau hoàn toàn

  • G’

  • 1 (4,2)

  • I’

  • 2 (8,3)

  • Liên quan gần với nhau

  • J’

  • 1 (4,2)

  • KXL

  • (Không xếp loại)

  • 10 (35,7)

  • Không có liên quan với nhau và các genotype khác

  • Tổng

  • 24 (100)

  • Nhận xét: Kết quả cho thấy, những chủng Hib có khả năng sinh enzym β-lactamase nằm rải rác ở nhiều genotype khác nhau.

  • Qua bảng 3.23, 3.24 cho thấy khả năng sinh enzym β-lactamase không có liên quan đến phõn loại theo genotype của các chủng Hib phõn lập được từ trẻ khỏe mạnh. Bởi vì, những chủng Hib được xếp vào trong cùng một genotype cũng có thể khác nhau về khả năng sinh enzym này.

  • - Đỏnh giá mối liên quan giữa phân loại biotype và genotype của các chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh

  • Bảng 3.25: Mối liên quan giữa nhóm genotype và biotype của các chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh

  • Nhóm genotype

  • Biotype

  • I

  • II

  • III

  • IV

  • V

  • Tổng (%)

  • A’

  • 5

  • 1

  • 6 (11,5)

  • B’

  • 5

  • 5 (9,6)

  • C’

  • 3

  • 2

  • 5 (9,6)

  • D’

  • 2

  • 2 (3,8)

  • E’

  • 1

  • 2

  • 3 (5,8)

  • F’

  • 2

  • 2 (3,8)

  • G’

  • 2

  • 2 (3,8)

  • H’

  • 1

  • 1

  • 2 (3,8)

  • I’

  • 1

  • 1

  • 2 (3,8)

  • J’

  • 1

  • 2

  • 3 (5,8)

  • KXL

  • 8

  • 5

  • 6

  • 1

  • 20 (38,5)

  • Tổng (%)

  • 14 (26,9)

  • 25 (48,1)

  • 5 (9,6)

  • 6 (11,5)

  • 2 (3,8)

  • 102 (100)

  • > 0,05 (Chi square test và Fisher’ exact test so sánh từng cặp)

  • Nhận xét: Các chủng Hib thuộc cùng một nhóm genotype có thể nằm trong nhiều biotype khác nhau. Sử dụng Chi-square test và Fisher-test để đỏnh giá mối liên quan giữa nhóm genotype và biotype bằng cách so sánh từng cặp, cho thấy cỏc nhúm genotype không có liên quan với biotype (p > 0,05).

  • 3.3. So sánh đặc điểm sinh học giữa các chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • 3.3.1. So sánh sự phân bố theo biotype của các chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • Bảng 3.26: So sánh tỷ lệ phân loại giữa các biotype gây bệnh chủ yếu[1] (I, II) và biotype khác (III, IV, V) của các chủng Hib phân lập từ trẻ bệnh và trẻ khỏe mạnh

  • Biểu đồ 3.6: Phân bố tỷ lệ giữa biotype gây bệnh chủ yếu (I, II) và biotype khác (III, IV, V) của các chủng Hib phân lập từ trẻ bệnh và trẻ khỏe mạnh.

  • Chú thích: [1]Biotype gây bệnh chủ yếu của H.influenzae được xác định là biotype I và II (theo nhiều nghiên cứu, cũng như y văn trên thế giới) [11], [62], [78], [98], [103].

  • Nhận xét: Kết quả bảng 3.26, biểu đồ 3.6 cho thấy tất cả những chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo và Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh đều có các biotype I, II, III, IV và V. Trong đó, tỷ lệ biotype I, II (gõy bệnh chủ yếu) giữa hai nhúm không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

  • 3.3.2. So sánh khả năng sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa β-lactamase các chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • - So sánh khả năng sinh enzym β-lactamase

  • Bảng 3.27: So sánh tỷ lệ sinh enzym β-lactamase của các chủng Hib phân lập từ trẻ bệnh và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh

  • Biểu đồ 3.7: So sánh tỷ lệ sinh enzym β-lactamase của các chủng Hib phân lập từ trẻ bệnh và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh

  • Nhận xét: Kết quả bảng 3.27, biểu đồ 3.7 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ sinh enzym β-lactamase của các chủng Hib phõn lập được từ trẻ bệnh và Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh (p > 0,05).

  • - So sánh đặc điểm gen mã hóa sinh enzym β-lactamase

  • Bảng 3.28: So sánh tỷ lệ các loại gen mã hóa enzym β-lactamase giữa những chủng Hib phân lập từ trẻ bệnh và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh

  • Biểu đồ 3.8: So sánh tỷ lệ các loại gen mã hóa enzym β-lactamase của các chủng Hib phân lập được từ trẻ bệnh và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh

  • Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.28, biểu đồ 3.8 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ từng loại gen quy định tổng hợp β-lactamase giữa các chủng Hib phân lập được từ trẻ bệnh và trẻ khỏe mạnh (p < 0,05).

  • 3.3.3. So sánh đặc điểm phân loại genotype của các chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • - So sánh mức độ tương đồng về ADN của các chủng Hib theo từng nguồn gốc phân lập (từ bệnh nhi viêm màng não và trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi)

  • Bảng 3.29: So sánh đặc điểm phân loại theo PFGE của các chủng Hib phân lập từ trẻ bệnh và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh

  • Biểu đồ 3.9: Tỷ lệ những chủng Hib phân loại được vào cỏc nhúm genotype khác nhau theo nguồn gốc phân lập

  • Chú thích: [2] Những chủng Hib có genotype giống hoặc có mối liên quan về gen với ít nhất một chủng khác; [3] những chủng Hib có genotype không giống và không có mối liên quan về gen với bất cứ một chủng nào khác.

  • Nhận xét: Kết quả cho thấy những chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não có kiểu gen tương đồng hơn so với những chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh (p < 0,05; Chi-square test). Hơn nữa, đặc điểm này còn thể hiện ở mức độ phân biệt giữa các chủng Hib gây bệnh bằng kỹ thuật PFGE với DI = 0,873 [mục 3.1.4], trong khi mức độ phân biệt giữa các chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh cao hơn là DI = 0,982 [mục 3.2.5].

  • - So sánh mức độ tương đồng về ADN giữa chủng Hib từ bệnh nhi viêm màng não và chủng Hib từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • Bảng 3.30: Tỷ lệ chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh có genotype giống hoặc mối liên quan về gen với chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi

  • Kết quả

  • Mối liên quan về ADN giữa chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh và Hib gây viêm màng não

  • Số lượng

  • %

  • 17

  • (Hà Tây)

  • 1

  • (KXL)

  • 1,9

  • Giống hoàn toàn một genotype thuộc nhóm B của chủng Hib gây viêm màng não

  • 15

  • (Hải Dương),

  • 32

  • (Hà Tây)

  • 2

  • (KXL)

  • 3,9

  • Chủng 15 và 32 có mối liên quan gần về gen lần lượt với genotype thuộc nhóm B và C của chủng Hib gây viêm màng não

  • Các chủng còn lại

  • 49

  • 94,2

  • Không có liên quan về gen đối với bất cứ chủng Hib gây viêm màng não

  • Tổng

  • 52

  • 100

  • Nhận xét: Bảng 3.30 cho thấy trong tổng số 52 chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh, chỉ có 01 (1,9%) chủng Hib có cùng genotype với 01 chủng Hib gây bệnh và 02 (3,9%) chủng Hib khác có mối liên quan gần với 02 chủng Hib gây bệnh. Hầu hết các chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh không có mối liên quan về gen đối với những chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não.

  • Chương 4

  • BÀN LUẬN

  • Nghiờn cứu của chúng tôi, sau khi phân tớch trên tổng số 102 chủng Hib phân lập từ dịch não tủy, kết quả cho thấy Hib gây viêm màng não nổi trội nhất là biotype II (70,6%), tiếp theo là typ I (16,7%) các typ còn lại: III, IV và V chiếm tỷ lệ ít hơn nhiều (lần lượt: 8,8%; 2,9% và 1,0%). Qua đây có thể thấy tỷ lệ phõn bố biotype của vi khuẩn Hib phõn lập được từ những bệnh nhi mắc viêm màng nóo khu vực phía Bắc Việt Nam khác với những nghiên cứu trước đây ở một số nước chõu Âu và chõu Mỹ. Đặc biệt, kết quả phân loại trong nghiên cứu này cho thấy biotype II chiếm tỷ lệ cao nhất giống như một nghiên cứu gần đõy tại thành phố Chengdu (Trung Quốc) về đặc điểm những chủng H.influenzae phõn lập từ bệnh nhi viêm phổi. Cụ thể, 273 chủng H.influenzae gõy viêm phổi sau khi phõn tích được phõn loại vào 8 biotype. Trong đó, hầu hết các chủng H.influenzae thuộc biotype I, II, và III lần lượt với tỷ lệ: 17,6%; 43,6%; và 22,7% [118].

  • Trong tổng số 52 chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi ở nghiên cứu của chúng tôi, cho thấy hầu hết chủng Hib thuộc typ II (48,1%), tiếp theo là typ I (26,9%). Trong đó, những typ cũn lại: III, IV và V chiếm tỷ lệ ít hơn (lần lượt: 9,6%; 11,5% và 3,8%). Kết quả xác định tỷ lệ phõn loại theo biotype cũng tương đồng với những chủng Hib gõy viêm màng nóo (đã được so sánh ở phần 3.3.1). Cụ thể, toàn bộ những chủng Hib gõy viêm màng nóo hoặc phõn lập được từ trẻ khỏe mạnh đều được phõn bố vào 5 biotype (I, II, III, IV và V), trong đó biotype II chiếm nhiều nhất, tiếp sau là biotype I và cũn lại là biotype III, IV, V chiếm tỷ lệ thấp hơn nhiều. Vì vậy, đánh giá kết quả phõn loại những chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh theo biotype của nghiên cứu này, chúng tôi cũng thấy phù hợp với một nghiên cứu tại bang Ribeirao Preto (Brazil) về tỷ lệ mang vi khuẩn H.influenzae ở trẻ dưới 3 tuổi được chăm sóc trong một số nhà trẻ; kết quả cho thấy tỷ lệ biotype của những chủng H.influenzae phõn lập được cao nhất là: typ II (36,5%), tiếp đó typ I (21,5%), typ V (18,2%) và typ III (16,1%) [72].

  • 4.1.3. So sánh tỷ lệ phõn loại theo biotype giữa những chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo và chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh

  • Sau khi xác định biotype của những chủng Hib gõy viêm màng nóo và những chủng Hib phõn lập được ở trẻ khỏe mạnh, chúng tôi tiến hành so sánh tỷ lệ phõn loại theo biotype giữa các chủng Hib theo hai nguồn gốc này. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ từng loại biotype giữa Hib gõy viêm màng nóo và Hib phõn lập được ở trẻ khỏe mạnh. Theo kết quả nghiên cứu và tìm hiểu, đánh giá những nghiên cứu tương tự trên thế giới, chúng tôi thấy tỷ lệ phân loại theo biotype của các chủng Hib gây viêm màng nóo hay phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có sự khác nhau giữa các quốc gia. Vì vậy, sự khác biệt này có thể nói mang tính chất địa lý [38], [72], [118].

  • 4.1.4. Đánh giá vai trò gây bệnh của các biotype vi khuẩn Hib

  • Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã đỏnh giá độc lực của vi khuẩn H.influenzae nói chung và Hib nói riêng. Cụ thể, nghiên cứu của Kimberly Martin và cộng sự đã đánh giá được vai trò độc lực của những chủng H.influenzae gây bệnh có chứa gen mã hóa enzym tryptophanase. Tác giả Kimberly Martin đã báo cáo có khoảng 94 - 100% những chủng H.influenzae gõy các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng, bao gồm viêm màng nóo đều có enzym tryptophanase [73]. Xem xét về khía cạnh độc lực này, đối với nghiờn cứu của chúng tôi những chủng Hib gây viêm màng nóo cho thấy biotype chủ yếu tập trung ở typ II (70,6%), typ I (16,7%), typ III (8,8%), typ IV (2,9%) và typ V (1,0%), tức là số chủng Hib gõy viêm màng nóo có khả năng sinh tryptophanase trong nghiên cứu này chiếm 88,3% (còn lại typ III, IV không có enzym tryptophanase chiếm 11,7%). Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Toshihiro Mitsuda tại Nhật Bản, Tamago tại Cuba và Casagrande tại Brazil cũng cho thấy phần lớn những chủng Hib gõy viêm màng nóo có tỷ lệ sinh enzym tryptophanase (93,3% - 99,2%) [27], [68], [113] phù hợp với nghiên cứu của tác giả Kimberly Martin cùng cộng sự [73]. Bên cạnh đó, đối với 52 chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh, chúng tôi thấy có 41 chủng (78,8%) có khả năng sinh sinh tryptophanase (thuộc biotype I, II và V). Vì vậy, theo Kimberly Martin và cộng sự thì đõy có thể là nguồn bệnh (reservoir) quan trọng trong cộng đồng.

  • Phương pháp phân loại H.influenzae theo biotype được dựa vào khả năng sinh enzym urease, ornithin decarboxylase và trytophanase của vi khuẩn này. Do vậy, tùy theo khả năng sản xuất những enzym này, chủng H.influenzae được phân loại vào nhiều biotype khác nhau. Nghiên cứu của Kimberly Martin đã khẳng định được vai trò độc lực của những chủng H.influenzae có liên quan đến enzym tryptophanase do đó xác định được vị trí và cấu trúc gen quy định enzym này nằm trên bản đồ gen của vi khuẩn Hib. Gen mó hoỏ tổng hợp tryptophanase của H.influenzae được ký hiệu là tna. Trong đó, gen tna nằm trong một cụm gen và cụm gen này cũng được xác định là một vùng tương ứng ở vị trí 61 phỳt trờn bản đồ gen của E. coli. Đõy là một vùng bảo tồn cao chứa một nhúm gen (pcm, surE, nlmD và rpoS) đóng vai trò giúp cho vi khuẩn có khả năng sống sót trong giai đoạn dừng tối đa của quá trình phát triển và bảo vệ vi khuẩn tồn tại được dưới những áp lực của các chất oxy hoá. Ngoài ra, cụm gen tna nằm giữa hai đoạn ADN có trình tự lặp lại nhau của một USS (uptake signal sequence) (hình 4.1). Do vậy, cụm gen tna có thể truyền giữa các vi khuẩn với nhau theo cơ chế của một transposon và làm thay đổi biotype của những chủng vi khuẩn H.influenzae nhận được gen này. Ngoài ra, vai trò độc lực của enzym urease cũng đã được nghiên cứu và đỏnh giá một cách rõ ràng ở nhiều loài vi khuẩn như: Proteus mirabilis, Helicobacter pylori và giống Yersinia [29], [40], [49], [62]. Cụ thể, một số nghiên cứu về sinh bệnh học của vi khuẩn cũng đã chứng minh sự xuất hiện của urease có vai trò làm thay đổi khả năng miễn dịch và làm tăng pH của môi trường tại vị trí nhiễm trùng của vi khuẩn. Enzym này có khả năng thủy phân urờ để tạo thành hợp chất amonia (NH3) và carbonic (CO2). Trong đó, NH3 làm kiềm hóa nước tiểu giúp cho Proteus dễ dàng gây bệnh và trung hòa dịch vị giúp cho Helicobacter pylori xâm nhập gây viêm dạ dày. Thêm vào đó, một số nghiên cứu khác cũng cho thấy amonia là một chất độc với cơ thể, chất này có tác dụng làm tổn thương mụ nờn tạo điều kiện cho vi khuẩn gây ra các nhiễm trùng xâm hại [29], [40], [49], [62].

  • 4.3.1. Đỏnh giá mức độ nhạy cảm với một số loại kháng sinh thông dụng của các chủng Hib gõy viêm màng nóo

  • - Kết quả xác định về nồng độ ức chế tối thiểu của các kháng sinh đối với các chủng Hib gây viêm màng não

  • Nồng độ (àg/ml) ức chế tối thiểu của ampicillin (MIC50 và MIC50) đối với Hib gõy viêm màng nóo theo nghiên cứu của chúng tôi (8àg/ml, 256àg/ml) cao hơn so với nghiên cứu của Đặng Đức Anh năm 2005 tại Việt Nam [3] về các chủng H.influenzae phõn lập từ dịch nóo tủy (1àg/ml, 8àg/ml) và nghiên cứu năm 2000 của Daniel F. Sahm về những chủng H.influenzae phõn lập tại một số nước chõu Âu và chõu Á [101]. Tuy nhiên, kết quả này tương tự với nghiên cứu của Tamargo tại Cuba [113].

  • Nồng độ (àg/ml) ức chế tối thiểu của ampicillin/sulbactum (MIC50 và MIC50) đối với Hib gõy viêm màng nóo thu được cao hơn so với H.influenzae phõn lập năm 2000 tại Nhật, Trung Quốc, Mỹ, Đức, Italy [104] nhưng tương tự tại Tõy Ban Nha, Pháp [101] và Cu Ba [113].

  • Nồng độ (àg/ml) ức chế tối thiểu của chloramphenicol (MIC50 và MIC50) đối với Hib gõy viêm màng nóo của chúng tôi (16àg/ml, 64àg/ml) cao hơn so với nghiên cứu của Đặng Đức Anh (8àg/ml, 16àg/ml) năm tại Việt nam 2005 [3], nhưng tương tự với nghiên cứu của Tamargo tại Cuba năm 2003 (2àg/ml, 64àg/ml) [113].

  • Đối với những kháng sinh cefaclor, cefotaxim, ceftriaxon, cefpodoxime và rifampicin có kết quả nồng độ ức chế tối thiểu tương tự với nghiên cứu của Đặng Đức Anh năm 2005 tại Việt nam [3], Tamargo tại Cuba năm 2003 [113] và Daniel F. Sahm năm 2000 tại một số nước chõu Á, chõu Âu [101].

  • Kháng sinh nhóm macrolide là azithromycin, clarithromycin và kháng sinh rifampicin có kết quả nồng độ ức chế tối thiểu đối với Hib gây bệnh của nghiên cứu này có kết quả cao hơn so với nghiên cứu của Đặng Đức Anh năm 2005 tại Việt nam [3] và Daniel F. Sahm năm 2000 tại Trung Quốc, Nhật, Anh, Đức, Tây Ban Nha, Pháp, Italy [101].

  • - Mức độ nhạy cảm và khả năng đề kháng kháng sinh của các chủng Hib gây viêm màng não

  • Kết quả đánh giá mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh thông dụng của 102 chủng Hib gây viêm màng nóo, cho thấy vi khuẩn này vẫn còn nhạy cảm tốt với một số loại kháng sinh nhóm cephalosporin (cefaclor, cefotaxim, ceftriaxon, cefpodoxime nhạy cảm 100%) và ampicillin/sulbactum tương tự như nghiên cứu của Trần Quốc Kham năm 2003 [15] và Đặng Đức Anh 2005 [3] ở trong nước và nghiên cứu của Daniel F. Sahm tại Trung Quốc, Nhật, Anh, Tõy Ban Nha, Italy [101]. Tuy nhiên, tỷ lệ mức độ nhạy cảm với những kháng sinh này ở nghiên cứu của chúng tôi cao hơn tại Pháp, Đức theo nghiên cứu của Daniel F. Sahm năm 2000 [101] và tại Iran [54]. Ngoài ra, kết quả này cũng tương tự một số nghiên cứu gần đây tại Mỹ, Canada, cho thấy hầu hết những nghiên cứu đều cho thấy những kháng sinh, như ampicilin/sulbactam, ceftriaxon, cefaclor, cefotaxim, cefpodoxim, meropenem, levofloxacin, rifampicin, azithromycin, clarithromycin vẫn được xem là những kháng sinh có độ nhạy cao (xấp xỉ 100%) với Hib [39], [106], [110], [113]. Mức độ nhạy cảm với nhóm macrolide trong nghiên cứu của chúng tôi (clarithromycin, azithromycin nhạy cảm 100%), rifampicin (nhạy cảm 100%) tương tự như nghiên cứu của Phan Lê Thanh Hương cùng cộng sự năm 2004 tại Việt Nam [10] và nghiên cứu của Daniel F. Sahm năm 2000 tại Anh, Đức; tuy nhiên kết quả này cao hơn với những chủng H. influenzae ở Trung Quốc, Nhật, Tõy Ban Nha, Pháp, Italy [101].

  • Bên cạnh đó, những chủng Hib gây viêm màng não chúng tôi phân lập được trong nghiên cứu này lại có tỷ lệ kháng cao với ampicillin và chloramphenicol, tương ứng: 50% và 54,9%. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu tại Việt Nam của Phan Lê Thanh Hương và cộng sự [10] cho thấy khả năng đề kháng của các chủng Hib gây viêm màng não với ampicillin (40,3%); với chloramphenicol (46,5%). Thêm vào đó, những nghiên cứu ở Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc hay nghiờn cứu của Haghiashteiani MT và cộng sự tại Iran năm 2008 về khả năng đề kháng kháng sinh của Hib gây viêm màng não ở trẻ dưới 5 tuổi cũng cho thấy vi khuẩn này đề kháng 42,1% đối với ampicillin; 36,8% đối với chloramphenicol [54], [68], [101]. Tại châu Mỹ, nghiờn cứu của Tarmago và cộng sự năm 2003 về khả năng đề kháng kháng sinh của 938 chủng Hib gây viêm màng não ở trẻ dưới 5 tuổi tại Cuba cho thấy vi khuẩn này đề kháng với ampicillin và chloramphenicol lần lượt là: 46,3% (tất cả các chủng đều có khả năng sinh enzym β-lactamase) và 44,0% [113] phù hợp với kết quả giám sát kháng sinh từ năm 1990 – 2000 tại nước này (sự gia tăng mức độ đề kháng tương ứng 40,7% - 54,8% đối với ampicillin; 40,1% - 51,6% đối với chloramphenicol). Ngoài ra, hiện nay nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy Hib ngày càng gia tăng đề kháng đối với hai loại kháng sinh ampicillin và chloramphenicol [102], đặc biệt tại các nước phát triển như Mỹ, Canada hay châu Âu hầu hết đều báo cáo cho thấy hai loại kháng sinh này bị Hib đề kháng nhiều nhất.

  • 4.3.2. Đỏnh giá mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh thông dụng của các chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh

  • Kết quả đánh giá mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh thông dụng của 52 chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh, cho thấy vi khuẩn này vẫn còn nhạy cảm tốt với một số loại kháng sinh như: nhóm cephalosporin (cefaclor, cefotaxim, ceftriaxon, cefpodoxime nhạy cảm 100%), nhóm macrolide (clarithromycin, azithromycin nhạy cảm 100%), rifampicin (nhạy cảm 100%) và ampicillin/sulbactum (97,1%). Trong đó, Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh kháng ampicillin và chloramphenicol tương ứng 48,1% và 44,2%. Chúng tôi thấy kết quả phõn tích những chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh trong nghiên cứu này cũng tương tự với với những chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo.

  • Vì vậy, những chủng Hib gây viêm màng nóo và Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi chúng tôi nghiên cứu đều nhạy cảm 100% với kháng sinh cefaclor, cefotaxim, ceftriaxon, cefpodoxime, clarithromycin, azithromycin và rifampicin; 97,1% - 98,1% ampicillin/sulbactum và đề kháng 40,7% - 54,8% đối với ampicillin; 40,1% - 51,6% đối với chloramphenicol cũng tương đồng với nhiều nghiờn cứu trên thế giới. Trong đó, hiện tượng một số chủng vi khuẩn Hib sinh hoặc không sinh enzym β-lactamase phõn lập được từ trẻ viêm màng nóo và trẻ khỏe mạnh kháng ampicillin và ampicillin/sulbactum đã làm chúng tôi lo ngại về cơ chế biến đổi cấu trúc PBP giúp Hib đề kháng được ampicillin. Đõy là cơ chế đề kháng có thể sẽ trở nên trầm trọng trong tương lai tại Việt Nam. Sở dĩ cơ chế biến đổi PBP của Hib cần được quan tõm vỡ cũng qua cơ chế này, Hib có thể kháng được amoxicillin-clavulanate hay cefuroxim [5], [6], [119].

  • 4.3.3. Đỏnh giá mối liên quan giữa enzym β-lactamase và mức độ đề kháng với một số kháng sinh thông dụng của các chủng Hib

  • Tỷ lệ những chủng H.influenzae BLNAR vẫn được đỏnh giá có tỷ lệ thấp trên toàn cầu, nhưng ở một số nước tỷ lệ các chủng H.influenzae loại này khá phổ biến. Điển hình, một nghiên cứu ở châu Âu với khoảng 1000 chủng được nghiên cứu từ năm 1997 đến 2000 đã cho thấy tỷ lệ H.influenzae loại BLNAR xấp xỉ 10%, trong đó ở Ba Lan và Anh xấp xỉ 20%. Ngoài ra, trong nghiên cứu này có thể cũng đã được đánh giá cao khi sử dụng MIC của amoxicillin (MIC ≥ 2àg/ml) hơn là sử dụng ampicillin để phân loại chủng H.influenzae BLNAR. Tuy nhiên, đáng chú ý nhất là tình trạng tại Nhật Bản, một số nghiên cứu đã báo cáo hầu hết 40% chủng Hib phân lập được và trên 50% chủng Hib gây viêm màng nóo thuộc loại BLNAR [119].

  • Kết quả của chúng tôi trong nghiên cứu này cho thấy tất cả những chủng Hib có enzym β-lactamase dương tớnh đều kháng ampicillin, trong khi duy nhất có một chủng có enzym β-lactamase õm tớnh đề kháng với ampicillin. Ngoài ra, chúng tôi cũng thấy khả năng sinh enzym β-lactamase của các chủng Hib có liên quan đến khả năng đề kháng với kháng sinh chloramphenicol. Cụ thể, những chủng Hib có enzym β-lactamase dương tính có tỷ lệ đề kháng cao hơn (90% đối với Hib gõy viêm màng nóo và 87,5% đối với Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh) so với những chủng không có enzym này (20% đối với Hib gõy viêm màng nóo và 7,1% đối với Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh). Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Tamargo tại Cuba năm 2003, cho thấy những chủng Hib gõy viêm màng nóo có enzym β-lactamase dương tính 100% đề kháng với ampicillin và 90,8% đề kháng với chloramphenicol [113]. Khả năng đề kháng chloramphenicol của H.influenzae đã được xác định có liên quan đến sự sản xuất enzym chloramphenicol acetyltransferase (CAT) mã hóa bởi gen Cat nằm trên plasmid, có tác dụng ngăn cản kháng sinh này ngấm vào tế bào vi khuẩn để tác dụng lên ribosome. Gen Cat được mang trên plasmid tiếp hợp (conjugative plasmid) có trọng lượng phân tử khoảng 34 ì 106 – 46 ì 106, và plasmid này cũng thường mang gen mã hóa tính chất đề kháng tetracyclin, ampicillin [119]. Vì vậy, những chủng BLPAR có thể chứa cả gen đề kháng ampicillin và chloramphenicol nằm trên plasmid có khả năng di truyền giữa các tế bào vi khuẩn (transferable plasmid) dẫn đến sự lan truyền gen đa kháng (multiple drug resistance) [10], [113], [114].

  • 4.5. So sánh đặc điểm sinh học giữa chủng Hib gây viêm màng não và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi

  • Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy phõn bố tỷ lệ của các chủng Hib gây viêm màng nóo và Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi theo biotype, khả năng sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym β-lactamase và mức độ nhạy cảm với kháng sinh không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, phõn bố của các chủng Hib theo genotype hầu hết có sự khác nhau giữa chủng phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo và chủng phõn lập từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi; chỉ có 01 chủng Hib (không xếp loại) và 02 chủng (không xếp loại) phõn lập từ trẻ khỏe mạnh lần lượt: có cùng genotype với 01 chủng gõy viêm màng nóo và có mối liên quan gần về gen với 02 chủng gõy viêm màng nóo. Vì vậy, nếu chỉ đánh giá về đặc điểm biotype, khả năng sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym β-lactamase, mức độ nhạy cảm với kháng sinh thì giữa Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo và Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh không có sự khác nhau. Sự khác nhau giữa các chủng Hib phõn lập từ hai nguồn gốc này thể hiện ở phõn bố genotype. Điều này có thể minh chứng cho thấy để gõy bệnh viêm màng nóo, những chủng Hib không chỉ phụ thuộc vào đặc điểm biotype, serotype mà có thể cũn phải cần nhiều đến các yếu tố độc lực khác [50].

  • KẾT LUẬN

  • 4.1. Tỷ lệ từng loại biotype của các chủng Hib phân lập được từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), chủ yếu tập trung ở biotype II (lần lượt là: 70,6%; 48,1%) và biotype I (lần lượt là: 16,7%; 26,9%), các biotype khác (III, IV, V) chiếm tỷ lệ không đáng kể.

  • 4.2. Tỷ lệ chủng Hib có khả năng sinh enzym β-lactamase phân lập được từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (lần lượt là: 50,0%; 46,2%); gen mã hóa enzym này chủ yếu là TEM-1 (lần lượt là: 98,0%; 95,8%), ROB-1 chiếm tỷ lệ không đáng kể (lần lượt là: 2,0%; 4,2%).

  • 4.3. Kết quả xác định mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh của Hib:

  • - Những chủng Hib phân lập được vẫn nhạy cảm tốt với một số loại kháng sinh: cephalosporin thế hệ 3, clarithromycin, azithromycin, rifampicin (100%) và ampicillin/sulbuctam (97,1% đối với Hib gõy viêm màng não; 98,1% với chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh).

  • - Hib phân lập được đề kháng nhiều nhất đối với kháng sinh ampicillin (50,0% đối với Hib gây viêm màng nóo và 48,1% đối với Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) và choloramphenicol (54,9% đối với Hib gây viêm màng não và 44,2% đối với Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh). Khả năng đề kháng hai loại kháng sinh này có liên quan với khả năng sinh enzym β-lactamase của Hib.

  • 4.4. Phõn bố genotype (theo kỹ thuật PFGE) của Hib gõy viêm màng não có tớnh tập trung vào 3 nhúm genotype chính, chủng Hib phõn lập được từ trẻ khỏe mạnh có genotype tản mạn vào nhiều gentype khác nhau. Trong đó, 1,9% (01) chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có chung genotype với 01 chủng Hib gõy viêm màng não và 3,9% (02) chủng Hib khác phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype liên quan gần về gen với genotype của 02 chủng Hib khác gõy viêm màng não.

  • 4.5. Giữa các chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng não và trẻ khỏe mạnh không có sự khác biệt về đặc điểm phõn loại biotype, khả năng sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym này và mức độ nhạy cảm với kháng sinh. Tuy nhiên, giữa các chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng não và trẻ khỏe mạnh có sự khác biệt với nhau về phõn loại theo genotype.

  • 4.6. Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi tại một số nhà trẻ, mẫu giáo điều tra mang Hib chiếm 24,5%. Tỷ lệ này không có liên quan đến giới, nhóm tuổi của trẻ cũng như điều kiện nhà trẻ, mẫu giáo (thành thị hay nông thôn).

  • KIẾN NGHỊ

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan