TÀI LIỆU TRẮC NGHIỆM, BÀI GIẢNG PPT CÁC MÔN CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT CÓ TẠI “TÀI LIỆU NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT” ;https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC). DÀNH CHO SINH VIÊN CÁC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC VÀ CÁC TRƯỜNG KHÁC, GIÚP SINH VIÊN HỆ THỐNG, ÔN TẬP VÀ HỌC TỐT KHI HỌC TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC)
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Giống vi khuẩn Haemophilus loại vi khuẩn ký sinh đường hô hấp người số loài động vật Loài H influenzae nguyên số bệnh nhiễm trùng người (có thể từ viêm đường hơ hấp viêm màng não) H.influenzae typ b (Hib) giới xác định nguyên chớnh gõy viờm màng não vi khuẩn, đặc biệt trẻ em tuổi [24], [89] Tại nước phát triển khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, châu Úc hầu hết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mang Hib họng cao trẻ nhỏ, đặc biệt trẻ chăm sóc trung tâm giữ trẻ ban ngày mang Hib đến 15% [52], [69] Bên cạnh đó, Hib đánh giá nguyên nhân hàng đầu gõy cỏc bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ viêm màng não, viêm phổi để lại di chứng tỷ lệ tử vong cao (khoảng 10%) Gánh nặng bệnh tật Hib giảm đáng kể nhờ có vacxin phòng bệnh nước [89] Tuy nhiên, số nước giới sau đánh giá trình thực phịng bệnh Hib vacxin cho thấy tỷ lệ thất bại vacxin không nhỏ Xuất phát từ vấn đề này, có nhiều nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử (phổ biến sử dụng kỹ thuật PFGE) Hib tiến hành để đỏnh giá dịch tễ học phân tử vi khuẩn dựa nghiên cứu so sánh với đặc điểm chủng Hib phõn lập từ người khỏe mạnh người tiếp xúc mang vi khuẩn [82], [100], [105], [111], [112] Tại Việt Nam, số nghiên cứu đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn H influenzae nói chung [1] Hib nói riêng [7], tỷ lệ mắc viêm màng nóo H.influenzae (chưa có điều kiện xác định typ huyết thanh) trẻ tuổi [6], [22] Cho thấy tỷ lệ trẻ tuổi mang H.influenzae chiếm khoảng 21,4% - 35,5% [8], Hib chiếm khoảng 15,0% - 17,5% [7] H.influenzae nguyên hàng đầu gây viêm màng nóo (50 - 60% trường hợp viêm màng nóo xác định vi khuẩn) trẻ nhỏ [6] Từ năm 1994 đến 2004, số nghiên cứu Ngô Thị Thi, Phan Lê Thanh Hương cộng đưa tỷ lệ viêm màng nóo Hib trẻ tuổi Hà Nội số tỉnh phớa Bắc [11], tìm hiểu phân bố theo biotype, genotype (phân loại PFGE) gen mã hóa tổng hợp enzym lactamase Hib phân lập từ trẻ viêm màng não tuổi thực [10] Tuy nhiên, số lượng chủng Hib sử dụng nghiên cứu hạn chế chưa có so sánh với chủng Hib phõn lập trẻ khỏe mạnh Vì vậy, để góp phần tìm hiểu nguồn gốc, đặc điểm sinh học phân tử chủng Hib gõy viêm màng não cho trẻ tuổi trẻ khỏe mạnh lứa tuổi mẫu giáo có mang Hib Chúng tơi thực đề tài: “Đặc điểm sinh học phân tử Haemophilus influenzae typ b phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh nhà trẻ, mẫu giáo”, nhằm thực mục tiêu: Xác định biotype, genotype, khả sinh enzym -lactamase mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo tuổi Xác định tỷ lệ, biotype, genotype, khả sinh enzym -lactamase mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo So sánh đặc điểm sinh học Hib gây viêm màng não trẻ tuổi với Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Haemophilus influenzae typ b (Hib) 1.1.1 Haemophilus influenzae: lịch sử tên gọi Haemophilus influenzae (H.influenzae) phân lập lần Richard Pfeiffer từ đờm bệnh nhân bị viêm phổi đại dịch cúm năm 1890 Lúc đó, vi khuẩn hiểu lầm nguyên nhân gây bệnh cúm nên gọi trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria) Mãi đại dịch cúm xảy năm 1918-1919, người ta biết H.influenzae thành viên hệ vi khuẩn ký sinh đường hô hấp lúc gây bệnh Năm 1933, phát virus cúm nguyên bệnh cúm, vai trò H.influenzae làm sáng tỏ: virus cúm gây bệnh cúm, H.influenzae vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau tế bào đường hô hấp bị tổn thương nặng virus cúm Xuất phát từ yếu tố lịch sử có liên quan đến bệnh cúm (influenzae: bệnh cúm) nhu cầu đòi hỏi yếu tố phát triển có mặt máu (Haemophilus: ưa mỏu) nờn vi khuẩn có tên gọi H.influenzae [19], [43], [89] 1.1.2 Đặc điểm sinh học H.influenzae typ b (Hib) 1.1.2.1 Hình thể cấu trúc [19], [89] H influenzae lồi vi khuẩn nhỏ nhất, cịn gọi cầu trực khuẩn vi khuẩn có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5m) uốn cong hai đầu trơng hình cầu Tuy nhiên chúng dịch não tuỷ, hình thể H influenzae kéo dài gấp vài lần so với chiều dài thơng thường (Hình 1.1) H influenzae bắt màu Gram õm, khơng di động khơng hình thành nha bào Thành tế bào vi khuẩn có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự thành vi khuẩn Gram õm khác Tuy nhiên, H influenzae phân loại thành nhóm: loại khơng vỏ polysaccharide (non-typeable khụng xác định typ huyết thanh) loại có vỏ (typeable xác định typ huyết thanh) Loài H influenzae có vỏ bọc phân loại tiếp tục theo typ huyết (serotype) từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên vỏ polysaccharide gen qui định [19], [43], [89] Vỏ bọc typ b dạng trùng hợp ribose, ribitol phosphate, gọi polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP) Những polysaccharide bề mặt có liên quan chặt chẽ với độc lực vi khuẩn, đặc biệt H influenzae typ b (Hib), nguyên nhân nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm viêm màng nóo (chiếm 90% ca nhiễm khuẩn xõm hại Hib) Bạch cầu đa nhân Hib Hình 1.1 Hình thể Hib tiêu nhuộm Gram dịch não tuỷ kính hiển vi quang học (độ phóng đại ì 1000) [99] Trên thực tế, nhuộm Gram bệnh phẩm dịch nóo tủy mà vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái nhiều bạch cầu đa nhõn đõy dấu hiệu quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm màng nóo H influenzae [89] 1.1.2.2 Sức đề kháng [127] H influenzae loại vi khuẩn chịu đựng với yếu tố ngoại cảnh Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, để khô lạnh giá Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn cách dễ dàng Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đốn vi khuẩn nên vận chuyển phịng thí nghiệm vịng giờ, khơng q nhiệt độ phịng thí nghiệm (24 - 28oC) Nếu tăm bệnh phẩm phải giữ môi trường vận chuyển (mơi trường bảo quản), giữ nhiệt độ - oC tối đa 24 môi trường 1.1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy [19] Điều kiện nuôi cấy: H influenzae loại vi khuẩn khó ni cấy Chỳng khụng mọc trờn cỏc mụi trường nuôi cấy thông thường, mọc môi trường có sẵn hai yếu tố X V Yếu tố X có lẽ khơng phải chất túy mà hỗn hợp chất có chứa sắt (như hemin hematin) H influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp số enzym catalase, peroxidase cytochrom hệ thống vận chuyển điện tử Máu sản phẩm máu, kể hemin nguồn nguyên liệu truyền thống sử dụng để sản xuất yếu tố X Thạch máu (5%) có khả cung cấp đủ lượng yếu tố X mà H influenzae cần thiết phát triển Khi dùng hematin tinh chế nồng độ cần thiết 0,1 - 1,0 g/ml Yếu tố V NAD NADP có mặt máu, phần chúng nằm bên tế bào Mặt khác, máu nhiều loài động vật có enzym NADase có tác dụng phõn hủy NAD, nên máu tươi khơng có NAD dạng tự Thạch chocolate, NAD giải phóng khỏi tế bào enzym NADase bị nhiệt phá huỷ Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết 0,2 - 1,0 g/ml H influenzae hiếu khí, địi hỏi mơi trường ni cấy có CO (2 - 5%) phân lập Mọc tốt trờn mụi trường chocolate Levinthal nhiệt độ khoảng 23 - 390C, tối ưu 370C Không mọc thạch máu cừu; mọc trờn cỏc loại thạch mỏu khỏc (ví dụ máu thỏ) thỡ khụng gõy tan máu khuẩn lạc nhỏ nhiều so với chocolate cựng cỏc điều kiện nuôi cấy Cũng thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc H influenzae mọc xung quanh khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm to, vùng xa khuẩn lạc khơng mọc, bé Hiện tượng gọi tượng “vệ tinh” (satellitism), khả tiết yếu tố V vi khuẩn bội nhiễm giúp H influenzae phát triển thạch mỏu thụng thường Hình 1.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc H influenzae mọc xung quanh khuẩn lạc S aureus trờn môi trường thạch máu thỏ Môi trường nuôi cấy đặc điểm khuẩn lạc: Để ni cấy H influenzae, có loại mơi trường được sử dụng [19], [43], [89], [127]: - Thạch chocolate có khơng có 300g bacitracin/ml mơi trường (có tác dụng ức chế số vi khuẩn khác, đặc biệt liên cầu) để phõn lập H.influenzae Đõy loại môi trường thường sử dụng nuôi cấy phõn lập vi khuẩn - Thạch máu thỏ tươi 7% thạch Levinthal Sau nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm khí trường 5% CO2 (nếu khơng có tủ ấm CO2, mơi trường ni cấy đặt chuông thủy tinh đốt nến chuông Sau nến tắt, khí trường bên chng - 5% CO 2) 37oC thời gian 18 - 24 Hình 1.3: Khuẩn lạc H influenzae mọc trờn mụi trường chocolate Sau 16 - 18 nuôi cấy, H influenzae phát triển thành khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ - 2mm khụng gõy tan huyết Vi khuẩn Hib ln có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh ánh sáng chiếu vào có đường kính lớn Ngồi ra, mơi trường ni cấy vi khuẩn thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol) Sau 24 - 48 giờ, trạng thái vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải tính chất bắt màu Gram thay đổi Trên môi trường lỏng, H influenzae thường phát triển làm đục mơi trường Tình trạng vỏ xảy sớm mơi trường thạch, muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm ni cấy thích hợp (18 giờ) Tính chất sinh hóa đặc trưng H influenzae: Tính chất sinh hóa đặc trưng H influenzae nhu cầu đòi hỏi bắt buộc yếu tố phát triển X V môi trường ni cấy Tính chất xác định thử nghiệm XV thử nghiệm "vệ tinh" [19], [127]: (1) (2) Hình 1.4: Thử nghiệm với khoanh giấy X, V XV (1); thử nghiệm "vệ tinh" (2), cho thấy H influenzae đòi hỏi bắt buộc phải có yếu tố X V cho phát triển H influenzae phân biệt với loại Heamophilus khác đặc điểm sau đây: Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học để phân biệt H influenzae với Haemophilus khác [127] Tính chất Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO2 Loài H influenzae + + + H parainfluenzae + H hemolyticus + + + H parahemolyticus + + ± H aphrophilus + + H paraphrophilus + + 1.1.3 Đặc điểm phân loại theo typ huyết (serotype) typ sinh học (biotype) H influenzae 1.1.3.1 Đặc điểm phân loại H influenzae theo typ huyết [19], [43], [89] Năm 1930, H influenzae xác định thành nhúm chớnh, lồi khơng vỏ (khụng xỏc typ huyết - non typeable) lồi có vỏ (xác định typ huyết - typeable) Dựa tính đặc hiệu kháng nguyên vỏ polysaccharide, vi khuẩn H influenzae có vỏ chia thành typ huyết từ a đến f Theo hầu hết nghiên cứu cho thấy vi khuẩn H influenzae gây bệnh thuộc loại có vỏ, nhiều H influenzae typ b 1.1.3.2 Đặc điểm phân loại H influenzae theo typ sinh học (biotype) Bảng 1.2: Phân loại H influenzae theo typ sinh học Killian [43] Biotype Các tính chất hố học Test Urease Test Indol Ornithin decarboxylase (ODC) I + + + II + + - III + - - IV + - + V - + + VI - - + VII - + - VIII - - - Kilian đưa phương pháp sử dụng số thử nghiệm sinh hoá để xác định biotype đặc điểm sinh học loài Haemophilus dựa kết thử nghiệm: tìm khả sinh indol, hoạt động hai enzym urease decarboxylase vi khuẩn Trước đây, Kilian nghiên cứu chia H influenzae thành biotype từ I đến IV Những biotype độc lập với typ huyết vi khuẩn đó, chủng khơng có vỏ cho kết tương tự với ba phản ứng sinh hoá Sau này, với thử nghiệm tương tự, Kilian bổ sung thêm biotype từ V đến VIII Vì vậy, H influenzae chia làm typ theo tiêu chuẩn Killian [43] 1.1.4 Miễn dịch [28], [89] 10 Kháng thể (Kháng kháng nguyên thân) Kháng nguyên thân (LPS protein màng ngoài) Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate) Kháng thể (Kháng kháng nguyên vỏ) Đại thực bào Đại thực bào Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vỏ kháng nguyên thân [89] Miễn dịch tự nhiên thể Hib đa dạng, bao gồm hợp tác phức tạp nhiều thành phần hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố miễn dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa q trình hoạt hóa phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả thực bào, diệt vi khuẩn đại thực bào tế bào đa nhân, 5) Chức miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T Trong khó đánh giá rạch rịi chế miễn dịch quan trong chế bảo vệ thể vật chủ Tuy nhiên, hầu hết cá thể có khả miễn dịch bảo vệ năm đầu đời mà không mắc bệnh nhiễm khuẩn Hib lan tràn Khả 124 chủng Hib phân lập từ nghiên cứu Sau đỏnh giá tương đồng mẫu ADN chủng vi khuẩn dựa vào băng (band) ADN điện di đồ đưa mối liên quan chủng vi khuẩn Hib phân lập mức độ khác nhau: phân biệt (indistinguishable) hay xếp vào nguồn gốc, có mối liên quan gần (closely related), có liên quan (possibly related) khác hồn tồn (different) Vì vậy, đõy kỹ thuật hữu ích nghiên cứu xác định nguồn gốc chủng vi khuẩn gây bệnh [10], [12], [122], [123] - Tại Việt Nam, dựa vào phương pháp PFGE, Phan Lê Thanh Hương cộng có nghiên cứu xác định Hib gõy viêm màng nóo với nguồn lây mang tính gia đình [10] - Trên giới, điển hình Nhật Bản Hiroshi Wantanabe cộng cho thấy có lây truyền chủng H.influenzae không định typ huyết (non-typeable) đề khỏng ampicillin-khụng sản xuất βlactamase trẻ em bố mẹ chúng dựa nghiên cứu 15 gia đình [122] Bên cạnh đó, Saito cộng cho thấy lan truyền Hib từ trẻ mắc viêm màng nóo vi khuẩn sang cho người chăm sóc chưa tiêm vacxin với tỷ lệ cao [103] Ngồi ra, với mục đích này, số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PFGE để đỏnh giá khác biệt đặc điểm ADN chủng H.influenzae phân lập từ nguồn gốc khác Cụ thể, nghiên cứu Patricia Ezekiel Moor cộng đánh giá khác cấu trúc ADN chủng Hib phân lập từ thổ dân đối tượng thổ dân Úc [82] 4.4.1.3 Sử dụng nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng H.influenzae gây bệnh nhiễm trùng PFGE kỹ thuật đỏnh giá cơng cụ hữu ích áp dụng nghiên cứu dịch tễ học phân tử loài vi khuẩn [107], [115], [116] Đối 125 với vi khuẩn H.influenzae, có nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử nhiều khía cạnh khác Cụ thể, nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng H.influenzae phân lập từ vùng hầu họng trẻ khoẻ mạnh nhà trẻ trại trẻ mồ côi [90], chủng H.influenzae đề kháng ampicillin không sinh enzym β-lactamase [48] hay chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo [79] Tất nghiên cứu dựa sở phân loại genotype H.influenzae theo kỹ thuật PFGE kết hợp với đặc điểm đối tượng địa điểm nghiên cứu để đỏnh giá mặt dịch tễ học [48], [79], [100] 4.4.2 Tỷ lệ phân bố genotype chủng Hib gõy viêm màng nóo 102 chủng Hib chúng tơi phõn lập từ bệnh nhi mắc viêm màng nóo nhiều vùng khác thuộc khu vực miền Bắc thăm khám điều trị bệnh viện Nhi Trung ương Do đó, chủng Hib nghiên cứu xác định có nguồn gốc khác địa lý Tuy nhiên, kết phân tích kỹ thuật PFGE cho thấy hầu hết chủng vi khuẩn phõn bố vào ba nhóm genotype chớnh, A (48,4%), B (20,1%), C (21,7%) chủng riêng lẻ không xếp loại chiếm 5,9% Tương tự, nghiên cứu Anna Skoczyn´ska đặc điểm vi khuẩn Hib gây viêm màng nóo Ba Lan thu 233 chủng Hib từ 64 trung tâm, đại diện cho Ba Lan vòng năm (1997 - 2004) Những chủng vi khuẩn này, sau phân tích kỹ thuật PFGE cho thấy chủng Hib gây viêm màng nóo tập trung chủ yếu vào nhóm genotype A (97,4%) số genotype riêng lẻ B, C, D, E, F[4] (chỉ chiếm 2,6%) [108] Điều gợi ý cho thấy chủng Hib gõy viêm màng nóo ln tập trung vào vài nhúm genotype định cho dù có phõn lập nhiều vùng khác Yếu tố thời gian phõn lập Hib đánh giá nghiên cứu Kết cho thấy thời gian phõn lập không ảnh hưởng nhiều 126 đến biến đổi genotype chủng vi khuẩn Hib: chủng kiểu A phân lập vào thời gian từ 2004 đến 2007 có liên quan gần với chủng phân lập khoảng thời gian từ 2001 - 2003, có liên quan (liên quan xa) với kiểu A2 thời gian phân lập chủng Hib thuộc kiểu A A2 (2004-2007) Có lẽ, kiểu A2 gồm chủng có khả sinh -lactamase kiểu A A1 khơng có khả sinh enzym Như vậy, thời gian năm, chủng vi khuẩn Hib gây bệnh có biến đổi chút gen không nhiều, chúng luụn cú mối liên quan gần với Hiện tượng khác từ - band (liên quan xa hay có liên quan) lại xảy chủng khác khả sinh enzym -lactamase, nghĩ đến việc số chủng Hib nhận thêm đoạn gen sinh -lactamase theo chế transposon [23], [119] cú thêm phân đoạn plasmid mang gen quy định tổng hợp -lactamase nên làm biến đổi kiểu gen vi khuẩn Hib Bởi vì, tượng xảy làm thay đổi vị trí cắt enzym giới hạn SmaI Hầu hết nghiên cứu đỏnh giá khả gây bệnh Hib xác định số yếu tố độc lực vi khuẩn Yếu tố độc lực phần lớn dựa vào cấu trúc vỏ polysaccharide vi khuẩn typ sinh học (biotype) Trong đó, typ huyết b typ sinh học I, II đóng vai trị gây bệnh chủ yếu Tuy nhiên, số nghiên cứu xác định sâu vai trị độc lực Hib Những yếu tố độc lực khác phải kể đến như: yếu tố bám (pili), khả sống sót môi trường thể với chất dinh dưỡng đặc trưng khả xâm nhập vào tế bào Cụ thể, gen có vai trị độc lực H.influenzae bao gồm: vùng gen Cap mã hóa vỏ polysaccharide, nhóm gen hif mã hóa yếu tố bám pili, nhóm gen hmw1 hmw2 mã hóa yếu tố bỏm cú trọng lượng phân tử lớn nhóm gen quy tổng hợp enzym tryptophanase Vì vậy, chủng Hib gây bệnh 127 quan thường có tương đồng gen độc lực, dẫn đến kết cho thấy chủng Hib gây viêm màng não với kiểu genotype có tính tập trung vào số ớt nhúm genotype định (trong genotype nhóm có liên quan với giống hồn tồn gen) phù hợp với khoa học [60], [61] Ngồi ra, kết luận khu vực nghiên cứu (các tỉnh miền Bắc Việt Nam), chủng Hib tồn luân chuyển cộng đồng Chú thích: [4] Genotype A, B, C quy ước đặt cho phân loại PFGE nghiên cứu Vì vậy, genotype A B nghiên cứu khác với genotype A B nghiên cứu khác) 4.4.3 Phân bố tỷ lệ genotype chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo Phân tích 52 chủng Hib chúng tơi phõn lập trẻ khỏe mạnh tuổi nghiên cứu kỹ thuật PFGE thu 36 genotype Kết đồng nghĩa với chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh phân bố vào rải rác vào nhiều genotype khác không tập trung vào cỏc nhúm genotype định Trên giới, nhiều nghiên cứu cho thấy H.influenzae nói chung Hib nói riêng phõn lập từ nguồn khác thường có khác biệt ADN Cụ thể với nghiên cứu Henri Dabernat năm 2003 dịch tễ học phõn tử H.influenzae phõn lập từ trẻ chăm sóc nhà trẻ nước Pháp, với 663 chủng H.influenzae sau phõn tích kỹ thuật PFGE cho 366 genotype; đó, hầu hết chủng H.influenzae phõn lập nằm rải rác vào nhiều genotype khác khơng tập trung vào nhóm định [41] Tương tự, nghiên cứu khác Saito cộng Nhật Bản năm 1999 178 chủng H.influenzae phõn lập khơng có liên quan mặt dịch tễ học kỹ thuật PFGE, sau phõn tích thu 165 genotype khác 128 [103] Vì vậy, thấy khác biệt chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo với chủng Hib phõn lập từ họng trẻ khỏe mạnh hay chủng có liên quan dịch tễ học Đó Hib gõy viêm màng nóo có genotype mang tớnh tập trung (tương đồng), cũn Hib phõn lập từ họng trẻ khỏe mạnh thường có kiểu genotype rải rác khơng có tớnh tập trung Theo Gilsdorf, thay đổi gen tác động chọn lọc tự nhiên sở để xác định độc lực H.influenzae Cụ thể, ADN H.influenzae xảy đột biến nhận đoạn gen độc lực dẫn đến khác biệt gen chủng vi khuẩn Sự đa dạng đột biến tạo vừa có vai trị thuận lợi phản ánh khả sống sót môi trường khác [50] Điều cho thấy chủng Hib gõy viêm màng nóo thường có tương đồng gen độc lực Hơn nữa, chủng Hib gõy viêm màng nóo phải tương đồng gen quy định đặc điểm giúp cho vi khuẩn sống sót dịch não tủy để gõy bệnh Cho nên, chủng Hib gõy viêm màng nóo thường có phõn loại genotype tương đồng khác với chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi 4.4.4 Mối liên quan genotype (kiểu PFGE ADN) với khả sinh -lactamase chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Sau phõn tớch kết PFGE, xác định enzym β-lactamase chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo trẻ khỏe mạnh tuổi, chúng tơi sử dụng thuật tốn thống kê (Chi-square test, Fisher’s exact test) để đỏnh giá mối liên quan genotype với khả sinh -lactamase Kết cho thấy khơng có mối liên quan có ý nghĩa thống kê đặc điểm phõn loại genotype khả sinh enzym -lactamase chủng Hib phõn lập (p > 0,05) 129 Trên thực tế, người ta chứng minh gen TEM-1 thuộc hai transposon có ký hiệu Tn2 hay Tn3 gen ROB-1 đóng vai trị mó hóa enzym -lactamase [119] Cả hai enzym nằm plasmid nên di truyền theo chế plasmid lan truyền theo chế transposon [23] (hình 4.3) Trong đó, nhân lên plasmid thường nhịp nhàng với ADN nhiễm sắc thể vi khuẩn, plasmid bảo tồn "tương đối" qua hệ Những vi khuẩn có khả sinh enzyme -lactamase xác định vi khuẩn nhận plasmid mang đoạn gen mã hóa enzyme này, đặc biệt F-plasmid (F: Fertility- factor) (1) Chú thích: (1): Tn3 “nhảy” vào F-plasmid có khả tiếp hợp với vi khuẩn khác (2): Tn3 hình thành cấu trúc “thịng lọng” tách khỏi F-plasmid (2) (3): Tn3 giải phóng từ F-plasmid “nhảy” sang ADN khác (3) Hình 4.3 Cơ chế di truyền tranposon Tn3 Vì vậy, vi khuẩn H.influenzae thuộc genotype bị nhiễm plasmid mang gen mó hoỏ enzyme -lactamase tạo nên chủng vi 130 khuẩn khỏng nhúm thuốc -lactam mà genotype quy định khả sinh enzym Thêm vào đó, chế di truyền transposon gen nhảy (jumping gene) Cho nên, Tn3 nhảy từ plasmid thơng thường sang F-plasmid truyền sang tế bào vi khuẩn khác theo chế tiếp hợp (conjugation) dẫn đến tượng tế bào vi khuẩn nhận gen đề kháng (TEM-1) [23], [119] 4.4.5 Mối liên quan genotype (kiểu PFGE ADN) với biotype chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Sau phân tích mối liên genotype biotype chủng Hib phân lập được, thấy tất chủng vi khuẩn có chung genotype ln nằm biotype Điều giải thích chủng Hib genotype có đặc điểm phân tích ADN theo kỹ thuật PFGE giống (PFGE kỹ thuật có khả phân biệt tốt có tính ổn định phân loại vi khuẩn [115]) Tuy nhiên, so sánh mối liên quan nhóm genotype với phân bố theo biotype chủng Hib chúng tơi thấy khơng có ý nghĩa thống kê Sở dĩ có kết khác biệt cấu trúc phân tử ADN genotype xếp nhóm [115], [116] Theo tiêu chuẩn Tenover (cụ thể áp dụng nghiên cứu này), chủng Hib có genotype khác - biến cố đột biến xếp chung vào nhóm genotype Những đột biến thường gặp như: đột biến điểm (mất cặp thêm cặp base vào phân tử ADN), đột biến đoạn (ADN đoạn ADN ngắn) đột biến thêm đoạn (ADN nhận thêm đoạn ADN ngắn) [115] Vì vậy, thay đổi cấu trúc ADN dẫn đến sai khác cấu trúc gen quy định enzym đóng vai trị phân loại biotype H.influenzae nói chung Hib nói riêng, làm cho Hib nhóm genotype (khác genotype) lại xếp 131 vào biotype khác Ngoài ra, số chủng Hib nghiên cứu chưa thực đủ lớn để nghiên cứu đỏnh giá tất tỷ lệ nên kết cho thấy nhóm genotype chủng Hib phân lập khơng có liên quan đến phân loại biotype Tuy nhiên, số chủng Hib thực nghiên cứu đủ lớn chắn thấy nhóm genotype có liên quan đến phân loại biotype, đặc điểm kiểu hỡnh luụn quy định đặc điểm kiểu gen 4.4.6 Mối liên quan genotype chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Sau phân tích tồn chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo kỹ thuật PFGE, kết cho thấy: 01 chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype giống 01 chủng phân lập từ bệnh nhi 02 chủng Hib khác phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype liên quan gần với 02 chủng phân lập từ bệnh nhi viêm màng nóo Trong đó, tất chủng thuộc genotype khơng xếp loại (KXL) 52 chủng Hib phõn lập từ bệnh phẩm dịch ngoáy họng trẻ khỏe mạnh tuổi Sở dĩ có kết chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh luụn cú genotype tản mạn không tập trung vào số nhúm genotype định, chủng Hib gõy viêm màng nóo ln tập trung nhiều vào vài nhúm genotype Hầu hết nghiên cứu xác định Hib loại vi khuẩn có độc lực, kể chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh Tuy nhiên, chủng Hib gõy viêm màng nóo cần phải chứa nhiều loại gen độc lực đặc trưng Trong nghiên cứu này, thấy hầu hết chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh giống có mối liên quan genotype chung nguồn gốc phân lập, ngoại trừ genotype nhóm genotype loại gồm chứa chủng khác nguồn gốc Điều giải thích tượng lây nhiễm chéo Hib trẻ nuôi dưỡng 132 nhà trẻ, mẫu giáo Đặc điểm phù hợp với nhiều nghiên cứu khác giới [100], [122] báo cáo, điển hình nghiên cứu Raquel Sa - Leao Bồ Đào Nha cho thấy có tỷ lệ cao vi khuẩn H.influenzae lan truyền những đứa trẻ ni dưỡng trung tõm chăm sóc ban ngày [105] Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi cho thấy tỷ lệ cao (24,5%) trẻ khỏe mạnh nhà trẻ, mẫu giáo mang vi khuẩn Hib; số trẻ mang Hib độc lực mà khơng có biểu bệnh, đõy nguồn lõy quan trọng sang trẻ khác khó tránh 4.5 So sánh đặc điểm sinh học chủng Hib gây viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Nghiên cứu cho thấy phõn bố tỷ lệ chủng Hib gây viêm màng nóo Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi theo biotype, khả sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym β-lactamase mức độ nhạy cảm với kháng sinh khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, phõn bố chủng Hib theo genotype hầu hết có khác chủng phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo chủng phõn lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi; có 01 chủng Hib (không xếp loại) 02 chủng (không xếp loại) phõn lập từ trẻ khỏe mạnh lần lượt: có genotype với 01 chủng gõy viêm màng nóo có mối liên quan gần gen với 02 chủng gõy viêm màng nóo Vì vậy, đánh giá đặc điểm biotype, khả sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym β-lactamase, mức độ nhạy cảm với kháng sinh Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng nóo Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh khơng có khác Sự khác chủng Hib phõn lập từ hai nguồn gốc thể phõn bố genotype Điều minh chứng cho thấy để gõy bệnh viêm màng nóo, chủng Hib không phụ thuộc vào đặc điểm biotype, serotype mà cũn phải cần nhiều đến yếu tố độc lực khác [50] 133 4.6 Tỷ lệ vi khuẩn Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi nhà trẻ, mẫu giáo Hiện có nhiều nghiên cứu xác định tỷ lệ trẻ khỏe mạnh tuổi có mang vi khuẩn H.influenzae nói chung Hib nói riêng Tuy nhiên, tỷ lệ khác phụ thuộc vào nhiều yếu tố Những yếu tố ảnh hưởng chính, bao gồm: kiện sống trẻ (như sống nơi đông đúc, tập trung nhiều người chăm sóc nhà trẻ hay trại trẻ mồ cơi) làm gia tăng tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn Hib; ngược lại, hiệu việc tiêm chủng vacxin đặc hiệu liệu pháp điều trị kháng sinh lại làm tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn Hib giảm đáng kể [28] Tại Việt Nam, hầu hết nghiên cứu tỷ lệ mang vi khuẩn H.influenzae (chưa có điều kiện định typ huyết thanh) trẻ em 60 tháng cộng đồng số tỉnh miền Bắc Lê Huy Chính cộng Kết cho thấy: tỷ lệ trẻ tuổi mang vi khuẩn H.influenzae chiếm 21,4% (trẻ 12 tháng); 35,5% (trẻ 13 - 24 tháng); 32,5% (trẻ 25 - 36 tháng); 27,7% (trẻ 37 - 48 tháng); 31,6% (trẻ 49 - 60 tháng); khơng có khác biệt tỷ lệ trẻ mang H.influenzae nhóm tuổi khác (p > 0,05) [4] Tuy nhiên, nghiên cứu Phạm Văn Ca Lê Đăng Hà năm 2003 Vị Xuyên (Hà Giang) Vân Đồn (Quảng Ninh) cho thấy tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang H.influenzae 24,0% 14,7%; tỷ lệ vi khuẩn H.influenzae Hib tương ứng 73,1% 76,7% [7] Trên giới, phần lớn nghiên cứu trẻ khỏe mạnh mang H.influenzae định typ huyết Nghiên cứu Staphanie H Factor cộng tỷ lệ trẻ tuổi có mang Hib Châu Á, cho thấy tỷ lệ chung 6% Trong đó, tỷ lệ trẻ mang Hib chiếm: 3% (ở trẻ – tháng); 10% (ở trẻ - 11 tháng); 5% (trẻ 12 - 23 tháng); 8% (ở trẻ 24 - 35 tháng); 4% (ở trẻ 36 - 47 tháng) 5% (ở trẻ 48 - 59 tháng) [56] Bên cạnh đú, Gúmez 134 Elizabeth cộng nghiên cứu dịch tễ học trẻ khỏe mạnh mang Hib Santo Domingo, nước cộng hòa Dominic cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib: 1,5% (ở trẻ tháng); cao 12,5% (ở trẻ - 11 tháng); 6% (ở trẻ 12 23 tháng); 7,9% (ở trẻ 24 - 35 tháng); 9,8% (ở trẻ 36 - 47 tháng) [62] Thêm vào đó, Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu Muge Oguzkaya - Artan cộng cho thấy tỷ lệ trẻ nhỏ lứa tuổi - mang Hib với tỷ lệ 4,2% [87]; Sao Paulo Brazil, Lucia Ferro Bricks với 1200 trẻ nhỏ tuổi chăm sóc 29 Nhà trẻ Taubatộ (trong đó, 213 trẻ khơng tham dự, cịn lại 987) cho thấy 172 trẻ phân lập H.influenzae (17,4%), có 73 chủng Hib Nghĩa tỷ lệ trẻ mang Hib nhà trẻ nghiên cứu 7,4% [36] Vì vậy, hầu hết nghiên cứu nước nước cho thấy tỷ lệ mang H.influenzae nói chung, Hib nói riêng trẻ chăm sóc nhà trẻ - mẫu giáo thường cao (khoảng 15,0% - 25%) Trong đó, tỷ lệ mang Hib thấp lứa tuổi tháng, tỷ lệ cao lứa tuổi từ tháng - tuổi (đặc biệt nhóm tuổi - 11 tháng) giảm dần tuổi trưởng thành [7], [8], [56], [63], [87] Điều kiện sống đông đúc hộ, trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày góp phần làm cho tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trẻ nhỏ cao cách đáng kể Một số nghiên cứu cho thấy có xảy nhiễm khuẩn xâm lấn Hib, tỷ lệ mang vi khuẩn đứa trẻ khác nhóm 58% trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày 91% nhà giữ trẻ nhỏ Tương tự, gia đình, có trường hợp bị nhiễm bệnh xảy ra, tỷ lệ nhiễm khuẩn khảo sát 6070% anh em ruột 20% bậc cha mẹ [28], [77] Tuy nhiên, số nghiên cứu khác cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn Hib cao số trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày cho dù khơng có trường hợp mắc bệnh xảy Điều cho thấy vi khuẩn Hib lây truyền trẻ mang vi khuẩn khơng có triệu chứng Mặc dù thực tế cho thấy tỷ lệ trẻ 135 mang Hib thường 5%, tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày báo cáo chiếm khoảng 15-25% [56], [76], [87], [128] Điển hình nghiên cứu lâu dài 18 tháng trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày Dallas, người ta thấy khơng có trường hợp mắc bệnh tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trung bình 10%, đó: trẻ từ 18-35 tháng tuổi tỷ lệ mang vi khuẩn 71%, 48% trẻ từ 3671 tháng tuổi Điều gợi ý nguồn vi khuẩn lứa tuổi mẫu giáo bị lây từ lứa tuổi bé Sự xâm chiếm vi khuẩn tỵ hầu tồn hàng tháng [76] Nghiên cứu tiến hành trẻ tuổi số nhà trẻ - mẫu giáo, với điều kiện hoàn toàn không mắc bệnh đường hô hấp, chưa sử dụng vacxin phịng Hib khơng sử dụng loại kháng sinh vòng 15 trước ngày lấy bệnh phẩm tăm bụng ngoỏy họng để nuôi cấy xác định Hib Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn H.influenzae nói chung chiếm 43,8% cao so với nghiên cứu nước Lê Huy Chính năm 2007 [8] Phạm Văn Ca năm 2003 [7], phù hợp với kết nghiên cứu Mỹ [63] Tỷ lệ vi khuẩn Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi chiếm 24,5% cao so với nghiên cứu Phạm Văn Ca (13,5% - 17,5%), tương tự số nghiên cứu giới [65] Điều giải thích đối tượng trẻ khỏe mạnh nghiên cứu thu thập nhà trẻ, mẫu giáo nên tỷ lệ mang Hib thông thường cao trẻ thu thập cộng đồng [56], [128] Ngồi ra, tỷ lệ khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) theo giới, theo nhóm tuổi hay điều kiện nhà trẻ - mẫu giáo điều tra Điều gợi ý cho thấy trẻ tuổi mang Hib ln có tỷ lệ cao hầu hết tất nhà trẻ - mẫu giáo có lây 136 truyền Hib trẻ thuộc nhóm tuổi khác nên dẫn đến khơng có khác biệt tỷ lệ mang vi khuẩn nhóm tuổi KẾT LUẬN 4.1 Tỷ lệ loại biotype chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), chủ yếu tập trung biotype II (lần lượt là: 70,6%; 48,1%) biotype I (lần lượt là: 16,7%; 26,9%), biotype khác (III, IV, V) chiếm tỷ lệ khơng đáng kể 4.2 Tỷ lệ chủng Hib có khả sinh enzym β-lactamase phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (lần lượt là: 50,0%; 46,2%); gen mã hóa enzym chủ yếu TEM-1 (lần lượt là: 98,0%; 95,8%), ROB-1 chiếm tỷ lệ không đáng kể (lần lượt là: 2,0%; 4,2%) 4.3 Kết xác định mức độ nhạy cảm với số kháng sinh Hib: - Những chủng Hib phân lập nhạy cảm tốt với số loại kháng sinh: cephalosporin hệ 3, clarithromycin, azithromycin, rifampicin (100%) ampicillin/sulbuctam (97,1% Hib gõy viêm màng não; 98,1% với chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) - Hib phân lập đề kháng nhiều kháng sinh ampicillin (50,0% Hib gây viêm màng nóo 48,1% Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) choloramphenicol (54,9% Hib gây viêm màng não 137 44,2% Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) Khả đề kháng hai loại kháng sinh có liên quan với khả sinh enzym β-lactamase Hib 4.4 Phõn bố genotype (theo kỹ thuật PFGE) Hib gõy viêm màng não có tớnh tập trung vào nhúm genotype chính, chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype tản mạn vào nhiều gentype khác Trong đó, 1,9% (01) chủng Hib phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có chung genotype với 01 chủng Hib gõy viêm màng não 3,9% (02) chủng Hib khác phõn lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype liên quan gần gen với genotype 02 chủng Hib khác gõy viêm màng não 4.5 Giữa chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng não trẻ khỏe mạnh khơng có khác biệt đặc điểm phõn loại biotype, khả sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym mức độ nhạy cảm với kháng sinh Tuy nhiên, chủng Hib phõn lập từ bệnh nhi viêm màng não trẻ khỏe mạnh có khác biệt với phõn loại theo genotype 4.6 Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo điều tra mang Hib chiếm 24,5% Tỷ lệ khơng có liên quan đến giới, nhóm tuổi trẻ điều kiện nhà trẻ, mẫu giáo (thành thị hay nông thôn) 138 KIẾN NGHỊ Tiến hành tiờm chủng mở rộng vacxin cộng hợp Hib cho trẻ từ sau 02 tháng tuổi Để điều trị có hiệu phịng ngừa phát triển lây lan chủng vi khuẩn Hib kháng thuốc cần coi trọng công tác xét nghiệm điều trị theo kháng sinh đồ Đảm bảo hiệu điều trị diệt khuẩn: cần thu thập chủng vi khuẩn Hib gõy bệnh, theo dõi thay đổi tính nhạy cảm với kháng sinh để phát chủng có gen kháng thuốc đột biến (thuộc chủng BLNAR) Tiến hành thu thập số chủng Hib từ bệnh nhi viêm màng não từ trẻ khỏe mạnh tuổi địa điểm với số lượng nhiều để đỏnh giá phát tán genotype gây viêm màng não cho trẻ tuổi cộng đồng ... ? ?Đặc điểm sinh học phân tử Haemophilus influenzae typ b phân lập từ b? ??nh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh nhà trẻ, mẫu giáo? ??, nhằm thực mục tiêu: Xác định biotype, genotype, khả sinh enzym... trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo So sánh đặc điểm sinh học Hib g? ?y viêm màng não trẻ tuổi với Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn 3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Haemophilus influenzae. .. nh? ?y cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ b? ??nh nhi viêm màng nóo tuổi Xác định tỷ lệ, biotype, genotype, khả sinh enzym -lactamase mức độ nh? ?y cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ trẻ