Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 47-52 Cải biến vectơ hệ Virut Semliki Forest (SFV) nhằm biểu thụ thể GPCR người Việt Nam Phạm Thị Hồng Nhung1,2, Hồng Thị Mỹ Nhung1, Đinh Đồn Long1,2* Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym-Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày tháng 12 năm 2014 Chỉnh sửa ngày 16 tháng 12 năm 2014; Chấp nhận đăng ngày 30 tháng 12 năm 2014 Tóm tắt Các thụ thể xuyên màng kết cặp G-protein (GPCR) người có vai trò quan trọng nghiên cứu sàng lọc phát dược phẩm Vì vậy, việc biểu thành công thụ thể công nghệ ADN tái tổ hợp có ý nghĩa quan trọng Trong hệ vectơ biểu hiện, hệ vectơ có nguồn gốc từ Virut Semliki Forest (SFV) có nhiều ưu điểm bật biểu thụ thể màng tế bào nhờ khả lây nhiễm rộng tế bào động vật có vú giúp cải biến protein sau dịch mã hiệu Mục đích nghiên cứu cải biến hệ vectơ SFV (pSFV) để tạo vectơ biểu có vị trí đa nhân dịng (MCS) mã kết thúc dịch mã (stop codons) mở rộng để nâng cao hiệu sử dụng hệ vectơ Phiên vectơ sau cải biến áp dụng thành công để biểu thụ thể neurokinine-1 (NK1R), thụ thể GPCR điển hình, có chức sinh học đầy đủ kiểm chứng qua phương pháp lai miễn dịch (Western Blot) phép đo chức thụ thể (Fura-2) Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng hệ vectơ pSFV cải biến cho biểu sản xuất thụ thể GPCR tái tổ hợp người Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu sinh học thụ thể nghiên cứu sàng lọc phát triển thuốc Từ khóa Vectơ biểu Semliki Forest Virus, Thụ thể neurokinin-1 (NK-1R), ADN tái tổ hợp Tổng quan∗ (molecular target) 60% loại dược phẩm sử dụng điều trị [1] mục tiêu phân tử sử dụng rộng rãi chương trình sàng lọc thuốc hướng đích [4] Vì lý đó, hệ vectơ biểu thụ thể GPCR quan tâm nghiên cứu phát triển 20 năm qua Trong số đó, hệ thống biểu có nguồn gốc Virut Semliki Forest (pSFV) có số ưu điểm vượt trội: i) phổ tế bào vật chủ lây nhiễm rộng, ii) hệ virut bị suy giảm khả tự tái (chỉ tái Các thụ thể kết cặp G-protein (viết tắt GPCR) nhóm thụ thể xuyên màng sinh chất phổ biến đa dạng người [1-3] Các GPCR liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm bệnh truyền nhiễm vi khuẩn, tới bệnh tim mạch, thần kinh, tiêu hóa, tiết niệu, v.v Hiện nay, GPCR coi đích phân tử _ ∗ Tác giả liên hệ ĐT: 84-912150799 E-mail: longdd.smp@vnu.edu.vn 47 48 P.T.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 31, Số (2015) 47-52 có vectơ hỗ trợ) nên tính an tồn sinh học nâng cao, iii) làm giảm mức dịch mã protein tế bào chủ dẫn đến biểu vượt trội protein GPCR tái tổ hợp Tuy vậy, hệ vectơ (pSFVgen2 pSFV-Helper2) có nhược điểm trình tự giới hạn vị trí nhân dịng đa điểm (MCS) hạn chế có ba mã kết thúc dịch mã (stop codon), dẫn đến giới hạn khả sử dụng hệ vectơ cho GPCR khác nhau, đồng thời đòi hỏi việc cài gen phải khung đọc vốn đòi hỏi kỹ thuật phức tạp Nghiên cứu thực nhằm mục tiêu: 1) Cải biến vectơ biểu hiên (pSFVgen2) cách bổ sung trình tự giới hạn vào vị trí nhân dịng đa điểm bổ sung catxet mã kết thúc dịch mã (stop codons) lệch nucleotit sau vị trí MCS để đảm bảo kết thúc dịch mã không phụ thuộc vào vị trí cài gen MCS; 2) Thử nghiệm hệ vectơ cải biến để biểu thụ thể NK1R phân lập từ người Việt Nam để kiểm chứng khả hoạt động hệ vectơ sau cải biến tế bào buồng trứng chuột Hamster (CHO) Vật liệu phương pháp Vật liệu Dòng cADN mã thụ thể NK1R người Việt Nam phân lập cài vào vector nhân dòng pJET1.2 (pJET1.2-NK1R) mô tả trước [5] Hệ vector pSFV (pSFVgen2 pSFV-Helper2) quà tặng từ TS Ghérici Hassain, Trường Đại học Công nghệ Liên Bang Laussane, Thụy Sĩ Cải biến hệ vectơ Đoạn oligonucleotit mang trình tự giới hạn mở rộng catxet stop codons chúng tơi tự thiết kế (Hình 1) đặt tổng hợp hãng IDT (Mỹ) Các cặp mồi PCR đặc hiệu vectơ pSFV cADN mã NK1R có trình tự sau: NK1-F: 5’-ATTTGGATCCGATATGGATAACGTCCTC-3’ NK1-R: 5’-TAAATCGATCTAGGAGAGCACATTG-3’ NK1-R1: 5’-GCCAGCAGATGGCGAAGG-3’ SFV-F: 5’-GCCCATCTATGACAACAAG-3’ Vị trí bắt cặp cặp mồi mơ tả Hình Hình Cấu trúc hệ vector pSFV A) Cấu trúc vectơ biểu pSFVgen (trình tự bên đoạn bổ sung vào vectơ cải biến pSFV-Klept1.2; B) Cấu trúc vector hỗ trợ pSFV-Helper2 P.T.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 31, Số (2015) 47-52 49 Sàng lọc khuẩn lạc E.coli DH5α mang vector pSFV –NK1R Hình Vị trí bắt cặp mồi PCR vector pSFV-Klept1.2 (kí hiệu SFV-F) đoạn cài cADN mã NK1R (kí hiệu bắt đầu NK1; F, mồi xi; R, mồi ngược), để kiểm chứng đoạn cài gắn vào vectơ pSFV PCR khuếch đại đoạn gen mã thụ thể NK1R cADN mã cho NK1R nhân dòng từ vector pJET1.2-NK1R phản ứng PCR dùng Pfu ADN polymerase (Thermo Scientific, Mỹ) cặp mồi NK1-F/NK1-R có chứa vị trí giới hạn BamHI Bsu15I Chu trình nhiệt sử dụng: thời gian biến tính đầu tiên: 95˚C - phút; lặp lại chu kì: 95˚C - 30 giây, 50˚C 30 giây, 72˚C - 90 giây; lặp lại 35 chu kì: 95˚C - 30 giây, 58˚C - 30 giây, 72˚C - 90 giây; thời gian tổng hợp sau cùng: 72˚C 10 phút Sản phẩm PCR tinh AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) Chuyển cADN mã NK1R từ vectơ nhân dòng pJET1.2 sang vectơ biểu pSFV –Klept1.2 Vector pSFV –Klept1.2 sản phẩm PCR cADN mã NK1R cắt đồng thời enzyme giới hạn BamHI Bsu15I (Thermo Scientific, Mỹ) để đảm bảo đoạn cài lắp chiều Vector pSFV –Klept1.2 sau mở vịng ngăn đóng vịng Alkaline Phosphatase (Thermo Scientific, Mỹ) tinh phenol/chloroform cADN mã NK1R nối vào vector nhờ T4 ADN ligase (Thermo Scientific, Mỹ) Hỗn hợp ADN tái tổ hợp biến nạp vào tế bào E.coli khả biến DH5α theo quy trình truyền thống [6] cấy mơi trường có bổ dung ampicillin để phát khuẩn lạc mang plasmid Các khuẩn lạc tiếp tục sàng lọc nhanh kĩ thuật colony PCR dùng cặp mồi SFV-F/NK1-R1 để tìm khuẩn lạc mang vector pSFV-NK1R Biểu NK1R tế bào CHO sử dụng hạt virus SFV mang gen mã NK1R pSFV-NK1R pSFV-Helper2 phiên mã invitro ARN chúng đồng biến nạp xung điện vào tế bào BHK-21 để sản xuất hạt virus SFV mang cADN mã NK1R Để có khả lây nhiễm, hạt virus hoạt hóa α-chymotrypsin nồng độ 500µg/ml 20 phút Tế bào CHO ni cấy đạt khoảng 70 – 80% đồng dòng ủ với virut hoạt hóa qua đêm 37ºC tủ 5% CO2 Ngày hôm sau tế bào thu để kiểm tra biểu NK1R bẳng kỹ thuật Western Blot phép thử Fura -2AM (Invitrogen, Life Technologies) Kết 3.1 Cải biến vectơ pSFV Trình tự nuclecotit Hình cho thấy đoạn oligonucleotit mang trình tự giới hạn mở rộng (cho enzym giới hạn BamHI, BlpI, PauI, AsuII, Bsu15I, AvrII, ApaI, SmaI) catxet ba kết thúc dịch mã (stops codons) cài thành công vào vectơ pSFVgen2 đê tạo vectơ pSFV-Klept1.2 P.T.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 47-52 50 Hình Kết giải trình tự đầu 3’ vectơ pSFV-Klept1.2 cho thấy đoạn oligonucleotit cải biến cài thành công vào vectơ biểu pSFVgen2 3.2 Chuyển cADN mã NK1R từ vectơ nhân dòng pJET1.2 sang vectơ biểu pSFV Ảnh điện di Hình 4A cho thấy đoạn chèn cADN mã NK1R nhân dịng thành cơng cắt tạo đầu dính cho sản phẩm có kích thước 1214 bp tính tốn lý thuyết Băng điện di rõ đặc hiệu đủ điều kiện sử dụng cho phản ứng Sản phẩm điện di Hình 4B cho thấy vector pSFVKlept1.2 mở vịng hồn tồn với băng ADN đủ chất lượng để sử dụng cho phản ứng nối ADN (A) (B) Hình Ảnh điện di gel agarose 1% A) Sản phẩm PCR cADN mã NK1R 1, đối chứng âm; 2, sản phẩm PCR cADN mã NK1R; M, thang ADN 100 bp B) Plasmid pSFV-Klept1.2 1, plasmid sau mở vòng; 2, pSFV – Klept1.2 xử lý đồng thời BamHI/Bsu15I Alkaline Phosphatase; M, Thang ADN kích thước lớn (Thermo Scientific) 3.3 Sàng lọc khuẩn lạc E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp pSFV –NK1R Để tăng cường hiệu phản ứng colony PCR, hỗn hợp chứa khuẩn lạc ủ 95˚C 15 phút trước đưa vào sàng lọc Tại nhiệt độ gắn mồi 60˚C sử dụng cặp mồi SFV-F/NK1-R1, thu số khuẩn lạc tạo sản phẩm PCR có kích thước 915 bp khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1R chiều minh họa Hình Hình Ảnh điện di sàng lọc khuẩn lạc mang pSFV -NK1R colony PCR 1, Đối chứng âm; đến 8, sản phẩm PCR mẫu khuẩn lạc thu được; M: Thang ADN 100 bp (Thermo Scientific) 3.4 Biểu NK1R tế bào CHO Thí nghiệm Western blot tiến hành với lượng protein tổng số thu từ dòng CHO tự nhiên CHO ủ với hạt virus SFV-NK1R (viết tắt CHO-NK1R) sử dụng kháng thể Tubulin (480011, Invitrogen) P.T.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 47-52 kháng thể NK1R (SAB4502913, Sigma) Kết Western blot thể Hình 51 Thảo luận Kết phân tích Western blot cho thấy, dòng tế bào CHO-NK1R biểu thụ thể NK1R thụ thể hồn tồn khơng biểu dòng tế bào CHO tự nhiên lượng protein định (sản phẩm gen giữ nhà) đưa vào thể thông qua đối chứng nhuộm với kháng thể β-III-tubulin (A) (B) (C) Hình Ảnh Western blot tế bào CHO tự nhiên tế bào CHO biểu NK1R Các tế bào CHO phân tích 24 sau lây nhiễm với hạt virus SFVNK1R A) Western blot với kháng thể tubulin (Invitrogen) B) Thang chuẩn protein C) Western blot với kháng thể NK1R (Sigma) Kết phân tích hoạt tính NK1R biểu dịng tế bào CHO-NK1R thơng qua khả giải phóng Ca2+ nội bào thêm Substance P nồng độ 10-7 M Chỉ số Ca2+ nội bào đánh giá thông qua kit Fura-2AM (Life Technologies Inc., Singapore) thông qua giá trị huỳnh quang đo bước sóng 340 nm (F340) 390nm (F390) dùng máy Plate CHAMELEONTM V (Hidex, Phần Lan) trình bày Hình Khi thêm chất chủ vận điển hình NK1R Substance P vào môi trường, tế bào CHONK1R xảy đáp ứng tế bào dạng tự nhiên Như vậy, mơ hình tế bào CHO-NK1R tạo sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc hợp chất thu từ nguồn dược liệu Việt Nam với đích tác dụng thụ thể NK1R Với dải vật chủ lây nhiễm rộng, tính an tồn virut tạo dạng bất hoạt không qua xử lý α-chymotrypsin, khả lây nhiễm nhanh hiệu quả, quy trình nghiên cứu áp dụng để biểu GPCR tái tổ hợp khác người phục vụ cho nghiên cứu sinh học thụ thể dược lý học phân tử Kết luận Chúng cải biến vector hệ pSFVgen2 (tạo vectơ biểu pSFV -Klept 1.2) dùng để biểu thành cơng thụ thể NK1R hồn chỉnh từ người Việt Nam qua việc tế bào tái tổ hợp CHO-NK1R biểu đầy đủ chức sinh học thụ thể Hình Fura-2 tế bào CHO biểu NK1R Các tế bào CHO-NK1R xử lý với phối tử đặc hiệu (Substance P) vị trí mũi tên đo động học liên tục 60 giây Lượng Ca2+ giải phóng tính từ tỉ số F340/F390 tăng Substance P kích thích cho thấy tế bào CHO-NK1R biểu thụ thể có chức truyền tín hiệu (dẫn đến tăng chất truyền tin thứ 2) tế bào tự nhiên Lời cảm ơn Chúng trân trọng cảm ơn tài trợ Bộ Khoa học Công nghệ Việt Nam cho đề tài ĐT-PTNTĐ.2011-G/04 để thực nghiên cứu P.T.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 47-52 52 Tài liệu tham khảo [4] Lundstrom K (2006) Latest development in drug discovery on G protein –coupled receptors Curr Protein Pept Sci, 7(5): 465 - 70 [1] Eglen RM, Reisine T (2008) GPCR proteins: important new tools in drug discovery Assay Drug Dev Technol 6(5): 659-71 [2] Thompson MD, Siminovitch KA, Cole DE (2008) G protein-coupled receptor pharmacogenetics Methods Mol Biol.; 448: 139-85 [3] Lundstrom K (2009) An overview on GPCRs and drug discovery: structure-based drug design and structural biology on GPCRs methods Mol Biol, 552: 66-51 [5] Võ Thương Lan, Phan Hà Mỵ, Đinh Đoàn Long (2013) Tách dịng cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mơ não người Việt Nam Tạp chí Khoa học (VNU), 29 (4): 24 - 28 [6] Sambrook J., Russel D.W (2011) Molecular Cloning: A laboratory manual, 5th edition: Cold Spring Harbor Laboratory Press Development of Semiliki Forest Virus Expression Vector for Production of Human GPCR Receptors Clonally Isolated from Vietnamese Patients Phạm Thị Hồng Nhung1,2, Hoàng Thị Mỹ Nhung1, Đinh Đoàn Long1,2* Key Lab for Enzyme-Protein Technology, VNU University of Science, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hanoi, Vietnam VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hanoi, Vietnam Abstracts: Semiliki Forest Virus (SFV) expression system permits a rapid and efficient production of large quantities of receptor proteins for pharmacological sudies The system is based on replicon vector (pSFV2gen) and helper vector (pSFV-Helper2) The purpose of this study is to develope and use the improved SFV vectors to express human G-protein coupled receptors isolated from Vietnamese patients in mammalian cell lines A new replicon vector (pSFV - Klept1.2) was constructed from pSFV2gen by joining a new DNA sequence which has additional multiple cloning sites and a cassette of stop codons cDNA of Neurokinin-1 receptor (NK1R) was introduced into the pSFV-Klept1.2 and in vitro transcribed RNA was electroporated into BHK-21 cells with pSFVHelper2 RNA for producing virus Results of Western Blot and Fura - 2AM assay show that pSFVKlept1.2 expressed NK1R into CHO cells with full activity With this vectors, we have established successfully a cellular model facilitating the production of recombinant GPCRs for molecular pharmacological studies and drug screening Keywords: Neurokinin-1 receptor, Semliki Forest Virus vector, recombinant DNA ... thuộc vào vị trí cài gen MCS; 2) Thử nghiệm hệ vectơ cải biến để biểu thụ thể NK1R phân lập từ người Việt Nam để kiểm chứng khả hoạt động hệ vectơ sau cải biến tế bào buồng trứng chuột Hamster (CHO)... dụng để biểu GPCR tái tổ hợp khác người phục vụ cho nghiên cứu sinh học thụ thể dược lý học phân tử Kết luận Chúng cải biến vector hệ pSFVgen2 (tạo vectơ biểu pSFV -Klept 1.2) dùng để biểu thành... mồi mơ tả Hình Hình Cấu trúc hệ vector pSFV A) Cấu trúc vectơ biểu pSFVgen (trình tự bên đoạn bổ sung vào vectơ cải biến pSFV-Klept1.2; B) Cấu trúc vector hỗ trợ pSFV-Helper2 P.T.H Nhung nnk