Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ 25 (2009) 101-106 Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà*, Vũ Minh ðức, Chu Văn Mẫn Khoa Sinh, Trường ðại học Khoa học Tự nhiên, ðHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 02 tháng năm 2007 Tóm tắt Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi tự nhiên, đa dạng sinh thái Các lồi Bacillus ñã, ñang ngày trở thành vi sinh vật quan trọng hàng ñầu mặt ứng dụng Các ứng dụng chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ cơng truyền thống đến cơng nghệ lên men đại, đến sinh học phân tử, y-dược học chữa bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ phế liệu Chính lẽ nên ñã có ngày nhiều nghiên cứu sâu chi Bacillus mở rộng ứng dụng chúng ñối với ñời sống nguời Từ thiên nhiên nhiệt ñới nhiệt ñới ña dạng Việt Nam, chúng tơi thu nhận chủng Bacillus có hoạt tính phong phú từ vùng sinh thái khác nhằm bước xây dựng sưu tập chủng chi vi khuẩn quan trọng Trong kết nghiên cứu, chúng tơi phân lập 236 chủng Bacillus từ mẫu ñất nước thải khác nhau, khảo sát hoạt tính enzym ngoại bào proteaza, amylaza CMC-aza 236 chủng Trong số đó, chủng T20, TR6 TH5 có tác dụng tốt xử lý nước thải Các giá trị BOD5 nước thải nhà máy sữa Vinamilk Gia Lâm Hà Nội xử lý lắc có khơng có dịch nuôi chủng T20 1250 730mg/L Các giá trị BOD5 nước thải ñược xử lý lắc có khơng có huyền dịch tế bào TR6 800 610mg/L Các giá trị BOD5 nước thải sông Tô Lịch xử lý lắc có khơng có dịch ni chủng TH5 pha lỗng 165 92mg/L Từ khóa: Bacillus.spp, enzyme, wastewater treatment ðặt vấn ñề∗ chấy tẩy rửa [1,2], cơng nghiệp thực phẩm bánh kẹo - đồ uống [3,4], công nghiệp dược phẩm [5], công nghiệp thuộc da [1,6], công nghiệp dệt [5], xử lý chất thải [1,7] Riêng ứng dụng vi khuẩn xử lý nước thải chưa thấy tài liệu cơng bố Tuy nhiên, nói, nhiều enzym ngoại bào Bacillus enzym thuỷ phân phân tử hữu lớn, nước thải sinh hoạt nước thải từ cơng nghiệp thực phẩm nói chung giàu chất hữu nên việc ứng dụng vi Vi khuẩn thuộc chi Bacillus có tiềm lớn enzym ngoại bào Nhiều số enzym ngoại bào enzym thuỷ phân phân tử hữu lớn Chính vi khuẩn có nhiều ứng dụng lĩnh vực khác [1] như: công nghiệp sản xuất _ ∗ Tác giả liên hệ ðT: 84-4-38588856 E-mail: habtv@vnu.edu.vn 101 102 N.T Thành nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 25 (2009) 101-106 khuẩn để xử lý loại nước thải có triển vọng Bài báo trình bày ba hoạt tính enzym thuỷ phân ngoại bào số chủng Bacillus thăm dị khả ứng dụng để xử lý nước thải sông Tô Lịch nước thải nhà máy sữa Vinamilk Gia Lâm Hà Nội Những chủng nằm số 236 chủng phân lập từ vùng địa lý khác nhằm khai thác tính ña dạng sinh lý thích ứng enzym Bacillus [8] Kết thảo luận 3.1 Phân lập Bacillus Từ mẫu ñất vùng ñịa lý thuộc nhiều tỉnh khác nhau, ñã phân lập ñược 236 chủng Bacillus Một số chủng ñã ñược kiểm tra hoạt tính enzym thuỷ phân ngoại bào, trình bày Ngun liệu phương pháp nghiên cứu T20 2.1 Vi sinh vật Các chủng Bacillus dùng nghiên cứu ñược phân lập từ ñất nhiều vùng ñịa lý từ nước thải sông Tô Lịch Hà Nội nước thải nhà máy sữa Vinamilk Gia Lâm Hà Nội 2.3 Phân lập Bacillus Các mẫu phân lập pha lỗng tới ñộ pha loãng cần thiết ñược xử lý nhiệt 800C 15 phút, sau cấy gạt lên mơi trường thạch dinh dưỡng Ni nhiệt độ 28300C 24 Các khuẩn lạc mọc lên ñược kiểm tra hiển vi kiểm tra ñặc ñiểm khác, phù hợp với ñặc ñiểm Bacillus cấy chuyển sang thạch nghiêng để bảo quản M27 Hình Vùng phân huỷ gelatin hai chủng T20 M27 3.2 Hoạt tính proteaza - Các chủng T20 M27 thể hoạt tính phân huỷ gelatin phân huỷ sữa gầy, nêu hình chủng T20 mạnh chủng M27 - Các chủng TR1, TR5, TR6, TR12, TR13 TR14 thể hoạt tính proteaza cảm ứng 1% sữa gầy, nêu hình 2.3 Xác định hoạt tính proteaza, amylaza xenlulaza (CMC-aza) Các hoạt tính ñược xác ñịnh theo kỹ thuật khuếch tán thạch 2.4 Xác định nhu cầu oxy sinh hố ngày (BOD5) (Theo tiêu chuẩn Việt Nam ISO 5815:1989) Hình Tác dụng cảm ứng sữa gầy ñối với hoạt tính proteaz a chủng TR N.T Thành nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 25 (2009) 101-106 103 tinh bột với lượng 17/20 chủng thể vịng phân huỷ tinh bột (hình 5) Hình Khả phân huỷ sữa gầy 20 chủng (TH1-TH20) môi trường MP - Các chủng từ TH1ñến TH20 thể khả phân huỷ sữa gầy hình 3, chủng TH5 TH8 mạnh 3.3 Hoạt tính amylaza - Các chủng T20 M27, thử nghiệm cấy điểm, thể hoạt tính amylaza, với đường kính vịng phân huỷ 19,5 20mm theo thứ tự - Các chủng TR4, TR6, TR8, TR10, TR12, TR14, thử nghiệm ñục lỗ, khơng thể hoạt tính amylaza ngoại bào mơi trường HA dịch thể thể hoạt tính mơi trường HA dịch thể +1% tinh bột (hình 4) Hình Hoạt tính phân huỷ tinh bột chủng từ TH1 ñến TH20 Bên trái lỗ tra dịch ni chủng mơi trường HA+1% tinh bột; tất chủng khơng thể hoạt tính phân huỷ tinh bột, trình bày số chủng Bên phải lỗ tra dịch ni chủng mơi trường HA glucoza thay tinh bột, kết số chủng thể hoạt tính phân huỷ tinh bột 3.4 Hoạt tính CMC-aza - Hai chủng T20 M27 ñều thể hoạt tính CMC-aza mức 20mm, theo thử nghiệm cấy điểm mơi trường MT4 - Các chủng từ TR1 đến TR14, trừ chủng số 10, tất ñều thể hoạt tính CMC-aza mơi trường HA kiềm (hình 6a), hoạt tính tăng lên đáng kể mơi trường ni bổ sung CMC (hình 6b) Hình Tác dụng cảm ứng tinh bột ñối với amylaza chủng nghiên cứu - Các chủng từ TH1 ñến TH20, thử nghiệm ñục lỗ, ñều hoạt tính phân huỷ tinh bột mơi trường HA môi trường HA + 1% tinh bột Tuy nhiên, glucoza mơi trường HA thay Hình 6a Các chủng từ TR1 đến TR14 ni mơi trường HA kiềm, trừ chủng số 10, thể vịng hoạt tính CMC-aza, theo thử nghiệm đục lỗ 104 N.T Thành nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 25 (2009) 101-106 Nhìn chung, ba hoạt tính enzym nói (proteaza, amylaza CMC-aza) chủng nghiên cứu đa dạng, mức độ hoạt tính mức cảm ứng ðiều tạo nhiều khả lựa chọn chủng thích hợp cho mục đích xử lý môi trường ô nhiễm hữu 3.5 Thăm dị khả xử lý nước thải Hình 6b Các chủng TR mang số hiệu 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 thể hoạt tính CMC-aza cảm ứng CMC mức ñộ khác Các chủng từ TH1 đến TH20 khơng biểu hoạt tính CMC-aza môi trường HA, 14 chủng số biểu hoạt tính mơi trường HA+1% CMC (hình 7) 3.5.1 Xử lý nước thải nhà máy sữa Vinamilk Gia Lâm Hà Nội Dịch nuôi ngày tuổi chủng T20 mơi trường HA loại bỏ tế bào dùng làm chế phẩm (chế phẩm T20), ñược bổ sung vào nước thải theo tỷ lệ 1/2 (v/v) xử lý hiếu khí lắc Hình cho thấy chế phẩm T20 làm giảm ñáng kể BOD5 nước thải xử lý, xuống cịn 730, so với 1250mg/L cơng thức xử lý lắc khơng có chế phẩm Ký hiệu chủng Hình Khả phân huỷ CMC chủng từ TH1 ñến TH20, theo thử nghiệm đục lỗ 14 chủng có đường kính vùng phân huỷ > 10mm chủng có hoạt tính Hình Tác dụng chế phẩm TR6 xử lý nước thải ðối chứng 1: Mẫu nước thải không xử lý ðối chứng 2: Mẫu nước thải xử lý lắc khơng bổ sung chế phẩm Hình Tác dụng chế phẩm T20 xử lý nước thải ðối chứng 1: Mẫu nước thải không xử lý ðối chứng 2: Mẫu nước thải xử lý lắc không bổ sung chế phẩm Trong thí nghiệm khác, 10ml huyền dịch tế bào TR6 có OD600 = 0,6 bổ sung vào 50ml nước thải trước xử lý lắc Hình cho thấy chế phẩm làm giảm rõ rệt BOD5 nước thải, xuống 610 so với 800mg/L mẫu xử lý lắc không bổ sung chế phẩm N.T Thành nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 25 (2009) 101-106 105 phẩm bào tử giải pháp khác nhằm tránh hiệu ứng phụ có vừa nêu Kết luận Hình 10 Hiệu xử lý nước thải chế phẩm TH5 Hai công thức xử lý với chế phẩm XL2 XL3 xem chi tiết 3.5.2 Xử lý nước thải sông Tô Lịch Huyền dịch tế bào chủng TH5 có OD600 = 1,7 ñược dùng hai nồng ñộ, cơng thức thí nghiệm sau đây: + ðC (đối chứng 1): nước thải trước xử lý + ðC (đối chứng 2): nước thải để n khơng lắc, 300 C, ngày + XL 1: xử lý lắc 200 vòng/phút, 300C, ngày + XL 2: xử lý lắc có chế phẩm (10ml/50ml nước thải), 200 vịng/phút, 300C, ngày + XL 3: xử lý lắc có chế phẩm (10m chế phẩm pha lỗng gấp đơi/50ml nước thải), 200 vịng/phút, 300C, ngày Hình 10 cho thấy chế phẩm TH5 hai nồng độ khác (cơng thức XL2 XL3) làm giảm mạnh BOD5 xuống 116,67 92,2mg/L theo thứ tự, so với 165,55mg/L công thức xử lý khơng có chế phẩm ðiều đáng ý nồng độ thấp chế phẩm (cơng thức XL3) hiệu xử lý lại cao nồng ñộ cao chế phẩm (công thức XL2) ðiều liên quan đến hiệu ứng phụ: việc ñưa chế phẩm nồng ñộ cao vào nước thải đưa thêm chất hữu vào đó, bù lại phần BOD giảm tác dụng chế phẩm Vì thực tiễn xử lý, sử dụng chế ðã phân lập ñược 236 chủng Bacillus từ mẫu ñất nước thải khác nhau, khảo sát hoạt tính enzym ngoại bào proteaza, amylaza CMC-aza 236 chủng Trong số đó, chủng T20, TR6 TH5 có tác dụng tốt xử lý nước thải Các giá trị BOD5 nước thải nhà máy sữa Vinamilk Gia Lâm Hà Nội xử lý lắc có khơng có dịch ni chủng T20 1250 730mg/L Các giá trị BOD5 nước thải ñược xử lý lắc có khơng có huyền dịch tế bào TR6 800 610mg/L Các giá trị BOD5 nước thải sông Tô Lịch xử lý lắc có khơng có dịch ni chủng TH5 pha loãng 165 92mg/L Lời cảm ơn Cơng trình có hỗ trợ chương trình NCCB KHTN (Bộ KH&CN) Các tác giả xin chân thành cảm ơn PGS.TS Kiều Hữu Ảnh đọc góp cho thảo Tài liệu tham khảo [1] R Gupta, Q.K Beg, P.Lorenz, Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications, Appl Microbiol Biotechnol 59 (2002) 15 [2] H Outtrup, T.S Jorgensen ST, The importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes In: Berkeley R, Heyndrickx M, Logan N, De Vos P (eds), Applications and systematics of Bacillus and relatives, Blackwell publishing, UK, 2002, pp 206-218 [3] P.G Dalev, Utilization of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate, Bioresour Technol 48 (1994) 265 106 N.T Thành nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 25 (2009) 101-106 [4] B.D Rebeca, Pena-Vera MT, Diaz – Castaneda M, Production of fish protein hydrolysates with bacterial proteases; yield and nutritional value, J Food Sci 56 (1991) 309 [5] M Schallmey, A Singh, P.O.Ward, Developments in the use of Bacillus species for industrial production, Can J Microbiol 50 (2004) [6] A Hammed, T Keshavarz, C.S Evan, Effect of dissolved oxygen tension and pH on the production of extracellular protease from a new isolate of Bacillus subtilis K2, for use in leather processing, J Chem Technol Biotechnol 74 (1999) [7] M Kubo, J Okajima, F Hasumi, Isolation and characterization of soybean waste – degrading microorganisms and analysis of fertilizer effects of the degraded products, Applied and Environmental Microbiology 60 (1994) 243 [8] F.G Priest, Extracellular Enzyme synthesis in the Genus Bacillus, Bacteriological Reviews 41 (1977) 711 Study on extracellular enzymes of some newly isolated Bacillus strains and their ability to use them for wastewater treatment Ngo Tu Thanh, Bui Thi Viet Ha, Vu Minh ðuc, Chu Van Man Faculty of Biology, College of Science, VNU, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam 236 Bacillus strains were isolated from soil and wastewater samples The activities of extracellular enzymes of 36 isolates were investigated Most of them secreted extracellular protease, amylase, and carboxymetylcellulase Under the laboratory conditions, the wastewater treament with preparations made from strains T20, TR6 and TH5 decreased significantly BOD5 values of wastewaters Examples: BOD5 values of wastewater from Vinamilk Gia Lam Ha Noi treated by shaking without and with cultural fluid of the strain T20 were 1250 and 730 mg/L, respectively; BOD5 values of wastewater from To Lich river treated by shaking without and with diluted cell suspension of the strain TH5 were 165 and 92 mg/L, respectively Keywords: Bacillus.spp, enzyme, wastewater treatment ... nước thải không xử lý ðối chứng 2: Mẫu nước thải xử lý lắc khơng bổ sung chế phẩm Hình Tác dụng chế phẩm T20 xử lý nước thải ðối chứng 1: Mẫu nước thải không xử lý ðối chứng 2: Mẫu nước thải xử lý. .. 101-106 khuẩn ñể xử lý loại nước thải có triển vọng Bài báo trình bày ba hoạt tính enzym thuỷ phân ngoại bào số chủng Bacillus thăm dò khả ứng dụng ñể xử lý nước thải sông Tô Lịch nước thải nhà máy... ñã phân lập ñược 236 chủng Bacillus Một số chủng ñã ñược kiểm tra hoạt tính enzym thuỷ phân ngoại bào, trình bày Ngun liệu phương pháp nghiên cứu T20 2.1 Vi sinh vật Các chủng Bacillus dùng nghiên