Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 199-205 Nghiên cứu hoạt tính sinh học dịch chiết bán hạ roi Typhonium flagelliforme (Lodd) Blume Lê Quý Thưởng1,2, Bạch Tuyết Mai1,3, Nguyễn Minh Châu1, Lê Thị Phương Hoa4, Nguyễn Quang Huy1,* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Trường Cao đẳng y dược Phú Thọ, 2201 đại lộ Hùng Vương, Việt Trì, Phú Thọ Trường cao đẳng Y tế Hà Đông, 39 Nguyễn Viết Xuân, Quang Trung, Hà Nội, Việt Nam Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, 136 đường Xuân Thủy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Cây Bán hạ roi dược liệu có nhiều tác dụng y học dân gian, sử dụng chữa ho, nhức đầu, đau dày mạn tính, trị viêm khí quản Trong nghiên cứu chúng tơi xác định hoạt tính chống oxy hố, hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết Bán hạ roi Kết thu cho thấy thành phần hố học lồi Bán hạ roi có chứa đường khử, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, alkaloid, sterol Khả chống oxy hoá phân đoạn dịch chiết ethyl acetat đạt 94,76 µg/ml cao gấp 10 lần so với chất đối chứng dương Quercetin Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết n-hexan diclometan Bán hạ roi thể ba dòng ung thư thực nghiệm KB, HepG2 Lu sau 72 nuôi cấy với giá trị IC50 khoảng 92,8 - 107,76 µg/ml Từ dịch chiết dichlomethan tách chiết hợp chất TF1 xác định cấu trúc stigmast-4-en-3-on Từ khóa: Bán hạ roi, chống oxy hóa, gây độc tế bào Mở đầu có độc Trong dân gian Bán hạ roi sử dụng để chữa ho, nhức đầu, đau dày, củ tươi trị chữa mụn nhọt, ghẻ lở, vết cắn côn trùng [2, 3] Các nghiên cứu cho thấy số phân đoạn dịch chiết n-hexan diclometan Bán hạ roi có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư biểu mô, tế bào ung thư phổi NCI-H23 hay chuỗi nguyên bào sợi BALB/c 3T3 chuột [4] Dịch chiết n-hexan Bán hạ roi cịn có hoạt tính gây độc tế bào in vitro tế bào u bạch huyết lympho p388 [5] Trong dịch chiết Bán hạ roi có hợp chất thứ cấp flavonoids, saponins, alkaloids terpenoids Dịch chiết dung Cây Bán hạ roi (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) thuộc họ Ráy (Araceae) trồng rộng rãi Ấn Độ, Úc, Sri Lanka, Indonesia số nước châu Á có Việt Nam [1] Là thuốc nhân dân nước Đông Nam Á sử dụng rộng rãi điều trị ung thư, chúng sử dụng phổ biến bệnh nhân nhân ung thư ác tính đặc biệt bệnh bạch cầu, ung thư vú ung thư cổ tử cung Cây có tính vị cay, tính ơn, _ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-914858812 Email: nguyenquanghuy@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4575 199 200 L.Q Thưởng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 199-205 mơi n-hexan Bán hạ roi có chứa hydrocarbon bão hoà acid aliphatic [6] dịch chiết ethyl acetat có chứa acid béo Một vài hợp chất tinh xác định cấu trúc bán hạ roi [7] Tuy Việt Nam chưa có nghiên cứu thành phần hoạt tính sinh học Bán hạ roi Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Các mẫu thân, lá, rễ củ Bán hạ roi thu hái Phú Thọ phân loại Nguyễn Anh Đức, Bộ môn Thực vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Các mẫu sau thu hái rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khô nghiền thành bột mịn Các dòng tế bào ung thư thử nghiệm gồm: KB (ung thư biểu mô), Hep G2 (ung thư biểu mô gan) LU (ung thư phổi) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết phân đoạn dịch chiết Mẫu bột dược liệu (2000 g) ngâm chiết methanol, sau đem lọc thu dịch Cất loại dung môi áp suất giảm thu cao methanol (55,3g) Phần cao tổng hòa tan 500 ml H2O cất, sau chiết với dung mơi n-hexan, diclometan etyl acetat Gộp phân đoạn dịch chiết để loại dung môi áp suất giảm thu cao n-hexan (12,5g), cao diclometan (8,5g) etyl acetat (7,4g) [8] 2.2.2 Phương pháp định tính nhóm chất hữu dịch chiết Định tính alkaloid thuốc thử Dragendorff, nhận biết flavonoid phản ứng đặc trưng với dung dịch NaOH 10%, nhận biết terpenoid acid sulfuric 10% ethanol, nhận biết carotenoid dung dịch H2SO4 đậm đặc, saponin lắc dung dịch loãng nước, tinh dầu bốc chất béo nhỏ dung dịch lên giấy [9, 10] 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hố DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) chất tạo gốc tự pha methanol Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc làm giảm màu DPPH, xác định cách đo quang bước sóng λ = 517 nm [11] Dung dịch DPPH có nồng độ 1mM methanol Chất thử pha DMSO 100% cho nồng độ cuối đạt dãy nồng độ 256; 64; 16; 4; µg/ml % quét gốc tự DPPH mẫu thử tính theo cơng thức sau: SC% = (ODtrắng - ODmẫu thử)/ ODtrắng (%) EC50 tính theo giá trị SC tương quan với nồng độ khác chất thử, thí nghiệm lặp lại với n = [11] Quercetin chất đối chứng 2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào Phương pháp thử độ độc tế bào Các dịch chiết tiến hành thử nghiệm dòng tế bào ung thư: KB, Hep-G2, Lu Các dòng tế bào ung thư nuôi cấy môi trường phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết phơi bị thành phần khác điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37oC, độ ẩm 98% vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển khác Tế bào phát triển pha log sử dụng để thử độc tính Phần trăm kìm hãm phát triển tế bào (IC) tính toán dựa số liệu đo mật độ quang học OD máy quang phổ theo công thức sau: OD mẫu thử - OD đối chứng (+) IC(%) = 100 x OD đối chứng (-) – OD đối chứng (+) L.Q Thưởng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 199-205 Giá trị IC50 tính dựa kết số liệu phần trăm kìm hãm phát triển tế bào phần mềm máy tính Ellipticine chất đối chứng Phương pháp thực Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam [12] 2.2.5 Phân lập chất từ dịch chiết Bán hạ roi Hợp chất tinh khiết có hoạt tính từ dịch chiết từ bán hạ roi phân lập sắc ký cột Sử dụng máy quang phổ (FT-IR, NMR, DEPT) để phân tích, xác định cấu trúc 201 hợp chất phân lập Thí nghiệm thực trường Cao đẳng Dược Phú Thọ, tỉnh Phú Thọ Kết thảo luận 3.1 Khảo sát thành phần hoá học Bán hạ roi Thành phần hoá học Bán hạ roi xác định từ dịch chiết dung mơi khác trình bày Bảng Bảng Kết định tính nhóm chất Bán hạ roi TT Nhóm chất Glycosid Saponin Tanin Đường khử Polysaccharid Acid amin Acid hữu Flavonoid Alkaloid 10 11 Chất béo Sterol Tên phản ứng/thuốc thử Phản ứng Legal Phản ứng Baljet Phản ứng Keller-Kiliani Hiện tượng tạo bọt Chì acetate FeCl3 Dung dịch Gelantin 1% Thuốc thử Felling Thuốc thử Lugol Thuốc thử Ninhydrin 0,1% Phản ứng với bột Na2CO3 Phản ứng Cyanidin Phản ứng với NaOH 10% Hơi NH3 Dung dịch FeCl3 5% Thuốc thử Mayer Thuốc thử Bouchardat Thuốc thử Dragendoff Tạo vết mờ giấy lọc Phản ứng Liebermann Kết + + + + + + + + + + + + + Kết luận Khơng có Khơng có Khơng có Có Khơng có Có Có Có Có Có Có Chú thích: + có phản ứng, - khơng có phản ứng Kết cho thấy Bán hạ roi Việt Nam không chứa glycoside saponin tannins polysaccharide, lại có thành phần đường khử, acid amin, acid hữu cơ, chất béo, alkaloid, flavonoid steroid (bảng 1), kết tương tự kết với nghiên cứu Sianpiar [13] 3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn dịch chiết Bán hạ roi 3.2.1 Hoạt tính chống oxy hố phân đoạn dịch chiết Kết thử nghiệm hoạt tính bẫy gốc tự DPPH phân đoạn dịch chiết Bán hạ roi trình bày Bảng 202 L.Q Thưởng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 199-205 Bảng Kết thử hoạt tính chống oxy hố phân đoạn dịch chiết TT Đối chứng dương Mẫu Cao n-hexan Cao diclometan Cao ethyl acetat Quercetin Giá trị EC50 (µg/ml) hệ DPPH > 128 > 128 94,76 8,11 Kết Bảng cho thấy, phân đoạn dịch chiết n-hexan, diclometan hoạt tính nồng độ 128 µg/ml Phân đoạn dịch chiết ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh thể giá trị DPPH (EC50) 94,76 µg/ml, cao gấp 10 lần so với chất đối chứng dương Quercetin 3.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết Kết Bảng cho thấy cao dịch chiết n-hexan diclometan Bán hạ roi có hoạt tính gây độc tế bào ba dòng ung thư thực nghiệm KB, HepG2, Lu với giá trị IC50 khoảng 92,8 - 107,76 µg/ml sau 72h ni cấy Trong đó, cao dịch chiết diclometan thể hoạt tính tốt với giá trị IC50 100,1 92,8 µg/ml dịng tế bào HepG Lu Dịch chiết ethyl acetat khơng thể hoạt tính nồng độ thử thấp 128 µg/ml Trong nghiên cứu Mankaran [14], dịch chiết Bán hạ roi dung mơi diclometan kìm hãm bệnh máu trắng kết nghiên cứu Choon [4], dịch chiết kìm hãm phát triển tế bào NCI-H23 với giá trị IC50 = 15,4 µg/ml Bảng Hoạt tính ức chế phát triển tế bào dịch chiết Bán hạ roi Mẫu tế bào KB % kìm hãm nồng độ thử 128 18,3 26 IC50 (µg/ml) Hep-G2 % kìm hãm nồng độ thử 128 18,3 26 IC50 (µg/ml) Lu % kìm hãm nồng độ thử IC50 (µg/ml) 128 18,3 26 n-Hexan 55,5 27 106,82 59,5 107,76 54 34,5 105,49 3.3 Phân lập, xác định cấu trúc hợp chất dịch chiết Bán hạ roi Dịch chiết Bán hạ roi dung môi diclomethan lựa chọn để tiến hành chạy cột sắc ký nhằm mục đích phân lập hợp chất tinh khiết dựa hoạt tính tốt Sử dụng hệ dung mơi triển khai sắc ký n-hexan: diclomethan (tỷ lệ 9:1, v/v) hệ phân cực kết thu hai phân đoạn giống Gộp cất loại dung môi phân đoạn thu chất TF1 Diclometan 60,5 12,5 104,0 64 100,1 58,5 32 92,8 Ethyl acetat 16,5 > 128 0 > 128 21 15 > 128 Ellipticine 0,50 0,61 0,47 Chất TF1 chất rắn kết tinh, có nhiệt độ nóng chảy 152 -155oC - Phổ hồng ngoại chất TF1 cho đỉnh hấp thụ nhóm carbonyl liên hợp (1678 cm-1) - Phổ 1H-NMR (Hình 1) cho thấy có hai nhóm metyl với tín hiệu singlet δH = 0,71 (3H, s, CH3-18) δH = 1,18 (3H, s, CH319), ba nhóm metyl gắn với –CH với tín hiệu doublet tại: δH = 0,82 (3H, d, J = 6,7 Hz, CH3-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27), 0,86 (3H, d, J = 7,4 Hz, CH3-21) nhóm metyl gắn với –CH2 với tín hiệu triplet tại: δH = 0,92 L.Q Thưởng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 199-205 (3H, t, J = 6,3 Hz, H-29) Sự có mặt nhóm carbonyl liên hợp thấy phổ 13 C-NMR (Hình 2) với tín hiệu δC =199,598 (s, C-3), 171,653 (s, C-5) 123,754 (d, C-4) tín hiệu δH = 5,72 (1H, br s, H-4) - Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất TF1 có tín hiệu 29 nguyên tử carbon, có nhóm CH3, 11 nhóm CH2, nhóm CH nguyên tử carbon bậc Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion phân tử m/z = 413,37162 [M+H]+ Công thức phân tử chất TF1 C29H48O (M=412) (hình 3) Dựa vào Phổ 1H- 13C-NMR chất Hình Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất TF1 (Stigmast-4-en-3-on) TF1 hoàn toàn phù hợp với phổ chất stigmast-4-en-3-on (Bảng 4) Hợp chất TF1 stigmast-4-en-3-on Hình Cơng thức cấu tạo chất TF1: Stigmast- 4-en- 3-on Hình Phổ 1H-NMR dãn rộng (CDCl3, 500 MHz) chất TF1 Bảng Số liệu phổ 1H- 13C-NMR (CDCl3) hợp chất TF1 Stigmast-4-en-3-on STT 10 11 12 13 14 15 16 δC 35,7 34,0 199,6 123,8 171,7 33,0 32,1 35,7 53,9 38,6 23,1 39,7 42,4 55,9 26,2 28,2 Chất δH (J=Hz) 2,26 (1H, ddd, J=2.4, 3.9, 14.5 Hz, H-2A) 5,72 (1H,br.s, H-4) 203 δC 34,8 32,8 198,5 122,7 170,5 31,9 31,0 34,6 52,7 37,5 22,0 38,5 41,3 54,9 25,0 27,1 Stigmast-4-en-3-on [15] δH(J=Hz) 5,72 (1H, s, H-4) 204 L.Q Thưởng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 199-205 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 56,1 12,0 19,1 36,1 17,4 33,9 24,2 45,9 29,2 19,8 18,7 24,2 12,0 0,71 (3H, s, CH3-18) 1,18 (3H, s, CH3-19) 0,86 (3H, d, J=7,4 Hz, CH3-21) 0,82 (3H, d, J=6,7 Hz, CH3-26) 0,84 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-27) 0,92 (3H, t, J=6,3 Hz, CH3 -29) Kết luận Đã xác định lồi Bán hạ roi có chứa thành phần đường khử, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, alkaloid sterol Các dịch chiết Bán hạ roi dung mơi n-hexan, ethy axetat, diclomethan có hoạt tính chống oxy hố phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh với nồng độ có hiệu bẫy gốc tự DPPH (EC50) 94,76 µg/ml Các dịch chiết n-hexan diclometan Bán hạ roi có hoạt tính gây độc tế bào ba dịng ung thư thực nghiệm KB, HepG2 Lu sau 72 nuôi cấy với giá trị IC50 tương ứng khoảng 92,8 – 107,76 µg/ml Đã tách xác định cấu trúc chất Stigmast4-en- 3-on có dịch chiết diclomethan Bán hạ roi Tài liệu tham khảo [1] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam - tập 3, NXB Trẻ, 1998 [2] Võ Văn Chi, Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, 1997 [3] Võ Văn Chi, Cây cỏ có ích Việt Nam - tập 1, NXB Giáo dục, 1999 [4] Choon SL, Rosemal HMH, Mas NK, Nair MIA, Majid SM and Navaratnam V, T flagelliforme inhibits cancer cell growth in vitro and induces apoptosis: An evaluation by the bioactivity guided approach, J of Ethnopharmacology,118, 14–20, 2008 [5] Chee YC, Kit LC, Teng WS, Yukio H and Koichi T, The cytotoxicity and chemical constituents of the hexane fraction of Typhonium flagelliforme (Araceae), J Ethnopharmacol., 77: 129-131, 2001a 54,9 10,9 18,0 35,0 16,3 32,9 23,1 44,7 27,1 18,7 17,6 23,1 10,9 0,71(3H, s, H-18) 1,18(3H, s, H-19) 0,84 (3H, d, 7,4Hz, H-21) 0,82 (3H, d, 6,7Hz, H-26) 0,84 (3H, d, 7,0Hz, H-27) 0,92(3H, t, J=6,4Hz, H-29) [6] Chee YC, Kit LC, Koichi T and Hideji I, Cytotoxic activity of Typhonium flagelliforme (Araceae) Phytother Res., 15: 160-162, 2001b [7] Huang P, Karagianis G and Waterman PG, Chemilcal constituents from Typhonium flagelliforme Zhongyaocai, 27: 173-175, 2004 [8] Nguyễn Thượng Dong, Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học Kỹ thuật, 2008 [9] Bộ môn Dược liệu, Thực tập dược liệu phần kiểm nghiệm phương pháp hóa học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, 2007 [10] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học Hà Nội, 1985 [11] Kai M, Klaus HV, Sebastian L, Ralf H, Andreas R and Hansen UP, Determination of DPPH radical oxidation caused by methanolic extracts of some microalgal species by linear regression analysis of spectrophotometric measurements Sensors, 7, 2080-2095, 2007 [12] Scudiero DA, Shoemaker RH, Kenneth DP, Monks A, Tierney S, Nofziger TH, Currens MJ, Seniff D and Boyd MR, Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines Cancer Reseach 48: 4827-4833, 1988 [13] Sianipar NF, Maarisi W and Valencia A, Toxic activities of hexane extract and column chromatography fractions of rodent tuber plant (T flagelliforme Lodd.) on Artemia salina, Indones J Agric Sci 14(1), 1–6, 2013 [14] Mankaran S, Dinesh K, Deepak S and Gurmeet S, T flagelliforme: A multipurpose plant, Int Res J Pharm (3), 45-48, 2013 [15] Liew Sook Yee, Studies on chemical constituens and biological activities of Nauclea Offcinalis and Nauclea Subdita Thesis submitted in fulfilment of the requirements for the degree of doctor of Philosophy pp 222-228 L.Q Thưởng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 199-205 205 Study on Biological Activities of Extracted Fractions from Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume Le Quy Thuong1,2, Bach Tuyet Mai1,3, Nguyen Minh Chau1, Le Thi Phuong Hoa4, Nguyen Quang Huy1 Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Phu Tho College of Medicine and Pharmacy, 2201 Avenue Hung Vuong, Viet Tri, Phu Tho, Vietnam Ha Dong College of Medicine, 39 Nguyen Viet Xuan, Quang Trung, Hanoi, Vietnam Faculty of Biology, Hanoi National University of Education, 136 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Abstract: Typhonium flagelliforme is a medicinal plant that has variety of uses In medicinal traditional T flagelliforme is used to treatment cough, headache, stomach pain chronic, and tracheitis Moreover, use fresh bulbs treatment furuncle, the bites of poisonous insects The active components in T flagelliforme are flavonoids In this study, the T flagelliforme extract was obtained by methanol to determine the chemical composition Then, The extracts of methanol are extracted with polarization increases gradually solvents such as haxane, dichloromethane and ethyl acetate Determination of antioxidant activity, cytotoxic activity of extracted fractions Results obtained showed that the chemical compositions by the qualitative reaction preliminary were identified from T flagelliforme containing reducing sugars, amino acids, organic acids, flavonoids, alcaloids, sterols The antioxidant capacity of the ethyl acetat fraction reached 94.76 μg/ml, 10 times higher than the positive control is Quercetin Cytotoxic activity of the haxane and diclomethane extracted fractions from T flagelliforme exhibited cytotoxic activity on all three experimental cancers cell lines: KB, HepG2, Lu after 72h of culture with IC50 values range from 92.8 to 107.76 μg/ml From dichlomethane extracted of T flagelliforme was purified TF1 as Stigmast-4-en- 3-on Keywords: T flagelliforme, antioxidant, cytotoxic ... định cấu trúc bán hạ roi [7] Tuy Việt Nam chưa có nghiên cứu thành phần hoạt tính sinh học Bán hạ roi Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Các mẫu thân, lá, rễ củ Bán hạ roi thu hái Phú... tương tự kết với nghiên cứu Sianpiar [13] 3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn dịch chiết Bán hạ roi 3.2.1 Hoạt tính chống oxy hoá phân đoạn dịch chiết Kết thử nghiệm hoạt tính bẫy gốc tự... luận 3.1 Khảo sát thành phần hoá học Bán hạ roi Thành phần hoá học Bán hạ roi xác định từ dịch chiết dung mơi khác trình bày Bảng Bảng Kết định tính nhóm chất Bán hạ roi TT Nhóm chất Glycosid Saponin