Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài vi tảo silic phân lập ở rừng ngập mặn xuân thủy nam định

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP VIỆN NĂM 2010 “Nghiên cứu đặc điểm sinh học số loài vi tảo silic phân lập rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định” Mã số: 04 Chủ trì đề tài : Nguyễn Thị Hồi Hà Hà Nội, 2010 BÁO CÁO TĨM TẮT Tên đề tài Nghiên cứu đặc điểm sinh học số loài vi tảo silic phân lập rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định Các thành viên tham gia đề tài Chủ trì đề tài Họ tên: Nguyễn Thị Hồi Hà Đơn vị cơng tác: Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học – ĐHQGHN Học hàm, học vị: Tiến sỹ Điện thoại: 04 37547488 Email: nguyenhoaiha@yahoo.com Chức vụ công tác nay: Trƣởng phịng Các thành viên KS.Phạm Thị Bích Đào Cơ quan chủ trì đề tài Tên quan: Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học – ĐHQGHN Địa chỉ: Nhà E2, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội Điện thoại: 043 7547407 Fax: 043 7547407 Email: imbt@vnu.edu.vn Khả sử dụng sở vật chất, trang thiết bị quan để thực đề tài Phịng thí nghiệm Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội Tóm tắt tổng quan đề tài Việt Nam có hệ thống đất ngập nƣớc cửa sơng ven biển phong phú đa dạng Đất ngập nƣớc đa dạng sinh học đất ngập nƣớc gắn liền với dân tộc Việt Nam suốt hàng ngàn năm lịch sử Đây vùng trọng điểm cho phát triển kinh tế xã hội, mang lại nhiều sản phẩm phục vụ cho sống ngƣời dân, cho nhu cầu phát triển kinh tế xuất khẩu.Trong thời gian gần đây, nƣớc ta có nhiều cố gắng việc nghiên cứu, quản lý bảo tồn khu rừng ngập mặn ven biển, nhiên cịn gặp nhiều khó khăn, bất cập, đặc biệt việc chƣa hoàn thiện hệ thống phân loại nghiên cứu hệ thống sinh vật vùng Với việc nghiên cứu hoàn thành việc phân loại thành phần loài vùng cửa sông ngập nƣớc sở để xác định nguồn gen, họ gen quý cần bảo tồn vùng nhƣ có đƣợc hƣớng mở cho ngành kinh tế nông nghiệp phát triển khu bảo tồn Rừng ngập mặn hệ sinh thái có suất cao vùng cửa sơng ven biển nhiệt đới Không nguồn lợi lâm sản, chim thú, nơi cung cấp hải sản có giá trị kinh tế tính đa dạng sinh học cao Vƣờn quốc gia Xuân Thủy (còn gọi Rừng ngập mặn Xuân Thủy) khu bảo tồn dự trữ sinh đất rừng ngập mặn, có lịch sử phát triển lâu đời Sau gia nhập “Công ƣớc Ramsar” (01/1989), nơi trở thành Khu Ramsar thứ 50 giới, khu vực Đông Nam Á Việt Nam suốt 16 năm Tháng 10/2004, UNESCO công nhận Khu dự trữ sinh liên tỉnh đồng ven biển châu thổ sông Hồng Khu dự trữ sinh giới (đây khu thứ 3, sau Cần Giờ Cát Tiên) Trong đó, Vƣờn quốc gia Xuân Thủy vùng lõi có tầm quan trọng đặc biệt Khu dự trữ sinh giới Thực vật phù du mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn sinh vật thủy sinh Chúng mồi ăn động vật phù du, loại ấu trùng, loại cá, loại động vật thân mềm ăn lọc… Tảo silic thƣờng chiếm khoảng 60 – 70% số loài nhƣ sinh vật lƣợng Nhất vùng biển ven bờ, vùng cửa sông ven biển, chúng ln chiếm ƣu tuyệt đối, có nơi 84% số loài tới 99% sinh vật lƣợng Tình hình phân bố tảo silic thƣờng phản ánh đầy đủ xu chung toàn thực vật phù du Có thể nói thực vật phù du nói chung tảo silic nói riêng có ảnh hƣởng lớn đến độ đa dạng sinh học, tiềm hệ sinh thái thủy sinh vùng Mục tiêu đề tài Lƣu giữ bảo tồn nguồn gen đa dạng vi tảo silic Tóm tắt nội dung nghiên cứu đề tài - Phân lập, tuyển chọn số chủng vi tảo silic rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định - Xác định đặc điểm sinh học nhƣ hình thái tế bào, thành phần dinh dƣỡng vị trí phân loại chủng tuyển chọn đƣợc - Lƣu giữ nguồn gen chủng vi tảo silic sƣu tập giống phòng Sinh học tảo Kết đề tài - Từ mẫu thu thập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam Định, phân lập tuyển chọn lƣu giữ ba chủng vi tảo ký hiệu C2 thuộc chi Chaetoceros N8, N9 thuộc chi Navicula Dựa vào đặc điểm hình thái học quan sát đƣợc kính hiển vi quang học khả phát triển vi tảo cần nghiên cứu mơi trƣờng chuẩn đốn, định danh sơ ba chủng vi tảo Chaetoceros C2; Navicula N8; Navicula N9 thuộc loài Chaetoceros muelleri; Navicula tuscula Navicula radiosa - Môi trƣờng ASW môi trƣờng dinh dƣỡng tốt cho sinh trƣởng phát triển vi tảo chủng Chaetoceros C2, Navicula N9 với mật độ tế bào đạt cao 67.22 ×106/ml 137.6×106/ml Vi tảo chủng Navicula N8 sinh trƣởng tốt môi trƣờng ESM với mật độ tế bào cao đạt 129×106/ml - Chủng vi tảo Chaetoceros C2 có chứa thành phần acid béo khơng no quan trọng EPA (chiếm đến 24.759%), AA (7.845%); chủng Navicula N8 Navicula N9 có tỉ lệ acid palmitic lớn chiếm 52.557% 58.303% Chủng Navicula N8 có chứa hàm lƣợng acid arachidonic (AA) 0.764%, chủng Navicula N9 có hàm lƣợng acid oleic chiếm 1.188% Sự đa dạng thành phần loại acid béo (từ 17- 19 loại acid béo) cho thấy ba chủng vi tảo ứng dụng cho ni trồng thủy sản, làm tăng chất lƣợng giống Tình hình sử dụng kinh phí đề tài - Kinh phí đƣợc cấp: 25.000.000 đồng - Kinh phí thực hiện: 25.000.000 đồng Hà Nội, ngày Chủ trì đề tài tháng Thủ trƣởng đơn vị (ký tên đóng dấu) năm 2010 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY- NAM ĐỊNH 1.2 GIỚI THIỆU VỀ TẢO SILIC 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc điểm phân bố vai trò tảo silic CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 2.1.3 Hóa chất 2.1.4 Máy móc dụng cụ 2.2 MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY 2.3 PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI TẢO 2.3.1 Phƣơng pháp phân lập micropipette 2.3.2 Phƣơng pháp tách khiết đĩa thạch 2.4 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA VI TẢO 10 2.5 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO 11 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO 13 3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI TẢO SILIC 14 3.2.1 Đặc điểm hình thái 14 3.2.1.1 Chi Chaetoceros 14 3.2.1.2 Chi Navicula 15 3.2.2 Lựa chọn mơi trƣờng ni cấy thích hợp cho chủng vi tảo silic 16 3.2.3 Thành phần acid béo ba chủng vi tảo silic 19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG Danh mục hình Hình 1.1 Bản đồ vệ tinh rừng ngập mặn Xuân Thủy Hình 2.1 Các điểm lấy mẫu đƣợc định vị đồ Hình 3.1 Phân lập vi tảo đĩa thạch 13 Hình 3.2 Ni vi tảo lọ Penicillin 13 Hình 3.3 Ni sinh khối tảo bình tam giác dung tích 100ml 13 Hình 3.4 Các chi tảo silic phân lập đƣợc rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định 14 Hình 3.5 Chaetoceros C2 15 Hình 3.7 Navicula N9 16 Hình 3.8 Động thái sinh trƣởng ba chủng vi tảo silic 18 môi trƣờng khác 18 Hình 3.9 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Chaetoceros C2 21 22 Hình 3.10 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Navicula N8 22 Hình 3.11 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Navicula N9 22 Danh mục bảng Bảng 3.1 Khả sinh trƣởng ba chủng vi tảo silic môi trƣờng khác 17 Bảng 3.2 Thành phần acid béo ba chủng vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8, Navicula N9 .19 MỞ ĐẦU Việt Nam có hệ thống đất ngập nƣớc cửa sông ven biển phong phú đa dạng Đất ngập nƣớc đa dạng sinh học đất ngập nƣớc gắn liền với dân tộc Việt Nam suốt hàng ngàn năm lịch sử Đây vùng trọng điểm cho phát triển kinh tế xã hội, mang lại nhiều sản phẩm phục vụ cho sống ngƣời dân, cho nhu cầu phát triển kinh tế xuất khẩu.Trong thời gian gần đây, nƣớc ta có nhiều cố gắng việc nghiên cứu, quản lý bảo tồn khu rừng ngập mặn ven biển, nhiên cịn gặp nhiều khó khăn, bất cập, đặc biệt việc chƣa hoàn thiện hệ thống phân loại nghiên cứu hệ thống sinh vật vùng Với việc nghiên cứu hoàn thành việc phân loại thành phần lồi vùng cửa sơng ngập nƣớc sở để xác định nguồn gen, họ gen quý cần bảo tồn vùng nhƣ có đƣợc hƣớng mở cho ngành kinh tế nông nghiệp phát triển khu bảo tồn Rừng ngập mặn hệ sinh thái có suất cao vùng cửa sông ven biển nhiệt đới Không nguồn lợi lâm sản, chim thú, nơi cung cấp hải sản có giá trị kinh tế tính đa dạng sinh học cao Vƣờn quốc gia Xuân Thủy (còn gọi Rừng ngập mặn Xuân Thủy) khu bảo tồn dự trữ sinh đất rừng ngập mặn, có lịch sử phát triển lâu đời Sau gia nhập “Công ƣớc Ramsar” (01/1989), nơi trở thành Khu Ramsar thứ 50 giới, khu vực Đông Nam Á Việt Nam suốt 16 năm Tháng 10/2004, UNESCO công nhận Khu dự trữ sinh liên tỉnh đồng ven biển châu thổ sông Hồng Khu dự trữ sinh giới (đây khu thứ 3, sau Cần Giờ Cát Tiên) Trong đó, Vƣờn quốc gia Xuân Thủy vùng lõi có tầm quan trọng đặc biệt Khu dự trữ sinh giới Thực vật phù du mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn sinh vật thủy sinh Chúng mồi ăn động vật phù du, loại ấu trùng, loại cá, loại động vật thân mềm ăn lọc… Tảo silic thƣờng chiếm khoảng 60 – 70% số loài nhƣ sinh vật lƣợng Nhất vùng biển ven bờ, vùng cửa sông ven biển, chúng ln chiếm ƣu tuyệt đối, có nơi 84% số loài tới 99% sinh vật lƣợng Tình hình phân bố tảo silic thƣờng phản ánh đầy đủ xu chung toàn thực vật phù du Có thể nói thực vật phù du nói chung tảo silic nói riêng có ảnh hƣởng lớn đến độ đa dạng sinh học, tiềm hệ sinh thái thủy sinh vùng Chính vậy, tiến hành thực : “Nghiên cứu đặc điểm sinh học số loài vi tảo silic phân lập rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định” Với mục tiêu: Lƣu giữ bảo tồn nguồn gen đa dạng vi tảo silic Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn số chủng vi tảo silic rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định - Xác định đặc điểm sinh học nhƣ hình thái tế bào, thành phần dinh dƣỡng vị trí phân loại chủng tuyển chọn đƣợc - Lƣu giữ nguồn gen chủng vi tảo silic sƣu tập giống phòng Sinh học tảo CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY- NAM ĐỊNH Theo định nghĩa công ƣớc Ramsar (công ƣớc vùng đất ngập nƣớc có tầm quan trọng quốc tế): “Những vùng đầm lầy, than bùn vùng nƣớc, tự nhiên hay nhân tạo, thƣờng xuyên hay tạm thời, nƣớc chảy hay nƣớc tù, nƣớc ngọt, nƣớc lợ hay nƣớc biển, kể vùng nƣớc biển có độ sâu không 6m, thủy triều thấp, vùng đất ngập nƣớc”, rừng ngập mặn hệ sinh thái đất ngập nƣớc đặc trƣng vùng biển nhiệt đới cận nhiệt đới [3] Hình 1.1 Bản đồ vệ tinh rừng ngập mặn Xuân Thủy Rừng ngập mặn Xuân Thủy (RNMXT) thuộc địa giới huyện Giao thủy tỉnh Nam Định với tổng diện tích tự nhiên 7100 bao gồm phần cồn Ngạn, tồn cồn Lu cồn Xanh Vùng đệm cịn lại bao gồm phần cồn Ngạn (ở vành lƣợc), tồn bãi diện tích năm xã: Giao Thiện, Giao An, Giao Lạc, Giao Xuân, Giao Hải với tổng diện tích tự nhiên lên tới 8000 • Về địa hình: Địa hình tự nhiên RNMXT đƣợc kiến tạo quy luật bồi lắng phù sa vùng cửa sông ven biển Các bãi bồi lớn xen kẽ với dịng sơng tạo nên cảnh quan đặc thù khu vực • Về khí hậu: RNMXT nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa chịu ảnh hƣởng trực tiếp biển Do nằm vùng vĩ độ thấp nên khu vực chịu chi phối chế độ nội chí tuyến, nhiệt độ vùng cao • Về thổ nhƣỡng: RNMXT vùng đất đƣợc bồi tụ phù sa sơng Hồng, đất chƣa phân hóa rõ rệt cịn giữ ngun tính chất lớp đất bồi tụ, có nhiều lớp xen kẽ, đáy gồm bùn lẫn sét cát mịn Phía rừng đáy cịn đƣợc phủ lớp xác thực vật tạo nên lớp mùn hữu giàu dinh dƣỡng [5] • Về sinh thái: RNMXT có vai trị cố định phù sa để tạo nên cồn bãi mới, tạo nguồn lƣợng sơ cấp, làm vƣờn ƣơm cung cấp thức ăn dồi cho loài thủy sinh, đồng thời nơi cƣ ngụ nhiều loài động vật hoang dã, có nhiều lồi thú nƣớc q hiếm: mèo biển, cáo biển, rái cá RNMXT nơi có đa dạng sinh học cao thể qua số lƣợng lớn loài động vật, thực vật, vi sinh vật Theo số liệu Sở thủy sản Nam Định RNMXT có 104 lồi thực vật nổi, mùa khơ 1996 có kết thu mẫu 37 loài thuộc ngành tảo: + Ngành tảo Silic (Bacillariophyta): 15 chi, 27 loài chiếm 73% + Ngành tảo Giáp (Pirophy): chi, loài, chiếm 10.8% + Ngành tảo Lam (Cyanophyta): chi, loài, chiếm 8% + Ngành tảo Lục (Chlorophyta): chi, lồi, chiếm 8% Hai chi có số lồi cao thuộc ngành tảo Silic, chi lại chiếm từ 1–2 loài Kết thu mẫu mùa mƣa (1996) đƣợc 40 loài theo tỷ lệ: + Ngành tảo Silic: 15 chi, 30 loài, chiếm 75% + Ngành tảo Giáp: chi, loài, chiếm 12.5% + Ngành tảo Lam: chi, loài, chiếm 2% + Ngành tảo Lục: chi, loài chiếm 7.5% Số tảo Giáp, tảo Lục, tảo Lam khơng có giá trị làm thức ăn cho thủy hải sản chiếm 25% tổng số loài Mặc dù số lồi phát cịn thấp nhƣng lại có mặt nhiều lồi ƣu vùng cửa sông ven biển, ngành tảo Silic chiếm tỷ lệ lớn tạo sinh khối lớn làm thức ăn phong phú cho loài động vật thủy sinh Giá trị bảo tồn đa dạng sinh học vƣờn quốc gia thể qua mặt sau: + Là nơi dự trữ nguồn gen, di sản thiên nhiên cho hậu Buồng đếm có chứa tảo đƣợc đƣơa lên kính hiển vi quan sát vật kích 40, thị kính 10 Đối với mẫu đếm đặc đếm xác đƣợc pha lỗng trơƣớc đếm nhân hệ số pha lỗng tính kết Đối với lồi tảo có khả chuyển động cần phải đơƣợc cố định hố chất (lugol) hay làm yếu tế bào máy lắc Vortex Trên sở số liệu thu đƣợc qua ngày đếm, lập đƣờng cong sinh trƣởng cách đặt trục tung số mật độ tế bào, đặt trục hồnh số thời gian (ngày) ni tảo 2.5 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO Xác định thành phần acid béo [13] Lấy 50mg mẫu cho vào ống thuỷ tinh nút vặn (cỡ 13mm x 100mm) Alkal hoá 1,0ml chất phản ứng I (reagent I, gồm 15g sodium hydroxide (NaOH), 50ml methanol 50ml Milli- Q) Tế bào đƣợc thuỷ phân 100oC nồi nhiệt khô phút Sau làm huyền phù Vortex giây tiếp tục cho thuỷ phân 25phút Dịch thuỷ phân đƣợc làm lạnh nhiệt độ phịng Methyl hố dung dịch alkal với 0,2ml chất phản ứng (65ml 6N hydrochloric acid 55ml methanol) Sau methyl hóa, giữ 80oC nồi cách thuỷ khoảng 10 phút Dung dịch methyl hoá đƣợc bổ sung 1,25ml chất thử (gồm 50ml n-hexane-methyl tert butyl ether, 1:1, v/v) đƣợc trộn máy lắc 2000rpm 10 phút Dịch nhớt phía đƣợc loại bỏ Dung dịch đƣợc bổ sung 3ml thuốc thử (1,2g sodium hydroxyde 100ml Milli-Q) đƣợc trộn tay phút Ly tâm 2,500 rpm 10 phút Dịch đƣợc chuyển sang ống thuỷ tinh có nút vặn cho bay khí nitrogen thơng thƣờng tới khơ Cuối cùng, toàn dịch mẫu đƣợc làm tan với 50?l diethyl ether 300 (hoặc acetone - 300, n-hexane) Toàn mẫu đƣợc chấm vào sắc ký mỏng (TLC) đƣợc đặt bồn thuỷ tinh chứa 100ml n-hexane-diethyl ether (4:1, v/v) 30 – 45 phút Thành phần acid béo đƣợc vệt iot (I2) 30 – 45 phút Acid béo có cực khơng cực xuất nhƣ nhữngvệt xanh Những vệt đƣợc cạo đƣợc rửa giải hai lần diethyl ether 300 Trộn dung dịch silicagel máy lắc 2000 rpm 10 phút ly tâm 2500 rpm 10 phút Dung dịch đƣợc bay khí nitrogen thơng thƣờng tới khơ Mẫu đƣợc hồ tan trở lại với 50 µl chất phản ứng Dùng pipet nhỏ vào lọ nhỏ GC có nút đậy Sau đem phân tích máy sắc ký khí (gas chromatography) Cơng thức tính kết quả: 11 C Trong : [Asp] x[Cst ]x [Ast ] R C : nồng độ acid béo có mẫu [Cst] : chất chuẩn R : Độ thu hồi phƣơng pháp [Asp ] : diện tích trung bình cấu tử có mẫu [Ast] : Là diện tích trung bình cấu tử có chất chuẩn 12 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO Các mẫu nƣớc đƣợc lấy từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ - Nam Định Vi tảo đƣợc nuôi cấy làm giàu môi trƣờng dịch thể F/2 bình tam giác 50ml Sau đó, tiến hành cấy trải đĩa thạch phân lập pipette Pasteur Ni cấy nhiệt độ phịng, với cƣờng độ ánh sáng 10000 – 20000 Lux, soi kiểm tra mẫu Sau - 12 ngày, đĩa thạch xuất khuẩn lạc riêng rẽ màu vàng nâu, tách riêng khuẩn lạc cho vào lọ Penicillin dung tích 20 ml Với tế bào đích phân lập phƣơng pháp micropipet, nuôi cấy lọ Penicillin sau 15-20 ngày thấy dịch nuôi cấy lọ xuất màu vàng nâu Sau đó, tiến hành quan sát độ tinh vi tảo Lặp lại qui trình thu đƣợc chủng vi tảo khiết Kết đƣợc trình bày hình 3.1, 3.2 Hình 3.2 Ni vi tảo lọ Penicillin Hình 3.1 Phân lập vi tảo đĩa thạch Sau trình phân lập tuyển chọn thu đƣợc 14 chủng vi tảo silic Các chủng đƣợc giữ ống thạch nghiêng bảo quản 40C để dùng cho nghiên cứu Tiếp tục nuôi giữ giống tảo bình tam giác dung tích 100 ml Hình 3.3 Ni sinh khối tảo bình tam giác dung tích 100ml 13 3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI TẢO SILIC Để mô tả xác định tên chủng vi tảo, dựa vào số đặc điểm hình thái chúng Các hình thái đƣợc phát vào khả phát triển vi tảo cần nghiên cứu môi trƣờng chuẩn đoán đƣợc thừa nhận sử dụng phƣơng pháp soi kính hiển vi quang học đo kích thƣớc tế bào Kết quả: qua việc so sánh hình thái quan sát đƣợc kính hiển vi quang học với khóa phân loại “Tảo silic phù du biển Việt Nam” [6] “The plankton of south Viet Nam Fresh Water and Marine Plankton” [8], đ ịnh danh sơ bộ ch ủng vi tảo silic phân lập đƣợc rừng ngập mặn Xuân Thủy gồm có chi và 10 lồi Kết quả đƣợc thể hiện biểu đồ hình 3.4 7.69% 23.08% Chaetoceros 7.69% Gyrosigma 7.69% Amphiprora Navicula Nitzschia Melosira 23.08% 7.69% 7.69% 15.38% Skeletonema Chưa định danh Hình 3.4 Các chi tảo silic phân lập đƣợc rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định Hiện hai chi tảo silic Chaetoceros Navicula đƣợc ứng dụng rộng rãi làm thức ăn cho ƣơng ni ấu trùng lồi thủy sản có giá trị kinh tế cao nhƣ: hầu, tu hài, ngao, vẹm, bào ngƣ, cá măng… Các chi vi tảo đƣợc ni mơi trƣờng nhân tạo tinh khiết nuôi môi trƣờng tự nhiên có bổ sung thêm thành phần khống Đặc biệt, chúng sinh trƣởng môi trƣờng sinh thái ngập mặn nên khả thích ứng với thay đổi mơi trƣờng cao Chính vậy, tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái đặc điểm sinh học chi Chaetoceros chi Navicula để xác định tiềm ứng dụng cho nuôi trồng thủy hải sản bảo tồn nguồn gen vi tảo 3.2.1 Đặc điểm hình thái 3.2.1.1 Chi Chaetoceros 14 Ngành: Heterokontophyta Lớp: Bacillariophyceae Bộ: Centrales Họ: Chaetocerotaceae Chi: Chaetoceros Chaetoceros C2 Tế bào nhỏ thƣờng sống riêng lẻ, nối thành chuỗi 2, tế bào Mặt vỏ tế bào hình bầu dục gần trịn lồi lên Mặt vịng vỏ rộng hình chữ nhật gần vng, khơng thấy đai Lông gai nhỏ, dài thẳng mọc mép mặt vỏ vƣơn gần song song với mặt phẳng vỏ Mỗi tế bào có thể sắc tố hình hạt hình Chiều dài tế bào 8-12 μm, bề rộng 5-7 μm Chủng mang đặc điểm chi Chaetoceros, nên bƣớc đầu định danh sơ chủng C2 thuộc lồi Chaetoceros muelleri [8] Hình 3.5 Chaetoceros C2 3.2.1.2 Chi Navicula Ngành: Hetorokontophyta Lớp: Bacillariophyceae Bộ: Naviculales Họ: Naviculaceae Chi: Navicula 15 Chủng Navicula N8 Tế bào nhỏ, vỏ tƣơng đối dày, sống riêng lẻ Mặt vỏ tế bào hình bầu dục, tế bào khơng có cấu tạo hình xƣơng thuyền mà có dạng đối xứng hai bên theo trục, hai đầu thắt nhỏ lại lồi ra, đầu hình núm trịn Rãnh dài hẹp, thẳng, hai đầu mặt vỏ, phình to cách tƣơng đối xa Mỗi tế bào có hai thể sắc tố dạng bầu dục gần tròn Chiều dài tế bào 20 - 25 μm bề rộng -16 μm Hình 3.6 Navicula N8 Chủng mang đặc điểm chi Navicula (chi tảo hình thuyền), lồi Navicula tuscula [8] Do vậy, ta sơ xác định chủng N8 loài Navicula tuscula Chủng Navicula N9 Các cá thể có tế bào tƣơng đối lớn , vỏ dày, sống đơn độc Mặt vỏ tế bào hình thoi dài, hai đầu trịn Hai đầu mặt vỏ phình to rõ ràng cách xa, hai mặt vỏ có cấu trúc giống Chiều dài tế bào 40-44 μm, bề rộng 8-10 μm Chủng mang đặc điểm chi Navicula, loài Navicula radiosa [6] Qua đặc điểm trên, sơ xác định chủng N9 lồi Navicula radiosa Hình 3.7 Navicula N9 3.2.2 Lựa chọn mơi trƣờng ni cấy thích hợp cho chủng vi tảo silic Đối với chủng tảo khác thƣờng có mơi trƣờng dinh dƣỡng cho sinh trƣởng tối ƣu khác Sự khác số loại chất hàm lƣợng chất dinh dƣỡng việc nuôi cấy chủng hai vấn đề phải đƣợc quan tâm Một nghiên cứu khởi đầu cho chủng tảo 16 đƣợc phân lập, nghiên cứu này, lựa chọn ba môi trƣờng ASW, F/2, ESM nuôi tĩnh chủng vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8, Navicula N9 để tìm hiểu tác động mơi trƣờng dinh dƣỡng lên sinh trƣởng chủng Các điều kiện nuôi dƣỡng đồng Cứ sau hai ngày tiến hành lấy mẫu để kiểm tra lần Kết thu đƣợc trình bày bảng 3.1 hình 3.8 Bảng 3.1 Khả sinh trƣởng ba chủng vi tảo silic môi trƣờng khác Mật độ tế bào (x 106/ml) Chủng Môi trƣờng Ngày cấy mẫu Ngày thứ ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ 10 Ngày thứ 12 ASW 0.31 1.18 9.42 19.31 43.5 67.22 31.88 0.31 0.66 4.08 11 20.71 18.36 16.21 0.31 1.12 6.66 17.31 36.48 25.37 19.97 ASW 2.5 3.5 9.2 20.2 50 32 26 F/2 2.5 4.8 13.5 31 78 48 37 ESM 2.5 5.2 15.6 43 129 98 78 ASW 3.2 35.2 49.6 137.6 107.2 98.2 F/2 3.2 4.8 32.8 60.8 88 43.2 33.1 ESM 3.2 35.2 44.8 128 68.8 53.2 Chaetoceros F/2 C2 ESM Navicula N8 Navicula N9 Qua kết đƣợc thể hình 3.8 bảng 3.1 nhận thấy ba chủng vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8, Navicula N9 sinh trƣởng ba môi trƣờng nuôi cấy Trong ngày đầu, chƣa thấy phát triển mạnh vi tảo Mật độ tế bào môi trƣờng tăng nhanh dần ngày nuôi cấy thứ Mật độ tế bào đạt cao khoảng ngày nuôi cấy thứ đến thứ 10 q trình thí nghiệm Có thể nhận thấy vi tảo chủng Chaetoceros C2 sinh trƣởng tốt môi trƣờng ASW Ở ngày nuôi cấy thứ 10, mật độ tế bào đạt mức cao 67.22 ×106/ml Ngay sau đạt mật độ cao nhất, mật độ tế bào giảm mạnh ngày Ở ngày nuôi cấy thứ 12, mật độ tế bào mơi trƣờng ASW cịn đạt mức 31.88×106/ml, giảm nửa so với mật độ tế bào cao ngày nuôi cấy thứ 10 Ngày nuôi cấy thứ 8, mật độ tế bào đạt mức cao mơi trƣờng F/2 va ESM 20.71×106/ml 36.48×106/ml, điểm sinh trƣởng cao mơi trƣờng F/2 va ESM đạt đƣợc 17 ngày thứ nhanh môi trƣờng F/2 nhƣng mật độ tế bào cao nửa so với điểm sinh trƣởng cao môi trƣờng ASW ngày thứ 10 Chủng vi tảo Navicula N8, ngày nuôi cấy thứ 8, mật độ tế bào đạt mức cao ba môi trƣờng Vi tảo Navicula N8 sinh trƣởng tốt môi trƣờng ESM (mật độ tế bào cao đạt 129×106/ml), sau môi trƣờng F/2 (mật độ tế bào cao đạt 78×106/ml)và cuối mơi trƣờng ASW (mật độ tế bào cao đạt 50×106/ml) Sau đạt mật độ cao nhất, mật độ tế bào liên tục giảm ngày nuôi cấy thứ 10 12 Mật độ tế bào (x 106/ml) Mật độ tế bào (x 106/ml) 140 120 100 80 60 40 20 0 10 12 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Thời gian nuôi cấy (ngày) Navicula N8 Mật độ tế bào (x 106/ml) 10 12 Thời gian nuôi cấy (ngày) Navicula N9 Chaetoceros C2 80 70 60 50 ASW 40 F2 30 ESM 20 10 0 10 12 Thời gian ni cấy (ngày) Hình 3.8 Động thái sinh trƣởng ba chủng vi tảo silic môi trƣờng khác Chủng vi tảo Navicula N9, sinh trƣởng tƣơng đối đồng hai môi trƣờng ASW ESM, sinh trƣởng môi trƣờng F/2 Mật độ tế bào đạt mức cao ba môi trƣờng ASW, F/2 ESM ngày ni cấy thứ lần lƣợt 137.6×106/ml; 88×106/ml; 128×106/ml Trên đồ thị hình 3.8 dễ dàng nhận thấy chệnh lệch mật độ tế bào đạt mức cao hai môi trƣờng ASW ESM không đáng kể, nhƣng sau đạt mật độ cao ngày nuôi cấy thứ 10, môi trƣờng ESM, mật 18 độ tế bào giảm nhanh 68.8×106/ml, giảm gần nửa so với ngày thứ Trong đó, mật độ tế bào ngày ni cấy thứ 12 kết thúc q trình thí nghiệm môi trƣờng ASW đạt mật độ tế bào 98.2×106/ml Mơi trƣờng ASW đƣợc chọn mơi trƣờng dinh dƣỡng tốt cho sinh trƣởng phát triển vi tảo chủng Chaetoceros C2, Navicula N9 Do ASW môi trƣờng nƣớc biển nhân tạo (nƣớc muối), hàm lƣợng chất dinh dƣỡng muối không đầy đủ nƣớc biển tự nhiên nhƣng điều lại hồn tồn thích ứng với thay đổi khu hệ rừng ngập mặn dƣới điều kiện khác Môi trƣờng dinh dƣỡng tốt cho vi tảo chủng Navicula N8 mơi trƣờng ESM, thay bổ sung thành phần vi lƣợng môi trƣờng ESM sử dụng nƣớc chiết đất Chứng tỏ ba chủng vi tảo có thích nghi cao điều kiện thay đổi, điều mở tiềm ứng dụng ni sinh khối lớn làm thức ăn cho nuôi trồng thủy sản 3.2.3 Thành phần acid béo ba chủng vi tảo silic Bảng 3.2 Thành phần acid béo ba chủng vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8, Navicula N9 Tỷ lệ % (% tổng số acid béo) STT Acid béo Tên thƣờng gọi Chaetoceros C2 Navicula N8 Navicula N9 C4:0 Butyric acid 0.171 0.122 C10:0 Capric acid 0.325 0.110 C12:0 Lauric acid 0.642 0.197 C14:0 Myristic acid 1.910 9.691 3.123 C14:1n-5 Myristolenic acid 18.086 0.798 0.217 C15:0 0.745 C15:1n-5 Hormelic acid 0.096 0.703 0.352 C16:0 5.532 52.557 58.303 C16:1n-7 Palmitoleic acid 15.232 13.694 25.290 10 C16:1n-9 Ambrettolic acid 2.200 11 C17:0 9.519 1.200 0.178 12 C17:1n-7 Heptadecenoic acid 1.493 0.230 Convolvulinolic acid Palmitic acid Margric acid 19 13 C18:0 Stearic acid 1.462 3.773 1.259 14 C18:1n-7 Asclepic acid 3.744 8.623 1.934 15 C18:1n-9 Oleic acid 16 C18:2n-6 Linoleic acid 17 C18:3n-3 α-Linolenic acid 18 C18:3n-6 γ-Linolenic acid 1.122 19 C18:4n-3 Moroctic acid 0.216 20 C18:5n-3 Octadecapentaenoic acid 21 C20:0 22 C20:1n-9 Gondoic acid 0.256 23 C20:1n-7 Paullinic acid 0.099 24 C20:4n-3 Eicosatetraenoic acid 25 C20:4n-6 Arachidonic acid (AA) 7.845 26 C20:5n-3 Eicosapentaenoic acid (EPA) 24.759 27 C22:0 Behenic acid 1.044 28 C22:4n-6 Adrenic acid 0.341 29 C24:0 1.188 2.703 1.271 0.483 Arachidic acid 0.351 0.109 1.559 1.048 0.797 4.028 Lignoceric acid 0.764 2.077 0.121 Kết phân tích thành phần acid béo vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8, Navicula N9 đƣợc thể bảng 3.2, nhận thấy tỉ lệ acid béo ba chủng vi tảo đa dạng Vi tảo Chaetoceros C2 chứa 19 loại acid béo, bao gồm loại acid béo no 12 loại acid béo khơng no Trong đó, tỉ lệ acid béo không no cao, chiếm 76.358% tổng số acid béo vi tảo Chaetoceros C2 Tỉ lệ EPA AA cao, EPA chiếm 24.759% AA chiếm 7.845% tổng số acid béo thể đặc tính phổ biến tảo silic [7,8] Tỉ lệ eicosapentaenoic acid (20:5n-3) vi tảo Chaetoceros C2 cao tổng số loại acid béo: eicosapentaenoic acid chiếm 24.759% tổng số acid béo; tiếp đến myristolenic acid (14:1n-5) với tỉ lệ 18.086% palmitoleic (16:1n-7) 15.232% Các acid béo đạt tỉ lệ cao lần lƣợt margric (17:0), arachidonic acid (20:4n-6) asclepic (18:1n-7) với tỉ lệ lần lƣợt 9.519%, 7.845% 3.744% tổng số acid béo 20 vi tảo Chaetoceros C2 Tỉ lệ EPA AA cao (EPA chiếm 24.759%, AA chiếm 7.845%) có vi tảo Chaetoceros C2 có ảnh hƣởng lớn tới hoạt tính chủng Cả hai chủng Navicula N8, Navicula N9 thành phần có 17 loại acid béo không no thuộc dạng C4, C10, C12, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C22 Tuy nhiên thành phần loại acid béo loài khác Chủng Navicula N8 có tỉ lệ acid palmitic (C16:0) lớn chiếm 52.557%, sau tới acid palmitoleic chiếm 13.694%, chủng Navicula N8 có chứa hàm lƣợng acid arachidonic (AA) 0.764% Chủng Navicula N9 có tỉ lệ acid palmitic (C16:0) lớn chiếm 58.303%, acid Palmitoleic chiếm 25.290% có hàm lƣợng acid oleic chiếm 1.188% Có thể nhận thấy sắc ký đồ ba chủng xuất acid béo quan trọng DHA nhƣng có tỉ lệ thấp Kết thành phần acid béo đƣợc thể rõ sắc ký đồ sau: Hình 3.9 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Chaetoceros C2 21 Hình 3.10 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Navicula N8 Hình 3.11 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Navicula N9 Với đa dạng thành phần loại acid béo ba chủng vi tảo Chaetoceros C2, Navicula N8, Navicula N9 đặc biệt với hàm lƣợng acid béo khơng no, có mặt AA, EPA DHA tiền chất sinh tổng hợp chất nhƣ hormone bao gồm: prostaglandin, thrombosane, leukotriene Cả ba chủng vi tảo ứng dụng cho ni trồng thủy sản, làm tăng chất lƣợng giống 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ mẫu thu thập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam Định, phân lập tuyển chọn lƣu giữ ba chủng vi tảo ký hiệu C2 thuộc chi Chaetoceros N8, N9 thuộc chi Navicula Dựa vào đặc điểm hình thái học quan sát đƣợc kính hiển vi quang học khả phát triển vi tảo cần nghiên cứu mơi trƣờng chuẩn đốn, định danh sơ ba chủng vi tảo Chaetoceros C2; Navicula N8; Navicula N9 thuộc lồi Chaetoceros muelleri; Navicula tuscula Navicula radiosa Mơi trƣờng ASW môi trƣờng dinh dƣỡng tốt cho sinh trƣởng phát triển vi tảo chủng Chaetoceros C2, Navicula N9 với mật độ tế bào đạt cao 67.22 ×106/ml 137.6×106/ml Vi tảo chủng Navicula N8 sinh trƣởng tốt môi trƣờng ESM với mật độ tế bào cao đạt 129×106/ml Chủng vi tảo Chaetoceros C2 có chứa thành phần acid béo không no quan trọng EPA (chiếm đến 24.759%), AA (7.845%); chủng Navicula N8 Navicula N9 có tỉ lệ acid palmitic lớn chiếm 52.557% 58.303% Chủng Navicula N8 có chứa hàm lƣợng acid arachidonic (AA) 0.764%, chủng Navicula N9 có hàm lƣợng acid oleic chiếm 1.188% Sự đa dạng thành phần loại acid béo (từ 17- 19 loại acid béo) cho thấy ba chủng vi tảo ứng dụng cho nuôi trồng thủy sản, làm tăng chất lƣợng giống KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá tác động chủng vi tảo silic tới sinh trƣởng, phát triển thủy sản để sớm đƣa vào nuôi trồng thủy sản, nhằm tăng chất lƣợng, tăng suất giảm giá thành nuôi trồng thủy sản Đẩy mạnh công tác bảo tồn lƣu giữ nguồn gen vi tảo silic quý hệ thống rừng ngập mặn 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đặng Đình Kim, Đặng Hồng Phƣớc Hiền 1999 Cơng nghệ sinh học vi tảo NXB Nông nghiệp Dƣơng Đức Tiến, Võ Văn Chi 1978 Phân loại học thực vật bậc thấp NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 2:tr 109-114 Lê Trọng Cúc 2002 Đa dạng sinh học bảo tồn thiên nhiên NXB Đại học quốc gia Hà Nội, 2:tr 109-114 Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy Hệ thống học thực vật NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội, 2002 Trung tâm Bảo tồn sinh vật biển phát triển cộng đồng (MCD), trung tâm nghiên cứu hệ sinh thái rừng ngập mặn (MERC) Cục tài ngun nƣớc mơi trƣờng thuộc phủ Autralia Báo cáo đa dạng sinh học vườn quốc gia Xuân Thủy, tr 16 Trƣơng Ngọc An 1993 Phân loại tảo silic phù du biển Việt Nam NXB Khoa học kĩ thuật Tài liệu Tiếng Anh A.S Carlsson, J.B van Beilen, R Moller and D Clayton 2007 Micro-and Macroalgae: Utility for industrial applications Output from the EPOBIO project, CPL Press, UK A.Shirora 1966 The plankton of south Viet Nam Fresh Water and Marine Plankton Overseas Technical Cooperation Agency Japan Fumie Kasai, Masanobu Kawachi, Mayumi Erata and Makoto M.Wantanabe,(2004), “NIES - Collection, list of strains”, National Institute for Environmental Studies, Japan, No 182, pp 54 – 58 10 Hargraves P.E (1979) “Studies on marine plankton Diatoms IV Morphology of Chaetoceros resting spores” Nova Hedwigia Beiheft 64: 99-120 11 L K Medline and I Kaczmarska Evolution of the diatoms (2004), “Morphological and cytological support for the major clades and a taxonomic revision” Phycologia, Vol 43 (3), pp 245-270 24 12 Makoto shirai, Katsumi Matumaru, Akio Ohotake, Yoshichika Takamura, Tokujiro Adia and Masayasu Nakano (1989), “Development of a Solid medium for Growth and Isolation of Axenic Microcystis Strains (Cyanobacteria) ”, Appl Environ Microbiol 55(10): pp 2569-2571 13 Miller L.T (1982), "Single derivatization method for routine analasyis of bacterial whole cell fatty acid methyl esters, including hydroxy acids" J Clin Microbiol.,16 584-586 25 ... thực : ? ?Nghiên cứu đặc điểm sinh học số loài vi tảo silic phân lập rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định? ?? Với mục tiêu: Lƣu giữ bảo tồn nguồn gen đa dạng vi tảo silic Nội dung nghiên cứu - Phân lập, ... Nghiên cứu đặc điểm sinh học số loài vi tảo silic phân lập rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định Các thành vi? ?n tham gia đề tài Chủ trì đề tài Họ tên: Nguyễn Thị Hồi Hà Đơn vị công tác: Vi? ??n Vi sinh. .. nghiên cứu Vi tảo đƣợc phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định thuộc chi Chaetoceros Navicula 2.1.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu Địa điểm thu mẫu: rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam