Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 1-5 Dịch chiết Hồ tiêu (Piper nigrum L.) ức chế hoạt động thụ thể neurokinin-1 (NK-1R) kích thích chất P (substance P) tế bào lympho chuột Trịnh Tất Cường1,*, Giang Huy Diệm2, Trần Trung Đoàn2, Phạm Thanh Huyền3, Đinh Đồn Long1,4 Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ enzyme-protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược Liệu, 3B Quang Trung, Hoàn Kiếm, Hà Nội, Việt Nam Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 01 tháng 12 năm 2013 Ch nh s a ngày tháng 01 năm 2014 chấp nhận đăng ngày 24 tháng năm 2014 Tóm tắt Trong nghiên cứu này, chúng tơi chứng minh chất P (SP), phối t đặc hiệu thụ thể NK1R, thúc đẩy tế bào lympho chuột giải phóng cytokine interferon-gamma (IFN-γ) điều kiện invitro Ngồi ra, SP kích thích (hoặc làm tăng) biểu thụ thể tế bào nuôi cấy Dịch chiết mêtanol hạt Hồ tiêu (Piper nigrum L.) ức chế mạnh hoạt động thụ thể NK-1R hoạt hóa SP cho thấy thụ thể đích tác động thành phần có dịch chiết, khơng liên quan đến capsaicin qua đường truyền tin thụ thể vanilloid loại (TRPV1) vốn biết trước Thành phần dịch chiết Hồ tiêu có hoạt tính đối kháng (đối vận) thụ thể NK-1R cần tiếp tục quan tâm nghiên cứu Từ khóa: Thụ thể neurokinin-1 (NK-1R), Chất P (Substance P - SP), Capsaicin, Hồ tiêu (Piper nigrum L.), Chất đối kháng thụ thể Đặt vấn đề trình truyền tin tế bào dẫn tới điều hịa cảm giác đau từ vùng thần kinh ngoại vi hệ thần kinh trung ương, gây trạng thái lo âu triệu chứng trầm cảm, gây tác dụng kích thích co trơn ảnh hưởng đến điều hòa phản ứng miễn dịch thể [2] Ngồi ra, NK-1R hoạt hóa cịn gây tín hiệu đáp ứng viêm số mơ hình chuột bị viêm nhiễm trùng [3] Theo nghiên cứu gần đây, NK-1R trạng thái hoạt hóa thúc Thụ thể neurokinin-1 (NK-1R) thuộc nhóm thụ thể xuyên màng liên kết với G-protein, biểu mạnh khu vực não có mặt tế bào hệ thống miễn dịch [1] Chất P (SP) phối t có lực đặc hiệu với NK-1R Khi kết cặp với SP, NK-1R kích thích _ Tác giả liên hệ Tel: 84-0984814776 E-mail: cuongtrinhtat@gmail.com T.T Cường nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 1-5 đẩy tế bào lympho (lymphocyte) tiết interferon gamma (IFN-γ) [3] Capsaicin tách chiết từ Hồ tiêu (Piper nigrum L.), Ớt (Capsicum frutescens L.) … biết có tác dụng giảm đau thần kinh sau kết cặp với thụ thể TRPV1 thông qua thúc đẩy giải phóng SP [4] Để tìm hiểu dịch chiết Hồ tiêu giả thiết có chứa capsaicin có tác động trực tiếp đến thụ thể NK-1R hay không, tiến hành xây dựng điều kiện kỹ thuật cho phép đánh giá biểu chức thụ thể NK-1R tế bào lympho chuột tác động phối t SP khả ảnh hưởng dịch chiết dược liệu từ Hồ tiêu đến đường truyền tin Kết nghiên cứu cho thấy, dịch chiết Hồ tiêu không làm tăng hoạt động thụ thể NK-1R dự đoán thay vào ức chế hoạt động Như vậy, Hồ tiêu, ngồi capsaicin, cịn chứa thành phần có tác động đến hoạt động thụ thể NK-1R hoạt hóa SP theo chế đối kháng (antagonist) Vật liệu phương pháp Đối tượng vật liệu: Chuột nhắt trắng (Mus musculus) dòng Swiss mua từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Kit tách tế bào lympho Ficoll-paque PLUS GE-Health care (Mỹ) chất P (SP), aprepitant (AP, chất ức chế NK-1R), kháng thể kháng NK-1R mua từ Sigma (Đức) kit ELISA IFN-γ mua từ BD Biociences (Mỹ) môi trường RPMI 1640, FBS, kháng sinh mua từ TM Invitrogen (Life Technologies, Singapo) đĩa ELISA 24 giếng 96 giếng mua từ Corning (Mỹ) Dược liệu Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu cung cấp khuôn khổ Đề tài độc lập cấp nhà nước mã số PTNTĐ2011-G/04 Tách nuôi tế bào lympho: Tế bào tách từ huyết chuột kit Ficoll-paque PLUS theo quy trình hãng Tế bào sau ni RPMI 1640 chứa 10% FBS Phân tích ELISA: Tế bào lympho x lý phân tích ELISA mơ tả trước [5] Cytokine IFN-γ mà tế bào tiết định lượng ELISA Các bước phân tích thực theo ch dẫn nhà sản xuất (BD Biociences) Western Blot: Tế bào lympho x lý phân tích Western Blot mô tả trước [5] Kháng thể kháng NK-1R pha loãng với t lệ 1:1000 Màng chuyển protein phát Chemiluminescence (ECL, GE HealthCare) Thử hoạt tính sinh học: Dịch chiết mêtanol dược liệu có nồng độ khác (từ đến 40 g/ml) bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào với với thể tích khơng q 5% Đối chứng bổ sung thể tích dung mơi khơng chứa dịch chiết dược liệu Cytokine so sánh lô đối chứng lơ thí nghiệm Thu thập số liệu xử lý thống kê: Số liệu thu từ thí nghiệm lặp lại độc lập, biểu giá trị trung bình ± phương sai tiêu chuẩn (±SD) phân tích Student’s T-test với điều ch nh Bonferroni ANOVA Sự khác có ý nghĩa thông kê với P < 0,05 Kết bàn luận 3.1 SP kích thích tế bào lympho tăng tiết IFN-γ Công bố trước [2] cho thấy SP có khả kích hoạt NK-1R tế bào lympho thúc đẩy sản sinh IFN-γ Do vậy, để khẳng định T.T Cường nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 1-5 kDa (vị trí mũi tên), tế bào lympho x lý với SP nồng độ thí nghiệm khoảng 10-4 đến 102mM (các điện di - 7) cho băng Đây kích thước phân t protein mong đợi NK-1R M 225 130 97 76 52 10 10 10 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 Nồng độ phối tử SP (mM) Kích thước protein (kDa) lại khả kích thích sinh IFN-γ SP, tế bào lympho chuột tách nuôi ủ với SP nồng độ 10-4 mM qua khoảng thời gian khác 0, , , 24 Sau đó, tế bào từ dịch ni thu lại ly tâm IFN-γ tiết định lượng ELISA Kết thí nghiệm (Hình 1) cho thấy tác dụng SP, lượng IFN-γ sinh tăng dần ngày đạt tối đa sau khoảng 24 nuôi cấy Đây thời điểm tế bào nuôi lựa chọn để định lượng cytokine IFN- thí nghiệm (ĐC) Hình Tế bào lympho biểu NK-1R kích thích phối t SP Vị trí mũi tên (5 kDa) kích thước phân t NK-1R; 1–7: tế bào x lý với SP nồng độ khác nhau, : đối chứng (không x lý với SP), M: thang kích thước protein (marker) M Hình Phối t SP kích thích tế bào lympho sản sinh IFN- Trong thí nghiệm, 5x105 tế bào ủ với 10-4mM phối t IFN- qua thời gian định lượng ELISA 3.2 Phối tử SP kích thích tăng biểu thụ thể NK-1R tế bào lympho Để đánh giá biểu thụ thể NK-1R tế bào lympho có kích thích SP, tế bào lympho ủ với SP nồng độ tăng dần từ đến 102 mM (với bậc pha lỗng mơ tả Hình 2), sau phức hệ protein phân tích điện di gel SDS-PAGE Kết thí nghiệm (Hình 2) cho thấy: tế bào lympho đối chứng (không ủ với SP điện di số hình) khơng cho băng protein có kích thước 10 10 10 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 Nồng độ phối tử SP (mM) Hình Xác định thụ thể NK-1R Western Blot Các 1–7: tế bào x lý với SP nồng độ khác từ 10-4 đến 102 mM, M: hỗn hợp protein thang kích thước (marker) Tuy vậy, để khẳng định chắn protein 58 kDa NK-1R, tế bào lympho sau ủ với SP nồng độ khác thu protein phân tích Western blot với T.T Cường nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 1-5 kháng thể kháng NK-1R mô tả phần phương pháp Kết Hình cho thấy tế bào ủ với SP nồng độ từ 10-4 đến 102 mM cho băng Điều khẳng định xác protein kDa thu NK-1R SP kích thích thụ thể NK-1R biểu hoạt động tế bào lympho chuột nuôi cấy invitro Từ kết nghiên cứu nhận định phối t SP kích thích (hoặc làm tăng) biểu thụ thể NK-1R tế bào lympho chuột nuôi cấy invitro Sự kích thích thu nồng độ SP thấp thí nghiệm 10-4mM 3.3 Dịch chiết Hồ tiêu ức chế hoạt động thụ thể NK-1R tế bào lympho kích thích phối tử SP Để đánh giá khả tác động dịch chiết Hồ tiêu lên NK-1R, tế bào lympho ủ với AP (chất ức chế NK-1R) nồng độ 10-2mM 24 làm đối chứng dương (ĐC(+)) Sau đó, tế bào ủ với AP không (ĐC -4 ()) ủ với SP nồng độ 10 mM với dịch chiết Hồ tiêu nồng độ 10, 20, 30 40 µg/ml (dược liệu khơ/dung mơi) 24 (xem mơ tả phương thức thí nghiệm Hình 4) Dịch tế bào thu sau phân tích ELISA để đánh giá khả sinh IFN-γ Kết hình cho thấy, việc bổ sung SP rõ ràng làm tăng sinh IFN-γ từ 116 pg/ml (ĐC ()) lên 644 pg/ml (ĐC (+)); vậy, nồng độ IFN- giảm rõ rệt dịch nuôi bổ sung chất ức chế NK-1R aprepitant (AP) Nồng độ IFN- lúc giảm ch 276 pg/ml Việc bổ sung dịch chiết Hồ tiêu vào tế bào lympho vắng mặt SP không làm tăng đáng kể tiết IFN- so với đối chứng (ĐC ()) giải thích biểu yếu NK-1R dịng tế bào thiếu vắng phối t Điều đồng thời khẳng định tăng giảm nồng độ IFN- tiết phép th thiết lập chủ yếu điều hịa qua NK-1R Hình Sự ức chế sinh IFN- dịch chiết Hồ tiêu tác động qua thụ thể NK-1R tế bào lympho chuột nuôi cấy invitro ĐC (-)= Tế bào không xử lý, ĐC (+)= Dịch tế bào bổ sung SP (10-4mM), AP = aprepitant (chất ức chế NK-1R) bổ sung nồng độ 10-2mM, SP = substance P (phối tử đặc hiệu NK-1R) bổ sung nồng độ 10-4mM, dịch chiết=dịch chiết methanol Hồ tiêu nồng độ khác (10 – 40 g/ml) Tuy vậy, tế bào lympho đồng thời x lý với phối t SP ủ với nồng độ tăng dần dịch chiết Hồ tiêu từ (ĐC (+)) lên 10, 20, 30 40 g/ml lượng IFN- γ sinh giảm rõ rệt tương ứng từ 644 xuống 496, 451, 361 306 pg/ml Từ kết này, xác định dịch chiết Hồ tiêu có khả ức chế trình hoạt động NK-1R Vì capsaicin cho thúc đẩy hoạt động thụ thể NK-1R kích thích sản sinh SP thơng qua hoạt hóa đường truyền tin thụ thể TRPV1 [4], nghiên cứu dịch chiết Hồ tiêu ức chế mạnh hoạt động NK-1R cho thấy hoạt động ức chế thụ thể NK-1R khơng liên quan đến capsaicin thông qua đường TRPV1 Đồng thời, kết nghiên cứu cho thấy, có lẽ dịch chiết Hồ tiêu chứa hợp chất ức chế mạnh hoạt động thụ thể NK-1R theo chế đối kháng (antagonist) Để xác định chất hóa học thành phần đối kháng thụ thể NK1R Hồ tiêu (Piper nigrum L.) cần có nghiên cứu bổ sung T.T Cường nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 1-5 Kết luận Tài liệu tham khảo Chúng tơi thiết lập mơ hình đánh giá khả tương tác dịch chiết dược liệu với thụ thể NK-1R tế bào lympho chuột nuôi cấy invitro thông qua đo khả sinh IFN- kích thích phối t đặc hiệu thụ thể SP (substance P) Sự sinh IFN- tế bào lympho chuột kích thích SP chủ yếu hoạt động truyền tín hiệu thụ thể NK-1R Dịch chiết dược liệu từ Hồ tiêu (Piper nigrum L) ức chế mạnh hoạt động NK-1R hoạt hóa SP cho thấy nhiều khả dược liệu chứa dược chất tác động lên thụ thể NK-1R theo chế đối kháng Lời cảm ơn Chúng trân trọng cảm ơn tài trợ Bộ Khoa học Công nghệ (Việt Nam) cho đề tài PTNTĐ.2011-G/04 để thực nghiên cứu [1] [2] [3] [4] [5] Cook GA, Elliott D, Metwali A, Blum AM, Sandor M, Lynch R, Weinstock JV (1994) Molecular evidence that granuloma T lymphocytes in murine schistosomiasis mansoni express an authentic substance P (NK-1) receptor J Immunol.152, 1830-5 Beinborn M, Blum A, Hang L, Setiawan T, Schroeder JC, Stoyanoff K, Leung J, Weinstock JV TGF-beta regulates T-cell neurokinin-1 receptor internalization and function (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(9): 4293-8 Baker SJ, Morris JL, Gibbins IL (2003) Cloning of a C-terminally truncated NK-1R from guinea-pig nervous system Brain Res Mol Brain Res 11(1-2): 136-47 Arpad S, Peter MB (1999) Vanilloid (Capsaicin) Receptors and Mechanisms Pharmacol Rev, 51(2): 159-212 Chul-Su Y, Sung-Ryong K, Byung-Goo C, Dong-Min S, Jae-Min Y, Sheng- Jin L, Jin-Man K, Evans RM, Jun-Sub J, Dong-Keun S, EunKyeong (2008) The ginsenoside metabolite compound K, a novel agonist of glucocorticoid receptor, induces tolerance to endotoxininduced lethal shock J Cell Mol Med, 12 (1): 1-17 Methanolic Extracts of Pepper (Piper nigrum L.) Inhibits Substance P-Induced Activation of Neurokinin Receptor (NK-1R) in Murine Lymphocytes Trịnh Tất Cường1, Giang Huy Diệm2, Trần Trung Đoàn2, Phạm Thanh Huyền3, Đinh Đoàn Long1,4 Key Lab for Enzyme-Protein Technology, VNU University of Science, 334 Nguyễn Trãi, Hanoi, Vietnam Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyễn Trãi, Hanoi, Vietnam Department of Medicinal Resources, Institute of Medicinal Materials, 3B Quang Trung, Hanoi, Việt Nam School of Medicine and Pharmacy, Vietnam National University, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hanoi, Vietnam Abstract: In this study, we demonstrated Subtance P (SP) induced the release of interferon-gamma (IFN-γ) from murine lymphocytes under invitro conditions Moreover, SP stimulated the expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) on lymphocytes Methanolic extracts derived from pepper (Piper nigrum L.) seeds inhibited potently SP-induced activity of NK-1R suggested that these receptors might be the target sites for certain constitutents of pepper extracts, though may not associate with capsaicin via TRPV1 pathway What constituents in pepper extracts that might provoke antagonistic activity of on NK-1R may be another topic for further pharmacological studies of Piper nigrum L Keywords: Neurokinin-1 Receptor, Substance P, Capsaicin, Pepper (Piper nigrum L.), Antagonist ... nghiệm 10 -4mM 3.3 Dịch chiết Hồ tiêu ức chế hoạt động thụ thể NK- 1R tế bào lympho kích thích phối tử SP Để đánh giá khả tác động dịch chiết Hồ tiêu l? ?n NK- 1R, tế bào lympho ủ với AP (chất ức chế NK- 1R) ... Phối tử SP kích thích tăng biểu thụ thể NK- 1R tế bào lympho Để đánh giá biểu thụ thể NK- 1R tế bào lympho có kích thích SP, tế bào lympho ủ với SP nồng độ tăng dần từ đến 10 2 mM (với bậc pha l? ??ng... tín hiệu thụ thể NK- 1R Dịch chiết dược liệu từ Hồ tiêu (Piper nigrum L) ức chế mạnh hoạt động NK- 1R hoạt hóa SP cho thấy nhiều khả dược liệu chứa dược chất tác động l? ?n thụ thể NK- 1R theo chế đối