Nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học các dẫn chất của acid usnic

N G H IÊN C Ứ U T NG H P V À T H Ử H O Ạ T TÍN H SINH H Ọ C CÁC DẪN CH T CỦA ACID (+) ƯSNIC Ths N guyễn T h ị H n g G iang* T Ó M TẲ T H n g dẫn: PG S.TS N guyễn N gọc V in h* Acid (+) usnic hợp chất tự nhiên phong phú chiết xuất từ địa y VỚI mong muốn tiếp tục nghiên cửu dân chất từ acid (+) usnic, nghiên cứu thực nhằm mục tiếu t m đẫn chất có tiềm vể hoạt tính sinh học ĐỔI tuợng phương pháp nghiên cứu: acid (+) usnỉc dẫn chất acid (+) usnic Các dẫn chất tổng hợp dựa phản ứng amin hóa Các amin phản ứng bao gồm: amoniac, ethylendiamin 2­amino benzotrifluorid, 3­amino benzottifluorid, 4­amino benzotrifluorid, 3­cloro 2­methylanilin, 5­cIoro 2­mefhylanilin hyđroxylamin Thử hoạt tính sinh học: ­ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm: phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng ­ Khảo sát hoạt tính kháng ung thư đòng tế bào ung thư não người Ư87MG: phương pháp MTT Kết luận: ­ Đã tổng hợp đirợc 10 dẫn chất acid (+) usnic, có đẫn chất chua thấy công bố tài liệu tham khảo Xác định cấu trúc 10 dẫn chất tổng hợp ­ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm cho kết dẫn chất có tác đụng chủ yểu dịng vi khuẩn gram +, có tác đụng vi khuẩn Gram ­ nấm men ­ Khảo sát hoạt tính kháng ung thư đòng tế bào ung thư não người Ư87MG Kết cho thấy dẫn chất có tác đụng mạnh dòng tế bào với LDso 44,17 sau thời gian 24 Đây kết đáng quan tâm *Từ khóa: Acid (+) usnic; Các dẫn chất acid (+) usnic; Hoạt tính sinh học Synthesừ and biological activity evaluation of(+)-usnw aciđ derivatives Summ ary (+) Usnic acid is a metabolite uniquely found in ỉichens Since its first isolation in 1844[4], (+) usnic acid have been interested in synthesis research The aim of this thesis keeps researching new (+) usnic acid derivatives with potential biological activities Materials and methods: (­f) usnic acid and (+) usnic acid derivatives (+)­usnic acid derivatives are synthesized by amine reaction General procedure for (+) usnic acid derivatives synthesis (A) To a solution of amine was added dropwise (+) usnic acid in alcohol under reflux After stirring for hours, the mixture was concentrated under reduced pressure The obtained residue was purified by preparative chromatography Procedure of (+) usnic acid with Hydroxylamine Hydrochloride (B) A solution of (+) usnic acid and hyđroxyỉamine hydrochloride in 5% methanolic potassium hydroxide and distilled water was heated at 50°c under a nitrogen atmosphere for 2h The resulting solution was added with IN hydrochloric acid The residue was purified by preparative chromatography In thesis, we used the amines including ammonia, ethylenediamine, 2­aminobenzotrifluoride, 3Taminobenzotrifluoride 4­aminobenzotrifluoride, 3­chloro 2­methyianiline, 5­chloro 2­methylaniiine, and hydroxylamine; Ten (+) usnic acid­amine conjugates were evaluated on antibacterial, antifungal activities with the agar dilution method In addition, the cytotoxicity of the derivatives against human glioblastoma­astrocytoma cell line (Ư87MG) was evaluated using the MTT3assay * Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hầ C hí M inh 626 Conclusion: In this study, we synthesized ten (+) usnic acid derivatives and of which, nine compounds have not been in any official publications The structures of all derivatives are confirmed by spectral and analytical data In biological activity, it showed that (+) usnic acid and derivatives affect almost in gram­positive bacteria and compound shows better activity in human cancer cell line U87MG than (+) usnic acid * Key words: Acid (+) usnic; (+) usnic acid derivatives; Biological activity I Đ ẶT VẤN Đ Acid usnic hợp chất tự nhiên phong phú t m thấy từ địa y Acid usnic có cơng thức phân tử C 18H 1607, tên hóa học 2,6­diacetyI­7,9­đihyđroxy­8,9b~đimethyl~l,3(2H, 9bH)­ dibenzo­furandion, sắc tổ màu vàng, tự nhiên tồn hai đồng phấn R+ S­, tùy thuộc vào nhóm methyl vị trí 9b Kể từ Knop phân lập từ địa y năm 1844 [4], năm gần đây, aciđ usnic nhà khoa học tổng hợp, sàng lọc nhiều dẫn chất với hoạt tính sinh học đa dạng kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng dị ứng, chất ức chế tăng trưởng thực vật, kháng đơn bào, ức chế enzyme [ ,6 ,1 ,1 , 14] Các tác dụng kể mở triển vọng nghiên cứu phát triển đẫn chất từ acid usnic thành thuốc điều trị, kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm Trong lĩnh vực hóa sinh, việc tổng hợp acid usnic dẫn chất di từ aciđ usnic không ngừng quan tâm phát triển, không lĩnh vực thiết kế tổng hợp dẫn chất mới, m nghiên cứu chế phản ứng, cải thiện đặc tính lý hóa với mục tiêu làm tăng tác dụng sinh học hợp chất Các dẫn chất amin acid (+) usnic bắt đầu nghiên cứu từ năm 1950, đến tiếp tục nhiều tác giả giới nghiên cứu (1, 2, 3, 7, 8, 9, 10) Tuy nhiên, nước chưa có nghiên cứu tổng hợp tác dụng sinh học dẫn chất V thế, mục tiêu nghiên cứu: Tổng hợp đẫn c h ầ am in acid (+) U S Ì Ú C xác định cấu trúc th hoạt tính sin h hoc cửa dẫn chẩt ch ủn g vị sin h vật gram (+), gram (-) th tác dạng ng u n g th dòng tế bào un g th não ngườ i U87MG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 Nguyên li u trang thiết b ị 2.1.1 N guyên li u Nguyên liệu tổng hợp hóa học: acid (+) usnic (Sigma, Mỹ); ethylendiamin, 2­amino benzotrifluorid, 3­amino benzotrifluorid, 4­amino benzotrifluorid, 3­c oro 2­methylanilin, 5­cloro 2­methyIanilin, ethylendiamin, 2­amino benzotrifluorid, 3­amino benzotrifluorid, 4­amino benzotrifluorid, 3­cloro 2­methylaniỉin, 5­cloro 2­methylanilin, hydroxyỉamin, amoniac đậm đặc, tetrahydrofuran, đicloromethan, toluen, acid hydroclorid 37%, kali hydroxyd, natri sulfat, n­hexan, dimethyl sulfoxid, aceton, methanol, ethanol, cloroform, acid acetic băng đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck, Đức) Nguyên liệu thử nghiệm hoạt tính sinh học: Sabouraud dexưose agar (Merck, Đức), Mueller­Hinton agar (Oxoiđ, Thermo), Trypticasein Soy Agar (Merck, Đức), Dulbecco’s modified Eagle's medium (Gibco BRL, Grand Island, New York, M ỹ), huyết thai nhi bò (FBS,Hyclone Laboratories, Thermo), Penicillin (Gibco BRL, Grand Island, New York, Mỹ), Streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, New York, Mỹ) 2.1.2 T n g thiết bị Máy quay áp suất giảm BƯCHĨ Ravapor R­200 (Thụy Sĩ) Máy đo nhiệt độ nóng chày BUCHI (Thụy Sĩ) M áy đo phổ hồng ngoại Nicolet 760 (Mỹ), sắ c ký lỏng hiệu cao Shimadzu LC­20A (Nhật), cột Gemini Nx C18 (75*4,6 mm; 2,1 |im) sắ c ký lỏng điều chế Shimadzu (Nhật), cột HiQ C18 (250 * 21,2 mm; 10 ịim ), cột Agilent Prep SIL (250 *21,2 mm; 10 (im), sắc ký lỏng ghép khối phổ Shimadzu LCMS­IT­ TOF (Nhật) M áy đo phổ công hưởng từ hạt nhân Bruker AC­500 M Hz (Mỹ), Trường đại học Khoa học Tự nhiên M áy đo phổ công hường từ hạt nhân Bruker AC­500 M Hz (Mỹ), Viện Hóa học ­ V iện Khoa Học cơng nghệ Việt Nam 627 2.2 Phư ơng pháp tồng họ p hóa học tơng hợp theo sơ đố Có 10 dẫn chất acid (4­) usnic tổng đồ sau: /p ? íí;ĩ' V ' 0H Ifu HO—(v k A [í A y ° r ­n h , \ ỉ Ị /~ = \ / Q \ ỉ )ĨJ r \)— Nlt j 011 °* * rt/l il I A K C 44 / “ì Ỉ-J / Ạ F A ^ ll IW£ị\ I iị i.&^ii.ieiiUADj R, 44I1 l / w IIu iíírỉvỉmruivii wvQ­'" (diclorometantth 25sCj Hi l/w u II rt/lil IAK C /“ì u M 'W ik FAfll (W£ị\ ^ íír ỉv ỉm r u iv ii I í c ^ ^ r iif io iiU A D ^ ặ A­W­'^ ^(ElOI l/Bh, rluttỊ) Í4 :2 -0 F;j; 5: -C F j ; -CF-J ì Fac M* / Ẩ 4- iQ OH /2h ratluxa) >7­^:1 HsC sl'wlmuiartyt THF-FtOH;1 :) B0”C>'Sh (7: ­CH3 3*­Cl; ô; 2‘­CHa 5'­Cl) CI /N ^ v HO > >­­­­ / í N ; ) l iv A Nn / \ /« o ) NH HỌ )_ ỵ ° ' y ^ Y =° H 0~ ~ s /— / 1S /H \ x * - U OH o N Ỹ 1^ 1' t N Ị I I* 6’ ^­r* *R ^“ ỊJ ịI R 5' HVDROOTIAM IN ­­­­­­­­­­­* Hn K O H f i i i fM M fe0H>H l O H V H E0 r O (2 f ? :1)1 -1 ìn K0H5% fXfiCJ2NN? X s ­ / ° > , ‘* ' v y x ỵ ỷ \ V- / 15 \ _i \ OH / ị xy *0 *S v , I ­ s , II U -R 9: R - 3'-CF, 10:R=2’GH3; 5‘Cl Sơ đồ Sơ đồ tổng hợp đẫn chất 1, ,4 , , , , amin hóa cùa acid (+) usnic Sơ đồ Sơ đồ tổng hợp dẫn chất acid (+) usnic Nhóm tạo dẫn chất với hydroxylamin vị trí nhóm ceton carbon C13 theo sơ đồ sau: Sơ đồ3 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 9, 10 acid (+) usnic 2.3.Tách dẫn chất sắc k ý u chể xác định cấu trúc Các đẫn chất amin tổng hợp tách làm hệ thống sắc ký lỏng điều chế Shimadzu đầu đò PDA Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, phương pháp phổ hồng ngoại, phương pháp đo phổ khối, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 628 Bảng Điều kiện chạy sắc ký điều chế Dẩn chất Pha động Cột AcCN ­ A.acetic 0,1 % H ĨQ C18 (75: 25) (2 50 * 21,2 mm; 10 ịxm) AcCN ­ A.acetic 0,1 % H ÌQ C Ỉ8 (40:60) Agilent Prep SIL Tốc độ dòng Detector 15 ml/phút 254 nm 10 ml/phút 254 nm 13 ml/phứt 254 nm EA ­ n­hexan (5:5) EA ­ n­hexart (5:5) Agilent Prep SIL 15 ml/phút 254 nm EA ­ n­hexan (3:7) Agilent Prep SIL 15 ml/phút 254 nm EA ­ n­hexan (4:6) Agilent Prep SIL 14 ml/phút 254 nm EA ­ n­hexan (5:5) Agilent Prep SIL 15 ml/phút 254 nm 10 EA ­ n­hexan (5:5) Agilent Prep SIL 15 ml/phút 254 nm (250 * 21,2mm; 10 fim) 2.4.Thử hoạt tín h sin h học in vitro 2.4.1 Phương pháp thửhoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Phương pháp pha lỗng môi trường lỏng [12] Vi sinh vật dùng cho thử nghiệm bao gồm Staphylococcus aur us ATCC 29737, Bacillus subtiỉis ATCC 6633, Esch richia coỉi ATCC 10536, Ps udomonas a ruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231 2.4.2 T h hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Thí nghiệm thực khoa Dược, Đại học Quốc gia Kangwon, Chuncheon Gangwon, Hàn Quốc Các tế bào Ư87MG glioblastoma (tế bào ung thư não người) lấy từ Ngân hàng Cell Line Hàn Quốc Khảo sát hoạt tính kháng ung thư dịng tế bào ung thư não người U87M G khoảng thời gian 24 48 Tién hành định lượng theo phương pháp M TT(13), đòng tế bào ung thư não người U87MG III K Ế T QUẢ 3.1 Tổn g hợp hóa học 31.1 (R,E)-4-acetyl-2-(l anim(>hylídene)-7,9-dihydroxy-8,9b-dimethyIdibenzo ỊỊM]fíiran-l,3(2H^bH)-dỉoii1: từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu sản phẩm (1) dạng tinh thể màu vàng nhạt (295 mg, 85 %); tone ss 252­254 oC; R f = 0,25 (etyl acetat ­ n­hexan ­ MeOH, 5:5:0,1) IR (KBr), V (cm ­ ) 3272, 3200­2500, 1697, 1625, 1548 ƯV Xmax (nm, CH 30H ) 289, 223 ESI­MS (m/z) C18H17N06 lý thuyết: 343,1056, thực tế: 343,Ỉ033 1H­NMR (500 MHz, DMSO­d6) s (ppm), J (Hz) 1,612 (s, 3H, CH3­10); 1,947 (s, 3H, CH3­15); 2,504 (s, 3H, CH3­12); 2,611 (s’ 3H, CH3­14); 5,796 (s, 1H, C4­H); 9,781 (s, 1H, N­H); 11,538 (s, 1H, C9­OH); 12,232 (s, 1H, N­H); 13,353 (s, 1H, C7­ OH) Ỉ3C­NM R (125 MHz, DMSO­CỈ6) (ppm) 7,384 (CH3­15); 24,397 (CH3­Ỉ2); 30,875 (CH3­14); 31,609 (CH3­10); 56,001 (C­9b); 100,778 (C­4); 101,220 (C­6); 102,442 (C­9a); 105,034 (C­2); 106,262 (C­8); 155,589 (C­4b); 157,620 (C~9); 162,484 (C­7); 172,886 (C­11); 175,779 (C­4a); 188,413 (C­3); 197,532 (C~l); 200,713 (C­13) 3.1^ (R,E)-6-aceíyl-2-(l-(2-ammoethylamino)ethylidene)-7,9“díhydroxy-8,9b- đim ethyỉdibenzo[b,d]furan- l,3(2H,9bH)­dion 2: từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu sản phẩm (2) dạng bột màu trắng (177 mg, 51 %); tone = 186­188 oC; Rf = 0,51 (CH2CỈ2 ­ MeOH ­ NH3, 95:5:1); IR (KBr), V (cm­1) 3270 (vN­H); 3200­2500 (vN~H, vO­H); 1696 (vC =0); 1635 (vC =0, vC=C); 1545 (vC=0) v Xmax (nm, 3C H 30H ) 291; 222 ESI­ MS (m/z) C20H 22N206, iý thuyết: 386,1478; thực tế: 386,1428 1H­ NM R (500 M Hz, DMSO­d6) s (ppm), 629 J (Hz) 1,645 (s, 3H, CH3­10); 1,943 (s, 3H, CH3­15); 2,511 (s, 3H, CH3­12); 2,622 (s, 3H, CH3­14); 3,305 (t, 4H, J = Hz, CH2­2’, 3’); 3,947 (t, 2H, J = Hz, NH2); 5,873 (s, 1H, C4­H); 12,129 (s, 1H, C9­OH); 13.055 (s, ÍH , K­H); 13,371 (m, III, C7­OH) 13C­NMR (125 MHz, DM SO­d6) Ỗ (ppm) 7,390 (CH3­15); 18,100 (CH3­12); 30,94 (CH3­14); 31,62 (CH3­10); 39,03 (CH2­2’); 42,42 (CH2­1’); 56,30 (C­9b); 100,83 (C­4); 102,04 (C­6); 102,32 (C­9a); 105,00 (C~2); 106,31 (C­8); 155,68 (C~4b); 157,55 (C­9); 162,48 (C­7); 172,96 (C ­11); 175,73 (C~4a); 188,70 (C­3); 19737 (C ­l); 200,83 (C­13), 3.1.3 (R)-10-acetyI-7,9-dihydroxy-5,6a,8-trimethyI-3,4-dihydrO “2 H “ }enzo[2,3] benzofuro[6,5-e][l,4] diazem n­6(6aH )­on 3: từ 344 me (1 mmoli acid í+ usnic thu sản phẩm dạng bột màu vàng ( 145 mơ 42 %); tone = 175­177 oC; R f ­ 0,31 (CH2C12 ­ M eOH ­ NH3, 95:5:1) IR (KBr), 7(cm~1) 3450 (vN­ H); 3200­2500 (vN­H, vO­H); 1699 (vC =0); 1628 (vC =0, vC ­C ); 1551 (vC=0).ƯV Xmax (nm, CH3ỜH) 324, 248, 225 ESI­MS (m/z) C20H20N 205; ý thuyết: 368,1372; thực tế: 368,1313 1H­NMR (500 MHz, DMSO­d6) ổ (ppm), J (Hz) (phụ lục 3­4): 1,645 (s, 3H, CH3­10); 1,841 (s, 3H, CH3­15); 2,517 (s, 3H, CH3­12); 2,528 (s, 3H, CH3­14); 3,631 (dđ, 2H, J = 13,5 Hz, CH2); 3,745 (dd, 2H, J = 13,5 Hz, CH2); 5,873 (s, 1H, C4­H); 13,556 (s, 1H N ­ H), 13C­NMR (125 MHz, D M SO đó) (ppm) 7,390 (CH3­15); 18,100 (CH3­12); 30,94 (CH3­14); 31,62 (CH3­10); 39,03 (CH2­2’); 42,42 (C H 2­Í1); 56,30 (C­9b); 100,83 (C­4); 102,04 (C­6); 102,32 (C­9a); 105,00 (C­2); 106,31 (C­8); 155,68 (C­4b); 157,55 (C­9); 162,48 (C­7); 172,96 (0­11); 175,73 (C­4a); 188,70 (C­3); 197,37 (C ­l); 200,83 (0­13) 3.1.4 (E)-6-acetyl-7ỷ9 -dih ydroxy -8,9b-dim eth yl-2-(l-(2-(trifluo ro m ethyl) phenylam ino)ethylidene) dibenzo[b,d]furan­l,3(2H ,9bH )­dion4: từ 344 mg ( ỉ mmol) acid (+) usnic thu tinh thể h nh kim, màu trắng ngà (204 mg, 42 %); tone = 144­146 oC; R f “ 0,36 (EA ­ n­hexan ­ M eOH, 3:7:0,1) IR (KBr), V (cm­1) 1693 (vC=0); 1635 (vC = 0, vC=C); 1548 (vC =0) v Xmax (nm, C H 30H ) 294; 223 ESI­MS (m/z) C25H20F3N06; lý thuyết: 487,1243; thực tế: 487,1175 1H­NMR (500 MHz, DMSO­d6) (ppm), J (Hz) 761 (s, 3H, CH3­10); 2,025 (s, 3H, CH3­15); 2,478 (s, 3H, CH3­12); 2,689 (s, 3H, CH3­14); 6,019 (s, 1H, C4­H); 7,706 (t, 2H, J = 7,5 Hz, C 4’ ,C5’); 7,861 (t, 1H, J = 7,5 Hz, C 6’); 7,928 (d, 2H, B \ ’= 7,5 Hz, C3’); 11,915 (s, ÌH, C9­OH); 13,399 (s, 1H, C7­ OH); 14,844 (s, 1H, N­H) 13C­NMR (125 M Hz, DMSO­d6) (ppm) 7,45 (CH3­15); 20,37 (CH3­12); 30,99 (CH3­Í4); 31,51 (CH3­10); 56,92 (C­9b); 101,00 (C­4); 102,07 (C~6); 102,59 (C­9a); 104,88 (C­2); 106,60 (C­8); 122,03 (C­6’); 126,94 (C~4’); 129,21 (C­5*); 129.55 (C­3’); 133,69 (C~2’); 133,93 (C­D; 155,64 (G­4b); 157,34 (C~9); 162,57 (C­7); 174,11 (C­1I); 175,06 (C­4a), ,8 (0 ); 198,44 (C ­I); 200,92 (0­13) 3.1.5 (E)-6-acetyI-7,9-dihydroxy-8,9b-dim ethyI-2-(l-(3-(trifluorom ethyI) phenylam ino)ethyliđene) dỉbenzoíb,d]fiiran~l,3(2H ,9bH )­dion5: từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu tinh thể h nh kim, màu vàng nhạt (326,3 mg, 67 %); tone = 158­160 oC ; R f = 0,43 (EA ­ n­hexan ­ M eOH, 3:7:0,1) IR (KBr), V(cm ­l) 1698 (vC=0); 1628 (vC=0, vC=C); 1549 (vOO) ưv Xmax (nm, CH30H) 295; 223 ESI­MS (m/z) C25H 20F3N 06; lý thuyết: 487,1243; thực tế: 487,1164 IH­NMR (500 MHz, DMSO­dó) (ppm), J (Hz) 1,710 (s, 3H, CH3­10); 1,977 (s, 3H, CH3­15); 2,532 (s, 3H, CH3­12); 2,650 (s, 3H, CH3­14); 6,011 (s, 1H, C4­H); 7,753 (t, ÌH, J = 5,5 Hz, C 4’ ,c& ); 7,801 (d, 2H, J 5,5 Hz, C 4’ ,C 6’); 7,856 (s, 1H, C2’); 11,915 (s 1H, C9“OH); 13,399 (s, ĨH, C7­OH); 14,844 (Sí 1H, N­H) 13C­NMR (125 MHz, DMSO­d6) s (ppm) 7,48 (CH3­Í5); 20,36 (CH3­12); 31,02 (CH3­14); 31,54 (CH3­10); 56,83 (C­9b); 100,95 (C­4); 102,19 (C­6); 102,60 (C­9a); 104,91 (C­2); 106,53 (C­8); 122,95 (C­6’); 124,75 (C­2’)í 130,17 (C­4­); 130,29 (C­ 5’);4 Í3 ,7 (C­3’); ,7 (C ­r); 155,65 (C­4b); 157,39(C­9); 162,60(0­7); 173,72(C ­U ); 174,30(C­4a), 189.56 (C­3); 198,33 (C ­l); 200,92 (C­13) 3.1.6 (E)-6"acetyI-7,9-dihydroxy-8,9b-dim ethyl-2> (l-(4-(trittuorom ethyI) phenylam ino)ethy idene) dsbenzo[b,d]furan­l,3(2H ,9bH )­dion6: từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu tinh thể h nh kim, màu trắng ngà (31.6,5 rag, 65 %); tone = 169­171 oC ; R f = 0,48 (EA ­ n­hexan ­ M eOH, 3:7:0,1) IR (KBr), V (cm­1) 1699 (vOO); 1635 (vC=0, vC=C); 1545 (vC­O) u v Xmax (nm, CH30H) 294; 223 ESĨ­MS (m/z) C25H20F3N06; lý thuyết: 487,1243; thực tế: 487,1138 1H­NMR (500 MHz, DMSO­d6) (ppm), J (Hz) 630 1,720 (s, 3H, CH3­10); 1,995 (s, 3H, CH3­15); 2,562 (s, 3H, CH3­12); 2,658 (s, 3H, CH3­14); 6,029 (s, 1H, C4“H); 7,651 (d, 2H, J = Hz, C T ,C6’); 7,889 (đ, 2H, J = Hz, C \ C51); 11,887 (s, 1H, C9­OH); 13,404 (s, 1H, C7­OH); 14,937 (s, 1H, N­H) 13C­ NMR (125 MHz, DMSO­d6) (ppm) 7,49 (CH3­15); 20,46 (CH3­12); 31,02 (CH3­14); 31,51 (CH3­10); 56,89 (C­9b); 100,95 (C­4); 102,18 (C­6); 102,75 (C­9a); 104,91 (C­2); 106,55 (C­8); 112,96 (C4’­CF3); 124,75 (C­61); 126,61 (C­2’); 126,63 (C­5*); 126,72 (C­ 3’); 128,32 (C­4 ); 139,51 ( C ­ l’); 155,64 (C­4b); 157,37 (C­9); 162,59 (C­7); 173,83 (C­ 11); 173,99 (C­4a), 189,64 (C­3); 198,39 (C ­l); 200,95 (C­13) 3.1.7 (E)-6-acetyl-2-(l-(3-chloro-2-m ethylphenylam ino)ethylidene)-7,9-dihydroxj-8,9b-im ethyldibenzo [b,d]fu ran ­l,3(2H ,9b H )­dion7 : từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu tinh thể, m àu trắng ngà (379,9 mg, 78 %); tone == 172­173 oC; R f = 0,47 (EA ­ n­hexan ­ MeOH, 3:7:0,1) IR (KBr), V (cm­1) 1699 (vC =0); 1635 (vC=0, vC=C); Ỉ542 (vC = 0) u v Xmax (nm, C H 30H ) 296; 222 ESI­MS (m/z) C25H22CỈNOÓ; lý thuyết: 467,1136; thực tế: 487,1143 1H­NMR (500 MHz, DMSO­d6) (ppm), J (Hz) 1,727 (s, 3H, CH3­ 10); 1,992 (d, 3H, CH3­15); 2,270 (s, 3H,C6H4­CH3); 2,449 (s, 3H, CH3­12); 2,662 (s, 3H, C H 34 4); 6,005 (s, 1H, C4­H); 7,379 (t, 2H, J = Hz, C \C ’); 7,547 (t, 1H, J ==5 Hz, C ’); 11,980 (s, 1H, C9­OH); 13,397 (s, 1H, C7­OH); 14,688 (s, 1H, N­H) 13C­NMR (Ỉ25 MHz, DMSO­d6) (ppm) 7,46 (CH3­15); 14,97 (C6H4­CH3); 20,26 (CH3­12); 30,99 (CH3­14); 31,58 (CH3­10); 56,73 (C­9b); 100,93 (C­ 4); Ỉ02,16 (C­6); 102,37 (C­9a); 104,95 (C­2); 106,50 (C­8); 125,82 (C­6’); 127,72 ( ); 129,10 (C­5*); 132,08 (C­3’); 134.46 (C -T); 136,42 (C -V); 155,62 (C­4b); 157,43 ( ) ; 162,55 (C­7); 173,79 ( C ­ ll); 174,67 (C a); 189,63 (C­3); 198,09 (C ­i); 200,88 (C­13) 3.1.8 (E)‘ 6-acetyI-2-(l-(5-chioro-2-rahyIphenylammo)etìiylidene)-7,9-dihydroxy-8,9b-dlmethyldibenzo [b,d]furan­l,3(2H ,9bH )­dio n8: từ 344 mg (I mmol) acid (+) usnic Ehu sản phẩm (418,8 mg, 86 %); tone ~ 234­236 oC; Rf = 0,46 (EA ­ n­hexan ­ MeOH, 3:7:0,1) ]R (KBr), V(cm­1) 1698 (vC=0); 1629 (vC=0, vC=C); 1553 (vC=0) ƯV Xmax (nm, C H 30H ) 295; 220 ESI­MS (m/z) C25H22C1N06; lý thuyết: 487,1243; thực tế: 487,1149 1H­NMR (500 MHz, ĐMSO­đ6) (ppm), J (Hz) 1,736 (s, 3H, CH3­10); 2,002 (d, 3H, CH3­15); 2,220 (s, 3H,C6H4­CH3); 2,474 (s, 3H, CH3­12); 2,678 (s, 3H, CH3­14); 6,032 (s, 1H, C4­H); 7,441 (d, 2H, J3 ’~ ’= 8,5 Hz, C3’ ,C4’); 1,552 (s, 1H, C6’); 12,012 (s, 1H, C9­OH); 13,414 (s, ỈH, C7­OH); 14,648 (s, 1H, N­H) 13C­NMR (125 M Hz, DMSO­d6) (ppm) 7,48 (CH3­15); 16,92 (C6H4­CH3); 20,24(C H342); 31,03 (CH3­14); 31,55 (CH3­10); 56,74 (C­9b); 100,97 (C­4); 102,21 (C­6); 102,39 (C­9a); 104,98 (C­2); Ỉ06.50 (C­8); 126,40 (C­6’); 128,31 (CM’); 130,76 (C­3’); 132.47 (C­5*); 132,82 (C­2’); 136,22 (C ­ r) ; 155,68 (C­4b); 157,45 (C­9); 162,54 (C­7); 173,81 (C­Ỉ1); 174,68 (C~4a); 189,62 (C­3); 198,12 (C ­l); 200,96 (C­13) 3.1.9 (E )-7 ,9 -d ih yd ro xy-6 -((Z )-l-(h yd ro x yim in o )eth yI)-8 ,9 b -d im ethy l-2 -(l-(3 (triflu o ro m e th yl) phenyiam ino)ethyUdene)đỉbenzo[b,đ]furan-Ì,3(2H,9bH)-đỉon9: từ 100 mg (0,2 mmol) dẫn chất V thu s n phẩm (9) tinh thể h nh kim, màu trắng ngà (67,3 mg, 67 %); tone = 120­122 oC; R f = 0,35 (HA ­ n­hexan ­ MeOH, 3:7:0,1) ĨR (KBr), V (cm­1) 1692 (vC=0); 1630 (vC= 0, v€=C ); 1546 (vC =0) v Ằmax (nm, CH3ỎH) 313; 275; 226 ESI­MS (m ỉz) C25H21F3N206; lý thuyết: 502,1352; thực tế: 50 2,1 251.1H­NMR (500 MHz, DMSO~d6) (ppm), J (Hz) 1,682 (s, 3H, CH3­10); 1,999 (sf 3H, CH3­15); 2,349 (s, 3H, O B ­ 12); 2,526 (s, 3H, CH3­14); 5,888 (s, 1H, C4­H); 7,753 (t, 2H, J2’~6 ’= 5,5 Hz, C 2’ ,C6’); 7,791 (d, 2H, J2 ’~ ’= 5,5 Hz, C2’ ,C6’); 7,851 (s, 2H, C2f); 11,178 (s, 1H, C9­OH); 11,497 (s, 1H, N­OH); 12,105 (s’ 1H, C7­ OH); 14,906 (s, ỈH , N~H) 13C­NMR (125 MHz, DMSO­d6) (ppm) 8,27 (CH3­15); 20,27 (CH3­12); ỉ ,64 (CH3­14); 31,67 (CH3­10); 57,00 (C­9b); 101,28 (C­4); 102,69 ( ) ; 103,97 (C­9a); 104,33 (C­2); 106,75 (C­8); 122,95 (C­6’); 124,64 (C­2’); 129,70 (C A '); 130,22 (C­5’); 130,36 (C­3’); 136,83 (C­1*); 154,97 (C­4b); 157,36 (C­9); 157,40 (C­7); 173,95 (CM ỉ); 174,42 (C­4a), 189,79 (C­3); 198,68 (C­1); 201,08 (C­13) 631 3.1.10 (E)-2-(l-(5-chloro-2-m ethylphenylam ino)ethylidene)-7,9-dihydroxy-6-((Z)-l- (hydroxyim ino) ethyI)­8,9b­tU m eth ykpenzo[b,d ]furan­l,3(2 H ,9bH )­dio nlO : từ dẫn chất V (122 fil; 0,25 mmol) thu tinh thể h nh kim, màu trắng ngà (87,9 mg, 70 %); tone = 175­177 oC; R f = 0,37 (EA ­ 11­hexan ­ MeOH, 3:7:0 I), m (KBr), V(cm ­I) 1698 (vC = 0); 1630 (vC=0, vC=C); 1556 (vC= 0) u v Xmax (nm, CH 30H ) 279; 223 ESI­MS (m/z) C25H23C1N206; lý thuyết: 482,1245; thực tể: 482,1226 1H­NMR (500 MHz, ĐMSO­ d6) ã (ppm), J (Hz) 1,982 (s, 3H, CH3­10); 2,002 (d, 3H, CH3­15); 2,202 (s, 3H,C6H4­CH3); 2,452 (s, 3H, CH3­12); 2,656 (s, 3H, CH3­14); 6,000 (s, 1H, C4­H); 7,431 (d, 2H, J3*­4 ’= Hz, C 3’ ,C4’); 7,527 (s, 1H, C6’); 11,490 (s, 1H, N­OH); 12,088 (s, 1H, C9­OH); 13,400 (s, 1H, C7­OH); 14,646 (s, 1H, N­H) Ỉ3C­ NM R (125 MHz, DMSO­d6) (ppm) 7,47 (CH3­15); 16,93 (C6H4­CH3); 20,14 (CH3­12); 31,01 (CH3­14); 31,67 (CH3­10); 56,91 (C­9b); 101,26 (CA); 102,17 (C­6); 102,45 (C­9a); 104,35 (C­2); 106,7.0 (C­8); 126,39 (C­6’>; 128,20 (C­ ’); 130,75 (C­3’); 132,43 (C­5’); 132,78 ( ’); 136,30 (C­1*); 154,95