NGHIÊN u CHẨN ĐỐN NHANH STAPHYLOCOCCI VÀ TÍNH ĐÈ KHÁNG METHICILLIN CỦA CHÚNG BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI Những người thực hiện: Trần Thanh Loan, Trương Đình An Sơn Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Kỹ thuật Y Dược Đà Nắng Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Đình Bỉnh Bộ mơn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Huế ĐẶT VÁN ĐỀ stảphyỉococci ỉà tác nhân gây nhiều nhiễm khuẩn thường gặp, chúng gây nên nhiều bệnh lý khác nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn da, nhiễm khuẳn đường tiết niệu, nhiêm khuẩn vết thương, vết bỏng, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn huyểt, viêm tủy xương.,.[2], [3], [4], [5] Các nhiễm khuần staphyiococci thương điều irị khó khăn vi khuển kháng íhuốc, nhiều cac staphylococci kháng thuốc, đa kháng thuốc phân lập từ bệnh nhân Các vi khuẩn kháng Methiciliỉn íhường kháng với nhiều thuốc khác, nên xem “siêu vi khuẩn”[2], [3], [6] Việc chẩn đoản sớm nhiễm khuẩn staphylococci tính kháng thuốc chúng có vai trị quan trọnp điều trị Nhiều nghiên cứu ứng dụng yểu to tạo nên độc lực mạnh cua Staphylococci yếu tố xâm nhiêm, sinh độc íố, sinh men phân huy protein, chất diệt bạch cầu Trong đó, FemA, Coagulase thị thường dùng để phát staphylococci có độc lực phịng thí nghiệm Tại Việt Nam, nghiên cửu liên quan đến chần đoán, phát độc lực staphylococci tính kháng Methỉciliin phương pháp truyền thống, nhiên nghiên cứu ve kỹ thuạt sinh học phân tư đe phát gen mã hóa FemA, yếu tố độc iực Staphylococci Coagulase gen mecA đề kháng Methicillin staphylococci chưa có nhiều t2] ~ Đê tài: “Nghiên cứu chân đoán nhanh Staphylococci tính đề kháng Methiciliin chúng kỹ thuật PCR đa mồi” nham mục tiêu xây dựng quy trỉnh chẩn đốn nhanh staphylococci, xác định gen mã hóa FemA, yếu íố độc !ực Coagulase tinh đề kháng kháng sinh Methicillin chúng kỹ thuật PCR so sánh với phương pháp chẩn đốn Staphylococci phịng thí nghiệm truyền thống, phát Coagulase tính đe kháng kháng sinh Methicilỉin chúng ĐÓI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu Đối tượng nghiên cứu - 80 chủng VI khuẩn staphylococci gồm 45 chủng S.aureus 35 chủng staphyococci coaguỉase âm tính phân iập phương pháp ntioi cấy thường quy - Cac chủng vi khuẩn làm chứng gồm 01 chủng s aureus có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+), 01 chủng vi khuẩn Streptococcus pyogenes (chứng âm Coagulase (-), mecA (-), FemA (-) Vậỉ liệu nghiên cứu 2.1 Hóâ Chat, sinh phẩm - Các loại môi trường nuôi cáy thực kháng sinh đồ: Mơi trường ni cấy: íhạch máu, thạch thưởng, Chapman, BHI, Muelíer HỈnton Agar, mơi ỉrường sinh vậí hóa học - Các loại vật iíệu khác: Thuốc nhuộm Gram, Huyết tương thỏ, H20 3%, Nước muối sinh lý vô khuẩn, loại đĩa kháng sinh Oxacillin Cefocitin - Các loại hóa chất để thực PCR: Agarose, duncj dịch điện di, Ethidium Bromide, thang DNA chuan 2.2 Thiết bị, dụng cụ - Các loại thiết bị: Tu ấm 350C 370C, máy iắc rung (Vortex), tủ lạnh, loại máy ly tâm, tủ an íồn sinh học, máy luân nhiệt, buồng điện di, bàn đèn đọc kết điện di - Các loại dụng cụ: Đèn cồn, kẹp đĩa kháng sinh, thước đo đường kính vỏng ức chế, khun cấy, tăm bơng vơ khuẩn, loại vật iỉệu đề thực PCR Phương pháp nghiên cứu 3.1 Kỹ thuật nuôĩ cắy định danh vi khuẩn Staphylococci Các bệnh phẩm cấy môi trường đặc, lỏng tùy theo yêu cầu kỹ thuật loại mẫu ngNệm Khi có khuẩn lạc nghi ngờ (màu vàng Chapman, tan máu B thạch máu ), làm phiến phếí nhuộm Gram kiểm tra hình thải Tiến hành phân lập định danh theo quy trình truỵền thống chẩn đốn Staphylococci là: cầu khuan Gram dương đứng đám, catalase dương tính, xác định Staphylococci có tiêu chuẩn sau: sắc íố vàng, lên men đường mannit, có coagulase dương tính Các Síaphyiococci coagulase âm tính có hay khơng lên men đường mannit, coaguỉase âm [2J,[333.2 Kỹ thuật phát vi khuẩn staphylococci kháng Methicillin qua trung gian mecA kỹ thuật sử dụng đĩa Cefoxitin (Theo CLSl 2011): Với khoanh giấy cefoxitin 30ụg tren môi trường Mueiler Hinton Agar, Điều kiện nuôi cấy: 33-35 °c/16 18 Đọc kết quả: ắ 21 mm = mecA diPơng tính; ằ 22 mm = mecA âm tính [1] 3.3 S dụng kỹ thuật PCR tìm gen mã hóa FemA, Coagulase gen mecA - Tách chiết DNA từ khuẩn lạc staphylococci: Tách chiết DNA phương pháp nhiệt DNA vi khuẩn chuẩn b ĩ cách lấy khuẩn lạc cho vào ống eppendorf có chứa 250 MÍ nước cẩt Huyền dịch vi khuẩn chưng cách thủy nhiệt độ 990C 10 phút Sau đo quay ly íam 10.000 vổng/phút trorìg 10 phút Bỏ phần cặn lắng, lấy phần dịch noi đề sử dụng cho phản ứng PCR [2], ự ], [8] 514 - Cặp mồi (Primers): Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Tt Primers Coagulase 5'-ATAGAGATGCTGGTACAGG-3’ 5'-GCTTCCGAĨTGTTCGATGC-3 mecA 5-CCTAGTAAATGCTCCGGAA-3’ 5’-CTAGTCCATTCGGTCCA-3 FemA 5'-AAAAAAGCACATAACAAGCG-3‘ 5’-GATAAAGAAGAAACCAGCAG-3' * Thực phẫn ứng PCR Một phản ứng PCR y=25|il gồm: 1.5mM MgC!2, 200 ịjM loại dNTP, 0,625 unit Taq DNA polymerase, 0,5ụM mồi, Taq buffer, nưởc cất iần* Các bước tiến hành: Đối với mẫu, thực sau: 20|il mix PCR pha + 5ịi\ dịch DNA tách chiết, cho vao eppendorf 0,2mi Đặt chường trình cho máy iuân nhiệt hoạt động: Bước 1: 95°c phút chu kỳ 95°c 30 giây Bước 2: 51°c 40 chu kỳ 30 giâv 72°c 30 giây Bước 3: 72°c phút chu kỳ sân phấm Chức nănq Tham khảo từ 603-872 Coaguíase Hookey eí (1998) [3] 314 MRSA Nizami Duran (2012) [6] 132 S.aureus Nizami Duran (2012) [6] Điện di để phát sản phẩm PCR: sản phẩm tạo thành điện di điện 80V, thạch agarose % nhuộm với chất màu huỳnh quang tự nhiên đọc kết buồng đọc huỳnh quang Sự diện cua sản phẩm so sánh với thang mẫu ĐNA ladder 100bp X lý số liệu: Xử lý số liệu thu thập đưực phương pháp thống kê y học Độ nhạy độ đạc hiệu thử nghiệm tính theo cơng thức bảng 2x2 ià: Độ nhạy = a/a+c; Độ đặc hiệu = d/b+d [9] KẾT QUẢ NGHIỀN cứu Tính chất sỉnh vật học staphylococci phân lập Bảng Tính chất sinh vật học staphylococci Tính chất Vi khuẩn ' S aureus Staphylococci coagulase âm tính Câu khuấn Gram (+) n % 45 100,0 35 100,0 Catalase (+) Mannit (+) n % n % 45 100,0 45 100,0 35 100,0 14 40,0 Coagulase (+) n % 45 100,0 0 Tan máu {+) n % 39 86,7 sẳc íố vànq n % 45 100,0 28 29 80,0 82,9 Các Staphylococci định danh xác định độc Bảng Kiểu gen mã hóa chủng vi khuẩn, độc lực lực phướng pháp truyền thống dựa vào tiêu bẩn kháng Methiucillin cùa chủng staphylococci nhuộm Gram, tính chất Caíalase dương tính, làm đơng khảo sát Các chủng huyết tương, lên men đường Mannit, tính chất tan máu FemA mecA Coagulase Số chủng thử vi khuẩn khuẩn íạc có sắc tố màu vàng í+ì í-ì (+) {-) í+ì (-) 45 45 •40 45 Đặc điểm kiểu hình kĩểu gen độc iực S.aureus sta coa (-) 35 32 15 10 32 kháng Methiciliin hai nhóm staphylococci Tổng cộng 80 48 32 55 25 48 32 khảo sát 100,0% chủng có S.aureus có Coagulase dương Bảng Tính kháng thuốc Methiucillin tính với thử nghiệm Coagulase phiến kính có gen mã hóa Coagulase, staphylococci Coaguiase Tính kháng Methiciilin test Số Các chùng vi Cefoxitin qua trung gian mecA âm tỉnh (thử nghiệm Coagulase trơn phiến kính chủng khuẩn Khánq Nhạy ống nghiệm) có 8,6% (3 chủng) có gen mã hóa thừ N % n % Coagulase S.aureus 45 40 88,9 11,1 100,0% chủng có s.aureus có Coaguiase dương sta coa (-) 35 15 42,9 20 57,1 tính với thử nghiệm Coagulase phien kính có Tống cộng 80 55 68,8 25 31,2 gen mã hóa FemA, staphylococci Coagulase âm tính (thử nghiệm Coagulase tren phiến kính trung gian mecA qua test Cefoxitin kết quà cho thấy ống nghiệm) có 8,6% (3 chùng) có gen mã hóa FemA chùng S.aureus kháng Cefoxitin đếrì 88,9%, 88,9% chủng có S.aureus có gen mã hóa mecA, chùng staphylococci coaguiase âm tính kháng Staphylococci Coagulase âm tính có 42,9% (15 Cefoxitin chi CO 42,9% Tỳ !ẹ đề kháng chung chủng) có gen mã hóa mecA chủng Staphylococci 68,8% 515 11 12 1314 15 Lane 7: DNA ladder Lane 14 chủng s.aureus kháng Methiciilin (chứng dương có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+) Lane 15: Chung V! khuẩn Streptococcus pyogenes (chứng âm có Coagulase (-), mecA (-), FemA (-), Lanes 2, 3, 9: chủng vi khuẩn có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+) Lanes 1,2, 3, 5, 6, 8, ,1 ,1 , 13: chùng vi khuẩn có FemA (+) Lanes 4, 10: chủng vi khuẩn chứng Ps aeruginosa, E.coli CÓ FemA (-) Bảng Đánh giá giá trị kỹ thuật xác định Coaguíase chủng S.aureus "■\i$ếí PCR Test Coagầse^, S.aureus Coagulase (+) Staphylococci Cốgúlase (-) Tổng cộng Có gen mã hóa Coagulase Khơng có gen mã hóa Coagulase Tổng cộng 45 45 32 35 48 32 80 Độ nhạy kỹ thuật truyền thống xác định Coagulase cùa staphylococci 93,8%, kỹ thuật truyền thống bỏ sót chủng staphylococci có gen mã hóa Coagulase Độ đặc hiẹu cua kỹ thuật truyen thống xác định Coagulase chủng Staphylococci 100 ,0% Bảng So sánh kỹ thuật xác định tính kháng Methiciliin S.aureus PCR Kỹ thuật Tồng MecA (+) MecA {-) Cefoxitin (+) 40 40 Cefoxitin (-) 5 40 Tống 45 Độ nhạy kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát tính kháng Methicillín s.aureus !à 100,0%, độ đặc hiệu 100,0% Bảng So sánh kỹ thuật xác định íính kháng Methicillỉn staphylococci coagulase âm tính Kỹ thuật Cefoxitin (+) Cefoxitin (-) Tống PCR MecA (+) 15 15 MecA (-) 20 20 Tồng 15 20 35 Độ nhạy kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát tính kháng Methiciilin staphylococci coagulase âm tính 100,0%, độ đặc hiệu 100 ,0% BÀN LUẬN Nghiên cứu 80 chùng staphylococci định danh xác định độc lực phương pháp truyền thống dựa vào tiêu nhuộm Gram, tính chất Catalase dương tính, làm đơng huyết tương, lên men đường Manrtit, tính chất tan máu khuẩn lạc có sắc tố màu vàng Dựa vào tính chất này, định danh xác S.aureus staphylococci coagulase âm tính Thời gian để định danh hết 40-48 Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi để xác định gen mã hóa FemA, ịoaguiase gen mecA đề kháng Meíhicĩllin chủng vi khuẩn cùa hai nhóm Staphylococci, kết có 48 chủng vi khuẩn Staphylococci có gen mã hóa Coaguiase, chiếm 60,0%, 100 ,0% chủng s.aureus có Coagulase dương tính với thử nghiệm Coaguiase phiến kính có gen mã hóa FemA, Coaguiase, nhiên với chủng staphylococci Coagulase âm tính (cả với thử nghiệm ịoagulase 516 phiến kính ống nghiệm) lại có đến 8,6% (3 chủng) có gen ma hóa ồoagúlase đồng thời chúng có gen mã hóa FemA Qua so sánh íhẩy độ nhạy kỹ thuật truyền thống xác định Coagulase cho thấy với nhóm staphylococci 93,8%, S.aureus độ nhạy đến 100,0% độ đặc hiệu với nhóm staphylococci coagulase âm tính 100,0%, nhiên, kỹ thuật khơng xác định gen coagulase nên dùng PCR thi có chùng có gen Coaguỉase Sử dụng kỹ thuật kháng sinh đồ khuếch tán thạch theo phương phập Kirby-Bauer để xác định tính kháng Methicillin đĩa kháng sinh Cefoxitin 1qua ỉrung gian MecA, kết chủng s.aureus có 88,9% kháng Coxiỉin, cịn chủng Staphylococci coagase âm tính kháng Cefoxitin !ai đến 42,9% Kết quà PCR xác định gen mecA, nhận thấy 88,9% chủng s.aureus có gen mecA 42,9% Staphylococci coaguiase âm tính có gen mecA Qua so sánh thấy độ nhạy cùa kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát tính kháng Methicillin S.aureus staphylococci coagulase âm tính 100,0%, độ đặc hiệu íà 100,0% Tác giả Venkatakrỉshna Rao (2011) đánh giá hiệu phương pháp khoanh giấy khuếch tán với đĩa Cefoxitin 30 jjg, kết ghi nhận độ nhạy độ đặc hiệu đĩa Cefoxitin phát tính kháng Methicillin qua trung gian mecA cỏ độ nhạy độ đặc hiệu íà 100% [7] Chúng tơi xây dựng quy trình PCR đa mồi để xác định gen mã hóa FemA, Coagulase gen mecA staphylococci kỹ thuật đa mồi Chúng lựa chọn thiết kế cặp mồi để xác định gen mã hóa FemA, Coaguiase mecA có kích thước sản phẩm khác biệt, chúng tách xa trinh điện di, tạo băng cách biệt nên dễ dàng nhận xét kết quả, tăng cao độ tin cậy đánh giá kết Các tác giả khác có gợi ý tương tự [2],[3],[43,C5],[8] Quy trình tương đối đơn giản, dễ thực tất phịng thí nghiệm hay phịng xét nghiệm có phương tiện cho PCR Kết nhanh chóng xác, rát hữu ích cho lâm sàng để kịp thời điều trị nhiễm khuẩn Staphylococci Nếu so sánh với quy trình chẩn đốn Staphylococci xác định tính kháng Methiciiiin theo phương pháp truyền thống, nhận thấy: - Phương pháp truyền thống: cho kết sớm 40-48 kể từ lấy mẫu nghiệm (nhuộm, nuôi cấy, xác định coagulase, kỹ thuật đĩa kháng sinh) - Kỹ thuật PCR: cho kết sớm 20“24 (nhuộm, nuôi cấy, PCR) Với kỹ thuật cặp mồi (triplex PCR) xác định gen mã hóa FemA, Coaguiase gen mecA cùa chúng tơi, kết hồn tồn đáng tin cậy, kỹ thuật thực khơng q phức tạp, phịng thí nghiệm bệnh viện tuyến tỉnh tiến hành nhằm chẩn đốn sởm, xác nhiễm staphyiococci tính kháng thuốc chúng để có hướng điều trị kịp thời KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 80 chủng staphylococci phương pháp xét nghiệm vi sinh truyền thống sử dụng kỹ thuật PCR, xây dựng quy trỉnh PCR cặp mồi (tripiex PCR) để xác định gen FemA, gen mã hóa độc lực Coagulase gen mecA Quy trình thực bệnh viện tuyến tỉnh để chần đốn sớm, xác cấc nhiễm khuẩn staphyiococci tính kháng thuốc chúng để điều trị hiệu TA! LIỆU THAM KHẢO Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSi) (2011), Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement, M 100-S21.JISSBN 1-56238-742-1) Trần Thu Hoa, Đỗ Thị Lan Hương, Nguyễn Thị Ngọc Loan, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2009), "Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm multiplex PCR phái Staphylococci đề kháng Methỉciilin”, Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 13, Phụ số 2, tr 176-180 Hookey J.v, Richardson J.F and Cookson B.D (1998), “Molecular typing of staphylococci Based on PCR Restriction Fragment Length Poiymorphis and DNA Sequence Analysis of the Coagulase gene” J of Clin Microbiol, Voi 36 (4), pp 1083-1089 Kalhor H, Shariati L, Validi M et al (2012), “Comparison of Agar screen and duplex PCR methods in determination of MRSA strains isolated from nasal carriage” African J of Microbiology Research, Vol 6(16), pp 3722-3726 Motiagh Mohammad Reza Safari, Maesumeh Anvari (2010), “Rapid detection of meỉhicillỉn-resistaní Staphylococci by multiplex PCR", African Journal of Biotechnology, Vol 9(45), pp 7629-7631 Nizami D, Burcin o , Gu!ay G.D et al (2012), Antibiotic resistance genes & susceptibility patterns in Staphylococci, Indian J Med Res, 135, pp 389-396 Rao Venkatakrishna, Bhat Kishore, Kugaji Manohar, Pai Vidya, Shantaram Manjula (2011), “Detection of Methiciliin Resistance in staphylococci: Comparison of Disc diffusion and MIC with mecA gene detection by PCR”, international Journal of Pharmacy and Biological Sciences, Voi 1, Issue 4, pp 518-521 Thean Y Tan (2002), “A Comparison of PCR detection of mecA with two standard methods of oxacillin disk susceptibility testing for coagulase- negative Staphylococci”, Journal of Medical Microbiology, Vol(51), pp 83-85 Phạm Hùng Vân (2006), Kỹ thuật xét nghiêm vi sinh lâm sàng Nhà xuất Y học 517 ... định coagulase, kỹ thuật đĩa kháng sinh) - Kỹ thuật PCR: cho kết sớm 20“24 (nhuộm, nuôi cấy, PCR) Với kỹ thuật cặp mồi (triplex PCR) xác định gen mã hóa FemA, Coaguiase gen mecA cùa chúng tơi, kết... phát tính kháng Methicillin qua trung gian mecA cỏ độ nhạy độ đặc hiệu íà 100% [7] Chúng tơi xây dựng quy trình PCR đa mồi để xác định gen mã hóa FemA, Coagulase gen mecA staphylococci kỹ thuật đa. .. chủng Staphylococci 100 ,0% Bảng So sánh kỹ thuật xác định tính kháng Methiciliin S.aureus PCR Kỹ thuật Tồng MecA (+) MecA {-) Cefoxitin (+) 40 40 Cefoxitin (-) 5 40 Tống 45 Độ nhạy kỹ thuật