TIỂU LUẬN: CHẨN ĐOÁN VIRUS PMWS (PROCINE MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROM) BẰNG KỸ THUẬT GENE

Hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa PMWS (post weaning multisystemic syndrome) được ghi nhận lần đầu tiên trên một đàn heo ở Canada vào năm 1991. Trên đàn heo này, một số heo sau cai sữa khoảng 2 tuần bắt đầu có biểu hiện còi cọc và bắt đầu không có đáp ứng tốt với việc điều trị. Sau đó, một số trường hợp được ghi nhận ở Mỹ rồi đến các nước châu Âu. Cho đến năm nay, bệnh đã được phát hiện trên nhiều đàn heo ở Mỹ, nhiều nước Châu Âu

1 Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH Báo cáo tiểu luận môn Công nghệ sinh học trong thú y CHẨN ĐOÁN VIRUS PMWS (PROCINE MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROM) BẰNG KỸ THUẬT GENE Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Người thực hiện: NGUYỄN HOÀNG NGÂN Mã sinh viên: 06126086 2 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa PMWS (post weaning multisystemic syndrome) được ghi nhận lần đầu tiên trên một đàn heo ở Canada vào năm 1991. Trên đàn heo này, một số heo sau cai sữa khoảng 2 tuần bắt đầu có biểu hiện còi cọc và bắt đầu không có đáp ứng tốt với việc điều trị. Sau đó, một số trường hợp được ghi nhận ở Mỹ rồi đến các nước châu Âu. Cho đến năm nay, bệnh đ ã được phát hiện trên nhiều đàn heo ở Mỹ, nhiều nước Châu Âu và một số nước châu Á và gây thiệt hại kinh tế rất lớn trong ngành chăn nuôi heo công nghiệp ở những nước này. Hội chứng PMWS thường xuất hiện ở heo lứa tuổi từ 6 đến 18 tuần, tỷ lệ chết có thể dao động từ 1-2% đến 10-25% ở một số đàn heo. Bệnh xuất hiện với mộ t số triệu chứng điển hình như gầy còm nhanh, thở khó, tiêu chảy, thỉnh thoảng có một số heo bị vàng da, nhạt màu… PMWS thường hay kết hợp với virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo ( porcine reproductive respiratory syndrome virus- parasuis, PRRSV), virus cúm heo ( porcine parvovirrus-PPV), Haemophilus Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suit và Mycoplasma hyoppneumonia. 1997 nhóm nghiên cứu thuộc đại học Saskatchewan (Clark, Ellis, Harding, West) đã phân lập PCV2 từ những ca PMWS. Từ đó, người ta đã thực hiện thành công thí nghiệm gây nhiễm PCV2 trên heo. Báo cáo của Neumann và ctv (2002) cho biết những mẫu huyết thanh heo tại Mỹ lưu trữ từ năm 1969 khi đem xét nghiệm tìm kháng thể kháng virus PVC2 đã cho kết quả dương tính. Phương pháp hồi cứu những mẫu mô và huyết thanh lưu trữ bằng kỹ thuật mô hóa miễn dịch và lai trong mô cho thấy PVC2 từng lưu hành tại châu Âu vào những năm 1970 như không có tài liệu nào ghi nhận về bệnh do PVC2 gây ra vào thời điểm đó ( Tucker và ctv, 2006). 3 II. TỔNG QUAN 1. Tác nhân gây bệnh: • Circovirus thuộc họ virus có DNA mạch vòng, không có vỏ bao và chứa một bộ gen vòng đơn. • Dựa vào đó, tổ chức quốc tế về phân loại virus xếp chúng vào một họ mới của những DNA virus gọi là Circovitidae, giống Circovirus (Lukertvaf cộng sự,1995). • PVC có trọng lượng trong CsCl là 1.33-1.34 (Buhk và ctv, 1985) • Là loại virus nhỏ nhất được biết đến và có khả năng sống sót cao trong môi trường. 4 • Gồm có 2 tuyp được tìm thấy ở heo, bao gồm type 1 (PVC1) và type 2 (PVC2) • Bộ gen DNA của PCV1 gồm 1759bp và của PCV2 là 1768bp (Meehan và ctv,1997). • Bộ gen của PVC gồm 6 khung đọc mở (open reading frame – ORFs), ORF1 mã hóa cho protein tham gia vào quá trình nhân lên của virus và ORF2 mã hóa cho các gen cấu trúc của virus. • Trên heo hiện có hai loại PVC: PVC1 và PVC2 với bộ nhiễm sắc thể tương đồng khoảng 68-78%, trong đó ORF tương đồng khoảng 83% về trình tự nucleotide và 86% acid amin. PVC1 được xem như là virus nhiễm thường xuyên và tự nhiên trên tế bào thận heo PK15 và là virus không gây bệnh. Ngược lại, PVC2 được xem như là tác nhân gây PMWS. • PVC nhân lên tốt nhất trong môi trường tế bào PK/15. Sự nhân lên của virus có thể đánh giá bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang hoặc nhuộm miễn dịch peroxidase đối với hầu hết tế bào bị nhiễm PVC. Bằng kỹ thuật nhuộm nhân tập trung, thỉnh thoảng trên heo bị PMWS, bệnh tích thể bao hàm ưa kiềm trong tế bào chất của một số tế bào nhiễm PCV2 cũng được tìm thấy ( Clark,1997,Harding,1997,Allan và ctv,1999). a/ Circovirus type 1 (PVC-1): • Năm 1974, các nhà khoa học đã phân lập được Circovirus type 1 từ tế bào thận heo. • Hiện nay, chúng không gây bệnh cho heo. b/ Circovirus type 2 (PVC-2): 5 Figure 2. Morphology and genomic organisation of PCV2. A. The PCV2-virion consists of a capsid without envelope. B. The genome of PCV2 is a single stranded circular DNA molecule with a stem loop structure. C. A highly conserved nonanucleotide sequence is located on the top of the stem loop structure. Close to the stem loop structure the ORF2 starts on the viral strand coding for the capsid protein, in the other direction, on the complementary strand, starts ORF1 that codes for the Rep protein. 6 Figure3. Porcine circovirus type 2 (PCV2) with fine outer capsid • Được ghi nhận đầu tiên vào 1991 tại Tây Canada, phát hiện ở vết thương. • Bao gồm nhiều chủng khác nhau (kiểu sinh học và kiểu gen). Kháng thể trên PVC-2 đã được phát hiện ở huyết thanh heo nuôi tại Bỉ năm 1985. • Từ những kinh nghiệm nghiên cứu ban đầu cho thấy, khi gây nhiễm virus type 2 lên heo, heo sẽ biểu hiện những tổn thương đặc trưng của bệnh. Tuy nhiên, nếu một loại virus khác như Parvovirus heo (PPV) hay PRRSV được tiêm vào cùng một lúc thì heo cũng mang những biểu hiện tương tự. Những nguyên nhân gây ra bệnh thường là do nhiễm PCV type 2 hay một vài loại virus khác nhưng không phải tất cả heo bị nhiễm PCV và PPRS không có biểu hiện bệnh lý PMWS. • Những nghiên cứu về huyết thanh tại Châu Âu và Bắc Mỹ cho thấy, sự lây nhiễm lan rộng trong đàn heo nhưng chỉ một phần nhỏ đàn có huyết thanh 7 dương tính là từng biểu hiện bệnh lý. Điều này có vẻ như hầu hết những ca lây nhiễm có biểu hiện ngầm với bệnh. Heo con có thể bị nhiễm trước khi cai sữa. • Sức đề kháng: PCV2 đề kháng cao với nhiều chất sát trùng ( ethanol, chlohexidine, iodine và formaldehyde), có thể tồn tại trong môi trường suốt nhiều tháng, chịu đụng sức nóng 70 o C/15’ và không bị vô hoạt ở pH=3. Virus có thể được phân lập từ các mô lưu trữ ở -70 o C trong nhiều tháng (Ellis và ctv,1998). Sodiumhydroxide và Virkon S với độ pha loãng 1% có hiệu quả nhất trong việc bất hoạt PCV2 (Royer và ctv, 2001). • Bằng thực nghiệm, người ta ghi nhận PCV2 có thể lây truyền ngang dọc, theo các đường hô hấp, đường máu, nhau thai và sinh dục. • Virus tồn tại trong những heo mang trùng từ 5-6 tháng. Phân, nước tiểu, máu, dịch tiết ở mũi của những heo còn nhỏ bị nhiễm PVC2cos chứa acid nucleic của PCV2 và những phương tiện lan truyền virus trong đàn. • Thực nghiệm, gây nhiễm PCV2 cho heo nuôi thí nghiệm lúc một ngày tuổi, Krakowka và ctv (2001)đã phát hiện acid nucleic của PCV2 có trong phân, nước tiểu, nước mắt của héo sau 31 ngày gây nhiễm. • Ngoài ra, PCV2 cũng được tìm thấy trong tinh dịch của những heo đực nhiễm bệnh và sẽ lây truyền virus qua giao phối (Kim và ctv,2001). • Lây truyền dọc cũng được ghi nhận. Sự chết của bào thai và sẩy thai có liên quan đến sự nhiễm bệnh qua đường sinh dục (Bogdan và ctv,2001). 2. Cách gây bệnh. Cơ chế gây bệnh của PCV2 trên heo đến nay chưa được biết rõ. Tuy nhiên, qua phương pháp lây nhiễm trên heo sống, Misinzo và ctv (2006) đã phát hiện PCV2 có trong nhiều loại tế bào như tế bào gan, biểu mô, nội mô, lympho bào, tế bào cơ trơn và nguyên sợi bào. Krakowka và ctv (2001) gây nhiễm qua đường mũi hay tiêm tĩnh mạch của heo thí nghiệ m, các tác giả nhận thấy có sự 8 hiện diện của bạch cầu đơn nhân và đại thực bào trong phổi, hạch hạnh nhân, hạch lympho, lách và những cơ quan khác trong hệ thống miễn dịch; còn tại phổi, gan, thận, dạ dày-ruột và lách khoảng ngày 14-21sau gây nhiễm. Tình trạng nhiễm virus huyết xuất hiện lúc 14 ngày sau khi nhiễm và kéo dài 2-4 tuần. Sau khi gây nhiễm 21 ngày, phổi của thú có nhiều vùng bị xẹp và mất chức năng, hạch lympho sưng lớn và chuyển sang màu nâu Đối với hệ thống miễn dịch, PCV2 tấn công vào tế bào đích là các tế bào hình sao và tương tác với các tế bào dòng tủy (tế bào lympho B, lympho T, tế bào NK ngoại trừ tế bào bạch cầu đơn nhân lớn) làm giảm tế bào lympho tại hạch hạnh nhân và hạch lympho để lại bệnh tích vi thể rất đặc trưng. Mức độ cấp tính của bệnh tích vi thể và số lượng PCV2 trong bệnh tích liên quan chặc chẽ với mức độ nghiêm trọ ng của biểu hiện lâm sàng. PCV2 có thể làm hư hại hệ thống miễn dịch bằng cách ức chế miễn dịch. Ngoài ra, virus PCV2 còn tác dụng làm giảm tiểu cầu nghiêm trọng gây xuất huyết mô kéo dài. Sự tấn công của virus vào gan khởi đầu làm cho các tế bào gan, tế bào Kupffer, tế bào nội mô bị sưng và triễn dưỡng nên gan to ra. Sau đó, các tế bào này sẽ bị dung giải nên giảm số lượng và kích thướt tế bào gan teo lại, đồng thờ i mật có thể ứ lại trong các ống mật khiến gan trở nên vàng. 3.Nguyên nhân lây nhiễm. • Nhiễm từ tinh dịch heo bệnh, phân, phương tiện, vật dụng (quần áo, xe đẩy,…) hay từ những loài khác (Chuột, Chim,…) • Tiếp xúc giữa heo bệnh với heo khỏe mạnh. • Do Stress (trong quá trình vận chuyển, thay đổi môi trường, thay đổi chuồng trại,… • Do nhập nhiều heo với các độ tuổi khác nhau và chăn nuôi với mật độ dày đặc. 9 • Do thú sản xuất liên tục. 4. Triệu chứng a. Heo cai sữa và heo trưởng thành • Sốt 41 - 42 o C, đột tử, có thể xuất hiện những triệu chứng thần kinh. • Sụt cân, hốc hác, lông thô ráp, da tái nhợt, đôi khi bị vàng da, chậm phát triển (giai đoạn 6-8 tuần tuổi) và tai bị đổi màu. • Một số trường hợp, bệnh thường kèm với một số triệu chứng về hô hấp (khó thở do viêm phổi) và tiêu hóa (30% trường hợp bị tiêu chảy và loét dạ dày. • Ngoại vi hạch bạch huyết sưng to, đặc biệt là giữa hai chân sau của heo. Nếu ta dựng đỡ heo lên thì có thể thấy hạch bẹn có kích cỡ lớn như một quả banh golf. • Thường phát hiện triệu chứng viêm da suy thận (PDNS) trong những đàn bị PMWS. • Tỉ lệ heo cai sữa chết khoảng từ 6-10% nhưng thông thường cao hơn (20%). Tỉ lệ chết ở heo lớn hơn có thể lên đến 10%. • Những ca bệnh có thể kéo dài trong một đàn nhiều tháng. Chúng thường đạt đến đỉnh điểm sau 6-12 tháng và sau đó giảm từ từ. b. Heo nái và heo con: • Những con heo trưởng thành, heo nái và heo con không bị ảnh hưởng. • Hiếm khi một con heo mới thôi bú bị ảnh hưởng bệnh cho đến khi nó được 6 tuần tuổi. • Đôi khi những triệu chứng xảy ra tương tự như trên nhưng là do thú bị suy sinh dưỡng, thiếu nước, loét dạ dày, viêm ruột non do trực khuẩn, bệnh lý, PRRS và những bệnh khác… Lúc đó, chúng ta phải biết loại trừ nếu bệnh xảy ra cùng lúc hay theo sau PMWS. Mối quan hệ của hệ bệnh này không 10 được hiểu rõ nhưng mỗi bệnh có thể xuất hiện trong các đàn mà không cần có bệnh kia. 5. Bệnh tích: Mổ khám tử thi • Xác súc vật bị gầy và da vàng. • Lách và nhiều hạch bạch huyết sưng to. Tuy nhiên, vẫn phải đặt nghi vấn trong những trường hợp hình ảnh tuyến bạch huyết sưng to. • Thân bị sưng phồng với những đốm trắng nhỏ có thể quan sát bằng mắt từ bề mặt. • Phổi thường dính, có đốm phù nề, có vằn và dai • Ngực, mô và cơ quan ổ bụng bị phù nề hay úng nước. 6. Giới thiệu phương pháp PCR a. Nguyên tắc chung Thành phần cơ bản cho phản ứng PCR bao gồm: DNA bản mẫu, mồi xuôi, mồi ngược, dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl 2 , Tap polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu 3’của mạch khuôn. DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Mồi xuôi (forward primer: F) tác động lên sợi DNA theo chiều từ 3’->5’. Mồi ngược (Reverse primer: R) tác đọng theo chi ều từ 5’->3’. Phản ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai đoạn mới này. Phản ứng PCR cho phép khuếch đại từ một DNA ban đầu thành một số lượng lớn DNA và được thực hiện nhờ enzyme DNA polymerase không cần đến sự hiện diện của tế bào. Kỹ thuật này được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo ba giai đoạn sau: . DH06SH Báo cáo tiểu luận môn Công nghệ sinh học trong thú y CHẨN ĐOÁN VIRUS PMWS (PROCINE MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROM) BẰNG KỸ THUẬT GENE Giáo viên hướng. kỹ thuật phân lập virus. Quardani và ctv (1999) cho biết độ nhạy của kỹ thuật PCR trong phát hiện PCV2 có thể đạt đến 5pg DNA của virus. 7.Chuẩn đoán PMWS