Mặc dù hoạt tính của Taq pol được thể hiện qua việc khuếch đại thành công nhiều loại DNA, sản phẩm PCR vẫn còn xuất hiện sản phẩm phụ, điều này có thể do các đoạn DNA của vi khuẩn E.co[r]
(1)HỒN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME TAQ DNA
POLYMERASE Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM
Hồ Viết Thế*, Nguyễn Minh Phương, Ngô Thị Kim Anh
Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Email: thehv@hufi.edu.vn
Ngày nhận bài: 23/9/2019; Ngày chấp nhận đăng: 12/11/2019
TÓM TẮT
Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq pol) thành phần quan trọng phản ứng khuếch đại gen (PCR) Trong nghiên cứu này, plasmid pAKTaq chứa gen mã hóa Taq pol biến nạp thành cơng vào vi khuẩn E coli BL21 Tiếp sau đó, điều kiện biểu Taq pol xác định cách cảm ứng với IPTG mM 30 °C Phản ứng PCR sử dụng để đánh giá hoạt tính tương đối enzyme thu được, kết cho thấy enzyme thu sử dụng phản ứng PCR để khuếch đại DNA mục tiêu từ vi khuẩn, thực vật động vật Kết nghiên cứu tiền đề để sản xuất enzyme Taq pol có giá thành rẻ quy mơ phịng thí nghiệm
Từ khóa: E coli, enzyme, PCR, Taq DNA polymerase
1 MỞ ĐẦU
Polymerase chain reaction (PCR) kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuyếch đại đoạn DNA mong muốn tác dụng enzyme DNA polymerase để tạo hàng nghìn đến hàng triệu DNA Kỹ thuật PCR Kary Mullis phát minh năm 1985 [1] Phản ứng PCR sử dụng enzyme DNA polymerase để khuếch đại vùng DNA mục tiêu Trong đó, DNA polymerase phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquatitus (Taq pol) có trọng lượng phân tử dao động khoảng 66-94 kDa sử dụng phổ biến việc sản xuất đơn giản [2] Trong enzyme với kích thước 94 kDa có hoạt tính cao có thời gian bán phân hủy khoảng phút 95 °C Việc phát khả bền với nhiệt độ cao tổng hợp DNA enzyme thúc đẩy đời kỹ thuật PCR tự động Năm 1989, Saiki công phân lập và biểu Taq pol tế bào vi khuẩn E coli [2], làm bước tiến lớn để tăng quy mô sản xuất giảm giá thành sản xuất loại enzyme Tuy nhiên, giá thành Taq pol thương mại cịn cao so với mặt chi phí hoạt động phịng thí nghiệm có nhu cầu sử dụng số lượng nhiều enzyme Chính vậy, nhiều phịng thí nghiệm giới tiến hành nghiên cứu để làm chủ quy trình sản xuất Taq pol sử dụng cho công việc học tập nghiên cứu
(2)Ở Việt Nam, năm 2015, nhóm tác giả từ viện Di truyền Nơng nghiệp kết hợp với công ty Genbody Hàn Quốc báo cáo quy trình sản xuất Taq pol quy mơ phịng thí nghiệm [7] Trong nhóm tác giả sử dụng hệ thống vector chứa gen mã hóa cho Taq pol có nguồn gốc từ Hàn Quốc Kết thu Taq pol có hoạt tính phù hợp cho phản ứng PCR Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất Taq pol đơn giản quy mơ phịng thí nghiệm sử dụng vector pAKTaq có nguồn gốc từ cơng ty Addgene (Mỹ) Đây tổ chức chuyên cung cấp vector miễn phí khơng bị ràng buộc quyền nên nhóm nghiên cứu dễ dàng tiếp cận
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu
Vector pAKTaq công ty Addgene (https://www.addgene.org) cung cấp Các hóa chất sử dụng nghiên cứu sản xuất từ hãng Bioline (Anh); Biotum (Mỹ), Applied Biosystem (Mỹ) Các primer tổng hợp công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam)
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Biến nạp
Plasmid pAKTaq chuyển vào vi khuẩn E coli BL21 theo quy trình Sambrook cộng [8] sau vi khuẩn trải mơi trường thạch Luria Bertani (LB) (Biobasic, Canada) có bổ sung ampicilin nồng độ 100 µg/mL Khuẩn lạc đơn sau ni 37 °C mơi trường (LB) lỏng có chứa kháng sinh ampicillin 100 mg/mL Sinh khối vi khuẩn thu hồi ly tâm sử dụng để ly trích plasmid ISOLATE II Plasmid Mini Kit (Bioline, UK) theo hướng dẫn nhà sản xuất Các plasmid phân tách enzyme cắt giới hạn enzyme Eco RV enzyme Bam HI theo quy trình nhà sản xuất (New England Biolabs, Mỹ)
Sự diện xác gen mã hóa Taq pol xác định phản ứng PCR với cặp primer Taq1F 5’-CTCCTGGACCCTTCCAACAC-3’, Taq1R 5’-AGGTTGGGATCGGAGCTACT-3’ Phản ứng PCR thực tổng thể tích 20 µL bao gồm khuẩn lạc đơn; µL primer xi, µL primer ngược; 10 µL MyTaq TM HS Mix White; µL nước PCR (Bioline, Anh) Phản ứng khuếch đại DNA tiến hành máy PCR Agilent Cycler 8800 (Agilent, Mỹ) theo quy trình sau: biến tính ban đầu 94 °C phút; 35 chu kỳ tiếp theo: biến tính 94 °C phút, bắt cặp 60 °C 45 giây, kéo dài 72 °C phút; hoàn thiện phản ứng 72 °C phút, giữ °C phân tích Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% thời gian 60 phút, điện 110 V máy điện di Muid-one (Takara-Advance, Nhật Bản) Gel quan sát chụp hình ảnh máy chụp gel (Quantum ST4-3000, Nhật Bản) Sản phẩm PCR giải trình tự DNA phương pháp Sanger cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa Kết giải trình tự phân tích cơng cụ online NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) Khuẩn lạc chứa gen mã hóa Taq pol bảo quản glycerol (Biobasic, Canada) -80 oC đến sử dụng
2.2.2 Cảm ứng thu nhận enzyme
(3)ở nhiệt độ phịng Sau tế bào hịa tan dung dịch chứa Tris 20 mM (Biobasic, Canada) Tween 20 1% (Biobasic, Canada) Dung dịch vi khuẩn ủ nước đá 15 phút sau phá màng tế bào nhiệt 75 °C phút có lắc thường xuyên Dung dịch vi khuẩn sau ly tâm tốc độ 5.000 vịng/phút 10 phút Phần dịch chứa protein thu hồi bảo quản -80 °C sử dụng Nồng độ protein xác định phương pháp Bradford Sau µg protein tổng số điện di gel SDS-PAGE (Biobasic, Canada) với nồng độ gel gom 4% gel phân tách 12,5%, nhuộm với Coomassie Brilliant Blue (Sigma-Aldrich, Mỹ)
2.2.3 Đánh giá hoạt tính enzyme
Hoạt tính tương đối enzyme Taq pol so sánh với enzyme thương mại BIOTAQ DNA polymerase (Bioline, Anh) thông qua phản ứng PCR sử dụng cặp primer Taq800, thành phần phản ứng sau: Buffer 1X, MgCl2 mM, dNTP mM, µL primer xi, µL primer ngược, plasmid DNA 50 ng; BIOTAQ 0,5 µL (2,5 Unit), nước PCR cho đủ thể tích 25 µL (Bioline, Anh) Trình tự primer Taq800 trình bày Bảng Trong thí nghiệm này, plasmid vector pAKTaq sử dụng làm mạch khuôn cho phản ứng Trong phản ứng kiểm tra hoạt tính enzyme Taq pol tự sản suất, phản ứng PCR sử dụng 0,5 µL protein tổng thay cho 0,5 µL BIOTAQ Tiếp theo nồng độ enzyme Taq pol phù hợp cho phản ứng PCR khảo sát thông qua việc sử dụng 0,5 µL, 0,25 µL, 0,125 µL, 0,065 µL, 0,0325 µL protein tổng cho phản ứng PCR Sau enzyme Taq pol được sử dụng phản ứng PCR để khuếch đại đoạn DNA ly trích từ đậu nành thịt bị Trình tự primer trình bày Bảng
Bảng Trình tự primer sử dụng để kiểm tra hoạt tính tương đối Taq pol
Tên primer Trình tự (5’-3’) DNA mục tiêu thước (bp) Kích Nguồn
Taq800_F Taq800_R
CATCGGCAAGACGGAGAAGA AGAGCTTCACCATAGCCAGC
Plasmid
pAKTaq 800
Nghiên cứu Lectin-F3
Lectin-R3
GGCAAACTCAGC GGAAAC TGT
TTAGATGGCCTCATGCAACAC Đậu nành 772 [9]
Bos-F6
Uni-R
CATCAACTTCATTACAACAATTATC AACATAAAG
CCGAATGGTTCY TTTTTYCCYGAGTAGTA
Bò 311 [10]
Hai cặp primer Taq1 Taq800 thiết kế sử dụng trình tự plamid pAKTaq từ Addgene (Addgene, Mỹ) thông số mặc định chương trình Primer BLAST (NCBI, Mỹ) Nhiệt độ bắt cặp primer phát DNA đậu nành DNA bò 60 °C sử dụng 50 ng/µL DNA phản ứng Sản phẩm PCR xác định điện di so sánh với thang chuẩn kb HyperLadder™ (Bioline, Anh) Quy trình nhiệt phản ứng PCR phân tích kết tiến hành tương tự mô tả
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết biến nạp
(4)cứu loại enzyme nhằm chủ động lượng enzyme sử dụng Trong nghiên cứu này, sau trình biến nạp vector pAKTaq vào vi khuẩn E.coli BL21, diện gen mã hóa cho enzyme Taq pol vector kiểm tra enzyme cắt giới hạn enzyme Bam HI enzyme Eco RV sau thực phản ứng PCR với cặp primer chuyên biệt Các sản phẩm sau điện di gel agarose 0,8% Kết điện di Hình 1A
Hình Kết phản ứng cắt plasmid pAKTaq (A), kết xác định plasmid pAKTaq (B) (M: Ladder 1kb; 1: Plasmid sau cắt; 2: phản ứng PCR đối chứng âm; 3: sản phẩm PCR)
Kết cắt enzyme cho thấy sản phẩm plasmid sau cắt xuất hai băng vạch sáng rõ ràng, với băng vạch thứ có kích thước lý thuyết 4413 bp nằm vạch 4000 bp 5000 bp, băng thứ hai có kích thước lý thuyết 2630 bp nằm hai vạch nằm từ 2500 bp đến 3000 bp thang chuẩn Kích thước sản phẩm cắt với kích thước theo tính tốn lý thuyết tương ứng băng vạch có kích thước khoảng 5500 bp băng thứ có kích thước khoảng 2800 bp Sử dụng primer chuyên biệt cho gen Taq pol, sản phẩm thu sáng rõ có kích thước 600 bp Sản phẩm PCR sau giải trình tự, kết so sánh với trình tự Genbank thơng qua chương trình BLAST cho thấy có tương đồng tuyệt trình tự gen Taq từ vi khuẩn Thermos aquaticus công bố trước Như vậy, nội dung này, nhóm tác giả thành công việc biến nạp vector pAkTaq vào vi khuẩn E.coli BL21 Dòng vi khuẩn sử dụng để thực thí nghiệm
3.2 Kết tối ưu điều kiện cảm ứng
Sau chủng vi khuẩn E coli BL21 khẳng định chứa vector pAKTaq Khả sản xuất Taq pol vi khuẩn khảo sát điểm thời gian bao gồm 18 với cảm ứng IPTG mM Kết trình bày Hình
Hình Kết điện di SDS-PAGE khảo sát thời gian cảm ứng (1: không bổ sung IPTG; 2: bổ sung IPTG mM;
3: 18 không bổ sung IPTG; 4: 18 bổ sung IPTG mM; 5: Enzyme thương mại)
(5)thước lý thuyết Taq pol với 94 kDa Điều chứng tỏ điều kiện phù hợp cho biểu gen Taq Sự khác rõ rệt mốc thời gian cảm ứng, mức độ biểu protein mục tiêu thực thời gian cảm ứng IPTG mM tốt so với cảm ứng 18 Kết phù hợp với nghiên cứu trước Pluthero Canada, ông thời gian cảm ứng với IPTG có vai trị quan trọng q trình sản xuất Taq, thời gian cảm ứng dài làm cho Taq polymerase bị phân hủy, đặc biệt giai đoạn khoảng 24 sau cảm ứng [11] Thậm chí nghiên cứu Hàn Quốc năm 2014, Kim Park xác định mức độ cảm ứng tốt nuôi cấy [12]
Sau cảm ứng IPTG giờ, nồng độ protein mục tiêu chiếm đa số (cột số 2), nhiên lượng nhỏ protein khác bị lẫn tạp Cùng điểm thời gian, mức độ biểu protein mục tiêu ở nghiệm thức bổ sung IPTG mM (giếng 4) cao so với nghiệm thức đối chứng (giếng 3) Điều thể hiệu IPTG cảm ứng tạo Taq pol Kết phù hợp với nghiên cứu trước nồng độ chất cảm ứng IPTG thời gian cảm ứng Năm 1990, Engelke cộng khảo sát IPTG khoảng thời gian 6-24 kết cho thấy sau 16 cảm ứng hàm lượng protein thu không thay đổi đáng kể [3] Gần đây, năm 2015 Vũ Tuấn Nam cộng sử dụng chất cảm ứng IPTG mM thực thời gian cảm ứng với nhiệt độ cảm ứng 30 °C cho kết cảm ứng tốt [7]
3.3 Kết kiểm tra hoạt tính enzyme
Sau thu nhận cô đặc enzyme tái tổ hợp từ chủng vi khuẩn E coli nhóm tác giả tiến hành kiểm tra hoạt tính tương đối enzyme phương pháp PCR Kết PCR thể Hình
Hình So sánh hoạt tính enzyme tự sản xuất với enzyme thương mại
(M: Thang chuẩn DNA kb; NC: Đối chứng âm không chứa DNA, 1: phản ứng PCR với enzyme thương mại BIOTAQ, 2: phản ứng PCR với enzyme Taq pol tự sản xuất)
Kết cho thấy, enzyme Taq pol có khả khuếch đại đoạn DNA hàm lượng µL/ phản ứng Tuy nhiên, hiệu suất phản ứng thấp so với hiệu suất enzyme thương mại Mặc dù trải qua trình biến tính để loại bỏ protein bền với nhiệt 70 °C trong q trình ly trích, số nghiên cứu trước xác định vi khuẩn E coli có enzyme khác bền mức nhiệt độ 70 °C [13] Điều lý làm giảm hiệu phản ứng PCR Trong thời gian tới, lẫn tạp protein loại bỏ phương pháp đại
(6)trong phản ứng PCR để khuếch đại gen đặc trưng từ đậu nành thịt bò Kết thu sản phẩm sáng rõ theo kích thước lý thuyết sản phẩm đậu nành (772 bp) DNA bị (311 bp) (Hình 4B)
Hình Kết kiểm tra nồng độ enzyme Taq pol tự sản xuất (A) ứng dụng PCR từ với số DNA mục tiêu khác (B) (M: Thang chuẩn DNA 1kb; NC: Đối chứng âm không bổ sung enzyme, 1: nồng độ enzyme 0,025 µL; 2: nồng độ enzyme: 0,05 µL; 3: nồng độ enzyme: 0,1 µL;
4: nồng độ enzyme: 0,25 µL; 5: nồng độ enzyme 0,5 µL; DN: đậu này, B: bị)
Như vậy, enzyme Taq pol nghiên cứu có khả sử dụng để phát DNA plasmid vi khuẩn, thực vật động vật Mặc dù hoạt tính Taq pol thể qua việc khuếch đại thành cơng nhiều loại DNA, sản phẩm PCR cịn xuất sản phẩm phụ, điều này đoạn DNA vi khuẩn E.coli cịn sót lại đóng vai trị primer ngẫu nhiên sau khuếch đại sản phẩm khác phản ứng PCR Đây vấn đề thường gặp phải số nghiên cứu trước [14] Các nghiên cứu tiến hành để loại bỏ lẫn tạp DNA enzyme Taq nâng cao chất lượng sản phẩm
4 KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu nhóm tác giả biến nạp thành công vector pAKTaq vào vi khuẩn E coli BL21 Sau xác định điều kiện cảm ứng phù hợp cho gen mã hóa Taq pol Enzyme sau thử nghiệm thơng qua phản ứng PCR kết ban đầu cho thấy enzyme có khả sử dụng phản ứng PCR sử dụng với loại DNA mạch khuôn khác từ nhiều nguồn khác Quy trình sản xuất enzyme quy mô lớn tiếp tục hoàn thiện để cung cấp lượng enzyme cho phản ứng PCR sử dụng học tập nghiên cứu đơn vị
Lời cảm ơn: Nghiên cứu Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh
hỗ trợ cấp kinh phí theo Hợp đồng số 57/HĐ-DCT Nhóm tác giả gửi lời cảm ơn tới sinh viên Lê Thị Huyền, Phạm Thị Linh Huệ Nguyễn Thị Hương hỗ trợ kỹ thuật cho nghiên cứu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Mullis K.B., Faloona F.A - Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction, Methods in Enzymology 155 (1987) 335-350
(7)3 Engelke D.R., Krikos A., Bruck M.E., Ginsburg D - Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli, Analytical Biochemistry
191 (1990) 396-400
4 Jin C., Liu H., Yang S., Zhang S - Cloning and overexpression of thermostable DNA polymerase in Escherichia coli, Chinese Journal of Biotechnology 11 (3) (1995) 185-191
5 Desai U.J., Pfaffle P.K - Single-step purification of a thermostable DNA polymerase expressed in Escherichia coli, Biotechniques 19 (5) (1995) 780-784
6 Roayaei M., Galehdari H - Cloning and expression of Thermus aquaticus DNA polymerase in Escherichia coli, Jundishapur Journal of Microbiology (2008) 1-5 Vũ Tuấn Nam, Chong C.K., Lê Tiến Dũng - Quy trình đơn giản sản xuất DNA
polymerase chế phẩm ‘Hotstart’ quy mơ phịng thí nghiệm, Tạp chí Sinh học 37 (1) (2015) 124-132
8 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T - Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd ed New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)
9 Xia Y., Chen F., Du Y., Liu C., Bu G., Xin Y., Liu, B - A modified SDS-based DNA extraction method from raw soybean, Bioscice Reports 39 (2) (2019) 1-10
10 Kitpipit T., Sittichan K., Thanakiatkrai P - Direct-multiplex PCR as-say for meat species identification in food products, Food Chemistry 163 (2014) 77-82
11 Pluthero F.G - Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase, Nucleic acids research 21 (20) (1993) 4850-4951
12 Kim S.G., Park J.T - Production of DNA polymerase from Thermus aquaticus in recombinant Escherichia coli, CNU Journal of Agricultural Science 41 (3) (2014) 245-249
13 Mishra M.N., Mohanraj J., Nisshanthini S., Bhat S - High- level expression and purification of DNA and DNase free taq DNA polymerase, Asian Journal of Research in Biochemistry (4) (2018) 1-10
14 Sadeghi H.M.M., Rabbani M., Moezen F - Amplification and cloning of Taq DNA polymerase gene from Thermus aquaticus strain YT-1, Reasearch in Pharmaceutical Sciences (2006) 49-52
ABSTRACT
COMPLETE ENZYME DNA POLYMERASE PRODUCTION PROCESS AT LABORATORY SCALE
Ho Viet The*, Nguyen Minh Phuong, Ngo Thi Kim Anh Ho Chi Minh City University of Food Industry *Email: thehv@hufi.edu.vn Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq pol) is an important component of gene amplification technique (PCR) In this study, the pAKTaq plasmid containing Taq pol coding gene was successfully transformed into E coli BL21 Subsequently, Taq pol expression conditions were determined by using IPTG mM for hours at 30 °C The PCR reaction was used to evaluate the relative activity of the obtained enzyme, the results showed that the obtained enzyme could be used in the PCR reactions to amplify the target DNA from bacteria plasmid, plants and animals This research result is a potential for producing cheap Taq pol enzyme at laboratory scale
(https://www.addgene.org) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).