Phát hiện nhanh clostridium perfringgens trong thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA oOo BK TP.HCM PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN PHÁT HIỆN NHANH Clostridium perfringens TRONG THỰC PHẨM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà NGÀNH: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12 NĂM 2008 1  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN MỞ ĐẦU    “Theo thống kê, năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân 100-200 ca tử vong Nhà nước tỷ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm điều tra tìm nguyên nhân” Trong đó, vụ ngộ độc ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn Salmonella, E coli, C perfringens chiếm tỷ lệ 33-49%, độc tố vi khuẩn Staphylococcus aureus, C perfringens, C botulinum chiếm 20-30% [1] Theo báo cáo Bộ Nơng nghiệp- Phát triển Nơng thơn năm 2006, có khoảng 57% mẫu thịt có số nhiễm khuẩn hiếu khí vượt mức cho phép, 31% mẫu thịt nhiễm S aureus, 26% mẫu nhiễm C perfringens vượt ngưỡng cho phép Ngộ độc Clostridium perfringens thường xảy suốt năm gặp vào tháng hè Ngộ độc thức ăn bị nhiễm C perfringens phát sau ăn loại thịt, đặc biệt thịt bò, thịt gà, vịt nước chấm Vi khuẩn tìm thấy thịt (bị, gà,vịt), cá sống (16-85%) Thông thường trường hợp ngộ độc thức ăn ghi nhận buổi tiệc Kháng sinh khơng có giá trị trường hợp ngộ độc độc tố C perfringens Việc chẩn đoán C perfringens phương pháp ni cấy vi sinh truyền thống địi hỏi nhiều thời gian thực thử nghiệm sinh hóa sơ khẳng định, ảnh hưởng đến việc điều trị cho bệnh nhân Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), multiplex PCR phát gen gây bệnh mã hóa cho loại enterotoxin alpha, beta, epsilon iota [10, 17, 20] Phương pháp cho kết nhanh xác Tuy nhiên, việc đầu tư cho thiết bị hóa chất địi hỏi chi phí cao, thao tác thực phức tạp qua nhiều cơng đoạn Hiện nay, quy trình phát C perfringens dựa hoạt tính enzyme acid phosphatase ứng dụng phổ biến nhà sản xuất hóa chất Merck, Sigma để tạo mơi trường, hố chất thương mại kèm Enzyme phân cắt HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  2  MỞ ĐẦU  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   chất 4-methylumbelliferyl phosphate (MUP) thành 4-methylumbelliferone, chất có khả phát quang kích thích tia UV bước sóng 365nm MUP bổ sung vào mơi trường phân lập Tryptose sulfite cycloserine (TSC); sau 24 ni ủ, quan sát ánh sáng đèn cực tím, khuẩn lạc có tượng phát quang kết luận C perfringens Phương pháp cho tỷ lệ dương tính giả cao [7, 25] Ngồi ra, khả phát quang mơi trường thạch TSC-MUP bị cản trở mẫu khuếch tán MUP vào mơi trường thạch TSC, điển hình C perfringens diện mẫu với số lượng lớn, khuẩn lạc tách rời môi trường thạch phân lập TSC [7] Phân tích C perfringens dựa hoạt tính enzyme acid phosphatase phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, khơng địi hỏi nhiều thiết bị công thực hiện, lại cho kết nhanh [5, 16], sau 24 nuôi ủ, nhiên lại có số hạn chế nêu Để khắc phục nhược điểm phương pháp này, Philip W Adcock Christopher P Saint (2001) xây dựng phương pháp chẩn đoán dựa việc kết hợp phát đồng thời hai enzyme acid phosphatase ß-galactosidase thử nghiệm khẳng định, cho kết sau thực Trên sở nghiên cứu này, với mục tiêu xây dựng phương pháp phân tích C perfringens phù hợp với trạng đa số phịng thí nghiệm Việt Nam đồng ý Bộ môn Công nghệ sinh học - Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh cán hướng dẫn khoa học, tiến hành đề tài “Nghiên cứu phát triển phương pháp phát nhanh Clostridium perfringens thực phẩm dựa biểu hoạt tính enzyme acid phosphatase βgalactosidase” với mong muốn áp dụng thực tế vào việc kiểm tra mẫu thực phẩm, phục vụ cho công tác quản lý chất lượng thủy sản xuất đơn vị ™ Luận điểm đề tài Hiện nay, phương pháp phân tích nhanh C perfringens dựa hoạt tính enzyme hầu hết áp dụng kiểm tra mẫu nước [7], với mẫu thực phẩm, chủ HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  3  MỞ ĐẦU  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   yếu dựa phương pháp nuôi cấy truyền thống Vì vậy, điểm nghiên cứu việc chọn đối tượng để xây dựng phương pháp kiểm tra thực phẩm Với đối tượng chọn, vấn đề đáng quan tâm khảo sát ảnh hưởng mẫu (matrix) phương pháp phân tích Trên sở đó, đưa số biện pháp khắc phục ảnh hưởng mẫu kết phân tích có, xác định phạm vi áp dụng phương pháp Ngoài ra, tiến hành đánh giá, xác định hiệu lực sơ cấp phương pháp theo ISO 16140: 2003 ™ Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học: Việc nghiên cứu đặc điểm enzyme acid phosphatase β-galactosidase làm sở xây dựng phương pháp phân tích nhanh C perfringens thực phẩm, đồng thời, cung cấp công cụ mới, hướng tiếp cận để nghiên cứu type C perfringens Ý nghĩa thực tiễn: Phương pháp đơn giản, dễ thực so với phương pháp nay, địi hỏi trang thiết bị hiệu tương đương phương pháp công nhận Việc áp dụng phương pháp phát nhanh C perfringens mẫu thực phẩm có ý nghĩa đặc biệt việc chẩn đốn nhanh nguyên nhân vụ ngộ độc thực phẩm nghi nhiễm C perfringens để có phác đồ chữa trị kịp thời Ngoài ra, lĩnh vực xuất thực phẩm, đặc biệt xuất thủy sản, việc rút ngắn thời gian kiểm tra mẫu yêu cầu cấp bách cần thiết cơng ty, xí nghiệp sản xuất nhằm giảm chi phí thời gian lưu kho sản phẩm trình chờ cấp giấy chứng nhận chất lượng để xuất sản phẩm HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  4  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN MỞ ĐẦU    ™ Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu xây dựng dự thảo phương pháp phát nhanh C perfringens thực phẩm dựa biểu hoạt tính enzyme acid phosphatase βgalactosidase Xác định hiệu lực sơ cấp phương pháp xây dựng So sánh hiệu phân tích phương pháp xây dựng với phương pháp chuẩn HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  5  TỔNG QUAN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   2.1 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ Clostridium perfringens 2.1.1 Định nghĩa [ 23] Clostridium perfringens vi khuẩn hình que, kích thước 1,0 – 1,5 μm x 4,0 – 8,0 μm Gram dương Khơng di động Sống kỵ khí Bào tử C perfringens có hình trứng, nằm tâm lệch tâm C perfringens phân bố khắp nơi tự nhiên thường tìm thấy ruột người, động vật có xương sống, côn trùng, rau hỏng, bùn đáy, đất     Hình 2.1: Hình dạng tế bào C perfringens [28] Hình 2.2: Hình dạng vị trí bào tử C perfringens tế bào [29] HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  6  TỔNG QUAN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   2.1.2 Phân loại [23] Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Clostridia Bộ: Clostridiales Họ: Clostridiaceae Giống: Clostridium Loài: Clostridium perfringens 2.1.3 Đặc điểm sinh học C perfringens [13, 23] C perfringens tăng trưởng tối ưu nhiệt độ 35 – 37oC, tăng trưởng 50oC Nhiều dịng C perfringens tồn 100oC pH phát triển tối ưu C perfringens 6,0 – 7,0 Khả chịu mặn: nồng độ muối NaCl 6%, trình phát triển C perfringens bị ức chế C perfringens không sinh indole, khử nitrate thành nitrite, khơng cố định nitrogen khơng khí, thủy phân gelatin; lên men nhiều loại đường tạo acid hơi, không lên men mannitol; gây đông tụ sữa, sinh acid sinh mạnh Trên bề mặt thạch, khuẩn lạc trịn, ẩm, tâm đục, nhơ lên; thạch trứng, khuẩn lạc tròn bất thường, phẳng, có vùng tủa đục bao quanh Tăng trưởng tốt môi trường dịch thể, tạo hạt sinh khối nhầy Sinh ngoại độc tố Gây bệnh bồ câu chuột HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  7  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN TỔNG QUAN    A B Hình 2.3: Khuẩn lạc C perfringens thạch TSC trường hợp: khơng bổ sung lịng đỏ trứng vào mơi trường (A) có bổ sung lịng đỏ trứng (B) [30] Trong nghiên cứu John D Buck L Louise Shepard (1987), chủng C perfringens phân lập từ nước hồ nuôi cá heo vùng Đại Tây Dương (Tursiops truncatus) mô tả chi tiết đặc điểm sinh hóa tính mẫn cảm với kháng sinh HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  8  TỔNG QUAN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   Bảng 2.1 : Tính mẫn cảm kháng sinh chủng C perfringens phân lập từ nước hồ nuôi cá heo vùng Đại Tây Dương [12] Các loại kháng sinh Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml) Clindamycin < 0,1 Imipenum, oxacillin, penicillin < 0,3 Ampicillin, cefazolin, cefoxitin, ceftriaxone, < 1,0 cefuroxime, tetracyclin, vancomycin Cephalothin, Chloramphenicol, erythromycin, ≤ 2,0 mezlocillin, ticarcillin, timentin Tobramycin < 16,0 Gentamicin > 32,0 Amikacin, netimycin > 64,0 Aztreonam > 128,0 2.1.4 Đặc điểm cấu trúc phân tử C perfringens [26] Năm 2001, nghiên cứu phối hợp trường đại học viện khoa học Nhật Bản hoàn thành việc giải trình tự gen C perfringens dịng 13 Các kiến thức cấu trúc phân tử C perfringens lần khẳng định, làm sở chắn cho nghiên cứu ứng dụng sau C perfringens có loạt gen mã hóa cho enzyme tham gia trình lên men đường như: α-galactosidase, β-galactosidase, β-glucuronidase, αglucosidase, β-glucosidase, β-fructofranosidase, α-mannosidase, pullulanase, αamylase endo-1,4-beta-xylanase Các enzyme phân cắt loại đường phức hợp thành phân tử đường đơn giản, cung cấp cho trình đường phân HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  9  TỔNG QUAN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   Khả sinh tổng hợp acid amine C perfringens hạn chế thiếu gen cần cho trình tổng hợp arginine, glutamate, histidine, lysine, methionine, serine, threonine, acid amine thơm, acid amine mạch nhánh Vì vậy, C perfringens khơng thể tăng trưởng mơi trường thiếu acid amine Có khoảng 61 gen tham gia vào trình tạo bào tử nảy mầm C perfringens Chiếm phần lớn gen mã hóa cho nhân tố sigma liên quan đến trình tạo bào tử protein giai đoạn chuyên biệt Tuy nhiên, gen C perfringens lại thiếu gen mã hóa protein vỏ bào tử protein tham gia trình nảy mầm Điều chứng tỏ C perfringens tạo bào tử theo cách riêng, khác hẳn Bacillus Chromosome C perfringens có 20 gen mã hóa nhân tố gây độc, gen hyaluronidase mã hóa cho enzyme tiết, góp phần vào tính độc C perfringens Ngồi ra, cịn có gen nằm plasmid pCP13 cpb2 mã hóa cho độc tố beta 2, gây bệnh lý vùng tiêu hóa ngựa lợn con; gen cna hỗ trợ C perfringens bám vào collagen mơ chủ Hình 2.4: Bản đồ gen C perfringens dòng 13 [26] HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  70  KẾT QUẢ - BÀN LUẬN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   nhóm mẫu tương ứng xác định sau: cho nhóm mẫu cá khơ 30, 70 150 cfu/ 25g mẫu cho nhóm mẫu nước mắm 20, 60 90 cfu/50ml mẫu Thí nghiệm khảo sát giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp xây dựng tiến hành với mật độ C perfringens gây nhiễm cho loại mẫu xác định Kết ghi nhận Bảng 4.12 4.13 Bảng 4.12: Giới hạn phát giới hạn định lượng C perfringens mẫu cá khô Chủng CP Tỷ lệ phát C perfringens gây nhiễm với mật độ khác Giá trị tới hạn ước lượng Giới hạn Giới hạn S0 phát định lượng (cfu/25g) LOD LOQ (cfu/g) (cfu/g) Giá trị ngưỡng 30 70 150 LC cfu/25g cfu/25g cfu/25g (cfu/25g) CP1 1/6 2/6 5/6 70 42,4 17 CP2 1/6 2/6 6/6 70 42,4 17 CP3 1/6 3/6 6/6 70 42,4 17 CP4 1/6 3/6 5/6 70 42,4 17 CP5 1/6 3/6 5/6 70 42,4 17 HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  71  KẾT QUẢ - BÀN LUẬN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   Bảng 4.13: Giới hạn phát giới hạn định lượng C perfringens mẫu nước mắm Tỷ lệ phát C perfringens gây nhiễm với mật độ CP tới hạn khác Chủng Giới Giới Giá trị hạn hạn ngưỡng phát định S0 lượng (cfu/50m) LOD LOQ (cfu/ml) (cfu/ml) Giá trị ước lượng 20 60 90 cfu/50ml cfu/50ml cfu/50ml (cfu/50ml) CP1 1/6 3/6 5/6 60 36,36 CP2 1/6 2/6 5/6 60 36,36 CP3 1/6 3/6 6/6 60 36,36 CP4 0/6 3/6 5/6 60 36,36 CP5 1/6 3/6 6/6 60 36,36 LC Giá trị LC (giá trị tới hạn ước lượng) suy từ kết khảo sát thực nghiệm, mật độ C perfringens gây nhiễm vào mẫu cho tỷ lệ phát 2/6 3/6 LC = 1,65 x S0 (cfu/ khối lượng thể tích mẫu thử) S0 (threshold hay estimate of spread) giá trị ngưỡng đặc trưng cho mẫu Giới hạn phát hiện: LOD(cfu/g) = (3,3 x S0)/m hay LOD(cfu/ml) = (3,3 x S0)/v HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  72  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN KẾT QUẢ - BÀN LUẬN    Giới hạn định lượng: LOQ(cfu/g) = (10 x S0)/m hay LOQ(cfu/ml) = (10 x S0)/v m : khối lượng mẫu thử nghiệm (mẫu rắn) v : Thể tích mẫu thử nghiệm (mẫu lỏng) Từ kết nhận Bảng 4.12 Bảng 4.13 chúng tơi có nhận xét sau: ¾ Giới hạn phát phương pháp loại mẫu nhỏ 10 cfu/g (ml) Giới hạn đạt yêu cầu kỹ thuật phương pháp định lượng ¾ Giới hạn định lượng phương pháp mẫu cá khô 17 cfu/g mẫu nước mắm cfu/ml, giới hạn cho phép C perfringens theo tiêu chuẩn Bộ Y tế mẫu thủy sản khô 20 cfu/g Như vậy, áp dụng phương pháp để phân tích loại mẫu Qua đó, ta thấy phương pháp dự kiến xây dựng đáp ứng yêu cầu kỹ thuật thị trường 4.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC THUỘC TÍNH CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH Clostridium perfringens DỰA TRÊN SỰ BIỂU HIỆN HOẠT TÍNH ENZYME Thí nghiệm khảo sát chủng C perfringens (CP1, CP2, CP3) loại mẫu cá khô nước mắm Mỗi loại mẫu chọn mẫu kiểm tra mẫu để khẳng định mẫu chọn không bị nhiễm C perfringens Kết khảo sát thực tế cho thấy ml dịch tăng sinh C perfringens Clostridium sp canh BHI sau 24 ni ủ có mật độ khoảng 107 cfu/ml Vì vậy, gây nhiễm vào 25 g mẫu cá khơ, độ pha lỗng thích hợp dịch mẫu 10-2, 10-3, 10-4 Với 50 ml mẫu nước mắm, sau gây nhiễm, nồng độ pha lỗng mẫu thích hợp 10-3, 104 , 10-5 HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  73  KẾT QUẢ - BÀN LUẬN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   Chọn đĩa thạch TSC có số khuẩn lạc thích hợp để khảo sát: số đĩa cấy từ mẫu (15 đĩa: cấy nồng độ, nồng độ đĩa), thực tế chọn đĩa đáp ứng tất tiêu chí sau để thử nghiệm MUP- ONPG: ¾ Các khuẩn lạc mọc rời ¾ Tổng số khuẩn lạc đĩa lớn nằm ngưỡng cho phép phương pháp đếm đĩa chuẩn 250 cfu/ đĩa Do đó, số lượng khuẩn lạc lớn, kết xác Theo tiêu chí lựa chọn trên, kết thí nghiệm chúng tơi trình bày Bảng 4.14 Bảng 4.14: Kết khảo sát thuộc tính phương pháp mẫu cá khô Chủng C.perfringens Kết thử nghiệm CP CP khuẩn lạc hình (cfu/đĩa) Điển hình Khẳng định dương 100 Khẳng định âm 45 Khẳng định dương 67 Khẳng định âm 49 113 55 Khẳng định dương Khẳng định âm Tổng số Không điển MUP- ONPG khảo sát CP Số đếm giả định (cfu/đĩa) 149 119 173 Áp dụng cơng thức tính tốn trình bày Phần 3, Mục 3.2.8, kết tính thuộc tính phương pháp cho thí nghiệm trình bày Bảng 4.15 HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  74  KẾT QUẢ - BÀN LUẬN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   Bảng 4.15: Các thuộc tính phương pháp mẫu cá khô Chủng Độ nhạy Độ đặc hiệu Tỷ lệ Tỷ lệ C perfringens SE SP dương tính giả âm tính giả CP 99,0% 93,8% 2,9% 2,2% CP 97,1% 98,0% 1,5% 3,9% CP 98,3% 94,8% 2,6% 3,5% Bảng 4.16 Kết khảo sát thuộc tính phương pháp mẫu nước mắm Chủng C.perfringens Kết thử nghiệm CP CP Không điển MUP- ONPG Điển hình Khẳng định dương 102 Khẳng định âm 84 Khẳng định dương 81 Khẳng định âm 60 Khẳng định dương 46 Khẳng định âm 37 khảo sát CP Số đếm giả định (cfu/đĩa) hình Tổng số khuẩn lạc (cfu/ đĩa) 194 147 85 Áp dụng công thức tính tốn trình bày Mục 3.2.8, kết tính thuộc tính phương pháp cho thí nghiệm trình bày Bảng 4.17 HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  75  KẾT QUẢ - BÀN LUẬN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   Bảng 4.17: Các thuộc tính phương pháp mẫu nước mắm Chủng C perfringens Độ nhạy Độ đặc hiệu Tỷ lệ Tỷ lệ SE SP dương tính giả âm tính giả CP 95,3 97,4 2,9 5,6 CP 96,4 95,2 3,6 4,8 CP 97,9 97,4 2,1 2,6 Ở tất lần khảo sát, loại mẫu, độ nhạy phương pháp đạt 95% độ đặc hiệu 93%, tỷ lệ dương tính giả 3,6% âm tính giả 5,6% Các thông số phương pháp đáp ứng tiêu chuẩn kỹ thuật theo quy định ISO 16140 độ nhạy độ đặc hiệu 90%, tỷ lệ dương tính giả âm tính giả 10% Như vậy, kết khảo sát giới hạn định tính, giới hạn định lượng thông số kỹ thuật phương pháp dự kiến xây dựng đạt yêu cầu, áp dụng phương pháp vào việc phân tích mẫu thực tế 4.7 SO SÁNH HIỆU QUẢ PHÂN TÍCH Clostridium perfringens TRONG THỰC PHẨM GIỮA PHƯƠNG PHÁP MỚI XÂY DỰNG VÀ PHƯƠNG PHÁP CỦA HEALTH PROTECTION AGENCY- UK, 2005 Kết phân tích nhóm mẫu cá khô mắm theo hai phương pháp ghi nhận Bảng 4.18 4.19 HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  76  KẾT QUẢ - BÀN LUẬN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   Bảng 4.18: Kết phân tích mẫu cá khơ theo phương pháp Kết phân tích mẫu Số thứ tự mẫu cá khô Phương pháp (cfu) Phương pháp chuẩn (cfu) Chênh lệch mẫu 0 0 70 80 -10 0 30 30 0 0 20 10 10 0 10 0 11 140 110 30 12 190 210 -20 13 0 14 290 320 -30 15 180 180 15 0 17 20 20 18 90 80 10 19 120 140 -20 20 0 Trung bình độ chênh lệch mẫu -1,5 Độ lệch chuẩn chênh lệch mẫu 12,25819 t1 ( two-tailed, paired samples) -0,590583 HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  77  KẾT QUẢ - BÀN LUẬN  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN   Bảng 4.19: Kết phân tích mẫu mắm theo hai phương pháp Kết phân tích mẫu Số thứ tự mẫu mắm Phương pháp (cfu) Phương pháp chuẩn (cfu) Chênh lệch mẫu 1100 990 110 0 0 79 71 230 260 -30 0 0 170 150 20 1000 900 100 10 0 11 550 610 -60 12 1300 1170 130 13 0 14 43 39 15 110 88 22 16 0 17 13 13 18 0 19 0 20 0 Trung bình độ chênh lệch mẫu 15,2 Độ lệch chuẩn chênh lệch mẫu 45,79313 t ( two-tailed, paired samples) 0,154098 HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  78  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN KẾT QUẢ - BÀN LUẬN    Tra bảng phân phối T-Student với độ tự df = n-1= 20-1= 19, mức ý nghĩa α/2= 0,05/2= 0,025, giá trị t19;.0,025= 2,093 Vì - t19; 0,025 < t1 < t19;0,025 - t19; 0,025 < t2 < t19;0,025 (t1 = -0,590583 t2= 0,154098) nên theo lý thuyết thống kê kiểm định trung bình mẫu phối cặp, khơng có khác biệt ý nghĩa mặt thống kê kết phân tích phương pháp nhóm mẫu cá khơ mẫu mắm Từ kết luận hiệu phân tích mẫu phương pháp xây dựng hồn toàn tương đương với phương pháp tiêu chuẩn Health Protection Agency, UK, 2005 HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ  79  GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ  5.1 KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu, đề tài thu số kết sau: Xây dựng dự thảo phương pháp định lượng nhanh C perfringens thực phẩm dựa biểu hoạt tính enzyme acid phosphatase β-galactosidase Xác định đươc giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng thuộc tính phương pháp xây dựng: giới hạn phát giới hạn định lượng 6cfu/g 17cfu/g với mẫu cá khô, 3cfu/ml 8cfu/ml với mẫu mắm, độ nhạy phương pháp 95%, độ đặc hiệu 93%, tỷ lệ dương tính giả 5,6%, âm tính giả 3,6% Hiệu phân tích phương pháp xây dựng tương đương với phương pháp tiêu chuẩn Health Protection Agency, UK, 2005 với độ tin cậy 95% 5.2 ĐỀ NGHỊ Do hạn chế thời gian, nên số nội dung chưa thực hoàn chỉnh Vì vậy, chúng tơi có số kiến nghị cho nghiên cứu sau: Khảo sát ổn định phương pháp xây dựng Xác định thông số phương pháp nhiều mẫu khác thịt gia súc gia cầm, rau quả, thủy sản tươi,…để mở rộng phạm vi áp dụng phương pháp HVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ 80    TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Hữu Chí, 1997 Thức ăn bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh No – Series – 1997: 10-15 Ngô Thị Vân Kiều, 2008 Xây dựng phương pháp định lượng nhanh Clostridium perfringens thực phẩm dựa biểu hoạt tính enzyme acid phosphatase β-galactosidase Luận văn tốt nghiệp, Ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm, Tp Hồ Chí Minh Lê Lập, Nguyễn Đức Tân, Lê Đình Hải, Đặng Thanh Hiền, Đào Duy Hưng, Trương Cơng Thơi, Võ Thành Thìn, Lê Văn Sơn, 2007 Phân lập xác định type độc tố (toxinotype) vi khuẩn Clostridium perfringens động vật nhai lại kỹ thuật multiplex PCR Tạp chí Nơng Nghiệp Phát triển Nơng Thơn, kì Nguyễn Thị Hồng Loan, 2008 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp định lượng Clostridium perfringens thực phẩm theo Health Protection Agency, UK 2005 Luận văn tốt nghiệp, Ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Kiều Trinh, 2008 Khảo sát đặc điểm chủng Clostridium perfringens phân lập từ thực phẩm Luận văn tốt nghiệp, Ngành công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh Hồng Trọng, Chu Nguyễn Mộng Ngọc, 2005 Phân tích liệu nghiên cứu với SPSS NXB Thống kê   81    Tiếng Anh Adcock Philip W and Christopher P Saint, 2001 Rapid confirmation of Clostridium perfringens by using chromogenic and fluorogenic substrates Water Quality Center, SA Water Corporation, Australia Anders Johansson, Anna Aspan, Elisabeth Bagge, Viveca Baverud, Bjorn E Engstrom and Karl-Erik, 2006 Genetic diversity of Clostridium perfringens type A isolates from animals, food poisoning outbreaks and sludge National Veterinary Institute and Department of Biomedical Sciences and Veterinary Public Health, Swedish University of Agricultural Sciences, Sweden Annamari Heikinheimo, Miia Linstrom, Per Eina Granum and Hannu Korkeala et al., 2006 Humans as Reservoir for enterotoxin gene-carrying Clostridium perfringens type A University of Helsinki, Helsinki, Finland; and Norwegian School of Veterinary Science, Oslo, Norway 10 Araujo M., R.A Sueiro, M.J Go1mez, M.J Garrido, 2003 Enumeration of Clostridium perfringens spores in groundwater samples: comparison of six culture media Journal of Microbiological Methods 57 (2004) 175 – 180 11 Aspinall S T, S F Dealler, 1992 New Rapid identification test for Clostridium difficile JCP Online 12 Buck John D., L Louise Shepard, 1987 Clostridium perfringens as the cause of Death of a captive Atlantic bottlenosed dolphin (Tursiops truncatus) Journal of Wildlife diseases Page 488 – 491 13 ESR Ltd , 2001 Clostridium perfringens Prepared for the Ministry of Health 14 Government of Canada, 2001 Enumeration of Clostridium perfringens in foods Health Products and Food Branch, Ottawa   82    15 Hakan Kalender and Hansan Basri Ertas, 2005 Isolation of Clostridium perfringens from chickens and detection of the alpha toxin gene by polymerase chain reaction Veterinary Control and Research Institute, 32100, Turkey and Department of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, Fyrat University, 23119, Turkey 16 Han San Yoo, San Un Lee, Kyoung Yoon Park and Yong Ho Park, 1996 Molecular typing and Epidemiological survey of prevalence of Clostridium perfringens types by multiplex PCR Department of Bacteriology and Immunology, National Veterinary Research Institute, Rural Development Administration, AnYang, Kyunggi 430-016, Bayer Korea Ltd., Seoul 157-200 and Department of Microbiology, College of Veterinary Medicine, Seoul National University, Suweon, Kyunggi 441-744, Republic of Korea 17 Health Protection Agency, National Public Health, Service for Wales, 2005 Enumeration of Clostridium perfringens Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Specialist and Reference Microbiology Division 18 Hisashi Ashida, Kimberly Anderson, Jun Nakayama, Karol Maskos, ChauWen Chou, Richard B Cole, Su-Chen Li, Yu-The Li, 2001 A novel endo-βgalactosidase from Clostridium perfrigens that liberates the disaccharide GlcNAcα1ỈGal from glycans specifically expressed in the gastric gland mucous cell-type mucin The journal of biological chemistry, The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc 19 Hoopman Todd C., Wei Wang, Chad A Brautigam, Jennifer L Sedillo, Thomas J Reilly and Eric J Hansen, 2007 Moraxella catarrhalis synthesizes an autotransporter, that is an acid phosphatase Journal Bacteriol, The American Society for Microbiology 20 ISO 16140: 2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative method, first edition   83    21 McCourt M.T, D.A Finlay, C Laird, J.A Smyth, C Bell and H.J Ball, 2004 Sandwich ELISA detection of Clostridium perfringens cells and α-toxin from field cases of necrotic enteritis of poultry 22 Porschen Richard K and Earle H Spauling, 1974 Phosphatase activity of Anaerobic organisms Deparment of Microbiology and Immunology, Temple University School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania Applied Microbiology, Apr Page 744 – 747 23 Robert Breed S., E G D Murray and Nathan R Smith, 1957 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, seventh edition The Williams and Wilkins Company, Baltimore 24 SAC-SINGLAS, 2002 Method Validation of Microbiology methods Guidance note: C & B and ENV 002 25 Sartory D.P and A.M Field, 2006 Evaluation of acid phosphatase as a confirmation test for Clostridium perfringens isolated from water Letters in Applied Microbiology 42 (4), page 418 – 424 26 Tohru Shimizu and Hideo Hayashi, 2001 Complete genome sequence of Clostridium perfringens, an anearobic flesh-eater Department of Microbiology, Institute of Basic Medical Sciences, University of Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki 3058575 27 United States Food and Drug Administration, 2001 Clostridium perfringens Bacteriological analytical manual online, chapter 16   84    Internet 28 http://microbewiki.kenyon.edu/images/f/f8/137_clostridium.jpg 29 http://aapredbook.aappublications.org/week/032_01.jpg 30 http://www.rapidmicrobiology.com/news/995h27p.jpg 31 http://industry.biomerieux-usa.com/industry/food/api/apiproducts.htm   ... cứu phát triển phương pháp phát nhanh Clostridium perfringens thực phẩm dựa biểu hoạt tính enzyme acid phosphatase βgalactosidase” với mong muốn áp dụng thực tế vào việc kiểm tra mẫu thực phẩm, ... phương pháp công nhận Việc áp dụng phương pháp phát nhanh C perfringens mẫu thực phẩm có ý nghĩa đặc biệt việc chẩn đoán nhanh nguyên nhân vụ ngộ độc thực phẩm nghi nhiễm C perfringens để có phác đồ... Pasteur Ngăn ngừa phát triển vi khuẩn thực phẩm cách bảo quản đông lạnh thích hợp phương pháp khác Đối với cơng nghiệp thực phẩm thương nghiệp: áp dụng quy chế vệ sinh thực phẩm sản xuất, bảo