PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA RƠM RẠ TỪ LÚA LÀM PHÂN HỮU CƠ TRỒNG TRỌT Ths KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH* TĨM TẮT Ơ nhiễm môi trường sản xuất nông nghiệp vấn đề cấp bách cần giải Các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường sử dụng ngày rộng rãi trở thành giải pháp tối ưu nông nghiệp Các chủng nấm Trichoderma tổng hợp nhiều enzym cellulase, phân giải rơm rạ từ lúa làm phân hữu trồng trọt có tính đối kháng cao Trong đề tài tiến hành phân lập khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng nấm tổng hợp enzym cellulase cao Kết thu ba chủng nấm sợi định danh Đ1: Trichoderma viride, Đ2: Curvularia pallescens, Đ4: Trichoderma harzianum Rifai Đã xác định điều kiện MT tối ưu cho sinh trưởng sinh tổng hợp cellulase ba chủng nấm sợi Đ1, Đ2, Đ4 là: nguồn cacbon tốt 6C: 4R, pH thích hợp 6-7, độ ẩm thích hợp 55% - 65%, nhiệt độ thích hợp 300C, thời gian thu nhận enzym tốt 3-4 ngày Chúng có khả sinh loại enzym cellulase, protease, amylase, kitinase sinh kháng sinh kháng lại số VSV gây bệnh ABSTRACT Today, air pollution in agriculture is a problem needed to solve Biological products friendly with environment are being used widespread and become good solution Cellulase, which produced in a great quantity by Trichoderma, has many important applications They break up straws from rice to organic fertilizer and have hightly resistance In this project, we subdivided and investigated cultivation conditions to obtain cellulase from the culture of molds The results show that there are special classified Đ1: Trichoderma viride, Đ2: Curvularia pallescens, Đ4:Trichoderma harzianum Rifai Cellulase production is highest at 6C: 4R, pH=6,0-7,0, moisture 55%-65%, temperature 300C and 3-4 days of cultivation They can produced enzymes cellulase, protease, amylase, kitinase and antibiotic protest pathogenic microorganisms Keywords: enzymes cellulase, Trichoderma, straws from rice, organic fertilizer ĐẶT VẤN ĐỀ Sử dụng phân bón hóa học lâu ngày làm cho đất canh tác bị chai sạn, thối hóa, nhiễm trầm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi, trồng người Các chủng VSV nấm sợi có khả sinh enzym ngoại bào phân giải thành phần hữu phế thải nông nghiệp, đặc biệt cellulose khó phân hủy, để làm phân bón hữu hướng nghiên cứu quan tâm Enzym cellulase enzym ngoại bào phổ biến, có nguồn gốc từ nấm sợi Rơm rạ sau vụ thu hoạch nguồn phế thải nông nghiệp lớn Rơm rạ thô chứa 44% cellulose, 22% hemicellulose, nguồn nguyên liệu khó phân hủy sinh học, sử dụng VSV phân giải thích hợp tạo nguồn phân hữu sinh học tốt Từ đề tài: “Phân lập số chủng nấm sợi có khả chuyển hóa rơm rạ từ lúa làm phân hữu trồng trọt”, nhằm tận dụng nguồn phế thải nơng nghiệp sản xuất phân bón cho trồng, góp phần xây dựng nơng nghiệp sạch, bền vững, giảm ô nhiễm môi trường NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phân lập chủng nấm sợi từ rơm rạ lúa xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang Tuyển chọn số chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase cao Định danh chủng nấm sợi chọn Nghiên cứu yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzym cellulase chủng nấm sợi chọn PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng Các chủng nấm sợi phân lập từ rơm rạ xã thuộc huyện Thoại Sơn: xã Vĩnh Khánh, xã Vĩnh Trạch, xã Định Thành, xã Định Mỹ, xã Vĩnh Phú, xã Vĩnh Chánh 3.2 Phương pháp nghiên cứu Đề tài sử dụng phương pháp nghiên cứu vi sinh thông dụng như: Phương pháp phân lập mẫu theo Uyenco, 1988 Phương pháp định tính khả sinh enzym cellulase phương pháp khuếch tán thạch Phương pháp xác định hoạt độ enzym cellulase dựa vào lượng đường khử tạo thành (định lượng đường khử 3,5- Dinitrosalicylic acid) Định danh nấm sợi phương pháp hình thái: quan sát đại thể vi thể nấm sợi Các kết thí nghiệm đề tài xử lý chương trình Data analysis Excel KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập chủng nấm sợi từ rơm rạ từ lúa Phân lập 54 chủng nấm sợi: 28 chủng phân lập từ đất mặt ruộng có rơm rạ phân hủy, 26 chủng phân lập từ rơm rạ chưa phân hủy MT sống ruộng lúa có đầy đủ yếu tố cần thiết cho nấm sợi sinh trưởng phát triển Chúng sử dụng chất hữu sẳn có để tồn tại, đồng thời tham gia phân hủy chất thải, giúp giảm bớt ô nhiễm MT sản xuất nông nghiệp 4.2 Tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase Tổng số chủng có enzym : 54/54 (100%) + Chủng sinh enzym mạnh :7/54 chủng (12,9%) + Chủng sinh enzym trung bình :19/54 chủng (35,2%) + Chủng sinh enzym yếu : 28/54 chủng (51,9%) Từ chọn chủng có hiệu số D-d (mm) cao để tiếp tục nghiên cứu Bảng Hoạt độ cellulase chủng nấm sợi (mg/ml) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) Hoạt độ cellulase (mg/ml) Đ1 24,5 10,33 Đ2 23,5 9,45 Đ4 24,0 9,87 4.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái phân loại chủng nấm sợi Bảng Đặc điểm hình thái định danh ba chủng nấm sợi Chủng Đặc điểm hình thái chủng nấm Xếp loại - Khuẩn lạc: Tròn, dạng xồm mang đám bào tử khối Lúc đầu anh nhạt, sau xanh đậm (Hình 1) Chủng Đ1 - Hình thái vi thể: Sợi nấm có ngăn vách Trong suốt, kích thước (100-250)x(2,5Trichoderma 5)µm Cuống sinh bào tử phân nhánh dạng nhánh nhiều 2-3 lần, nhánh cụ viride ụm lại 2,3 đơn độc, kích thước (225-600) x (3-5) µm Bào tử hình cầu, vách gai rõ, kích thước 2,5 x (3-5) µm Thể bình hình chai, cổ thóp rõ, kích thước ,25-8,75) x (2,5-3) µm (Hình 2) - Khuẩn lạc: dạng bơng mịn, tâm khuẩn lạc nhô cao, mép khuẩn lạc hệ sợi chìm trắng Màu đen xám ánh xanh rêu đậm, mặt trái màu đen Không tiết sắc tố.Tốc độ mọc nhanh (Hình 3) Chủng Đ2 - Hình thái vi thể: Sợi nấm ngăn vách, kích thước 1500 x 4,8 µm, màu nâu đen.Cuống sinh bào tử mọc thẳng hay ngoằn ngoèo, đơn độc hay thành bụi, có Curvularia pallescens chỗ lồi, vách nhẳn, phân nhánh bên đa số, kích thước (75-350) x (5-7,5) µm Bào tử đa số vách ngăn, màu nâu sậm đến đen nâu bào tử, dạng thẳng, cong nhẹ, hình gối, hình ovale, 17 x (7-12) µm (Hình 4) Chủng Đ4 - Khuẩn lạc: dạng mịn non, chuyển sang xanh nhạt, se lại thành vùng rời rạc, mép tơ trắng Màu sắc biến màu theo tuổi nấm, trắng, màu xanh đậm Mặt trái không màu Không tiết sắc tố (Hình 5) - Hình thái vi thể: Sợi nấm ngăn vách, kích thước 2,2-10 µm, khơng màu Cuống sinh bào tử dạng phân nhánh thường mang 1-4 thể bình Thể bình kích thước (5-11) x (2,2-2,5) µm Bào tử hình cầu, gần cầu, vách dày, nhám, kích thước 3-3,5 µm (Hình 6) Hình Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ1 Hình Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ2 Hình Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ4 Trichoderma harzianum Rifai Hình Hệ sợi nấm chủng Đ1 (x40) Hình Hình dạng hệ sợi nấm chủng Đ2 (x40) Hình Hình dạng sợi nấm chủng Đ4 (x40) 4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ cellulase chủng Đ1, Đ2, Đ4 - Ảnh hưởng thời gian : Tiến hành nuôi nấm sợi MT xốp sở thời gian khác ngày, ngày, ngày, ngày, ngày Sau nuôi cấy, ly trích enzym xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp định lượng đường khử 3,5- dinitrosalycylic Kết phân tích phương sai với mức ý nghĩa