Kien thuc Di truyen hoc bo sung

(b) Alen lÆn trªn NST thêng.. TÇn sè c¸c rèi lo¹n di truyÒn nµy thêng kh¸c nhau trong c¸c chñng téc ngêi kh¸c nhau. Ngoµi ra, c¸c c¸ thÓ bÞ bÖnh còng cã thÓ cïng lóc mang c¸c gen ®ét biÕ[r]

Một số vấn đề di truyền học

I GEN

I VỊ kh¸i niƯm

Các thông tin di truyền sinh vật cần cho trình sinh trởng, phát triển sinh sản nằm phân tử ADN Những thơng tin nằm trình tự nucleotit ADN đợc tổ chức thành gen Mỗi gen thờng chứa thông tin để tổng hợp chuỗi polypeptit phân tử ARN có chức riêng biệt Xét cấu trúc, gen đoạn ADN riêng biệt mang trình tự bazơ thờng mã hố cho trình tự axit amin chuỗi polypeptit Các gen khác kích thớc, từ dới 100 cặp đến vài triệu cặp bazơ sinh vật bậc cao, gen hợp thành phân tử ADN dài nằm cấu trúc đợc gọi nhiễm sắc thể ng-ời có khoảng 30.000 - 40.000 gen phân bố 23 cặp NST, có 22 cặp NST thờng (autosome) cặp NST giới tính (X Y) Nh vậy, ngời có 24 loại NST khác Trên nhiễm sắc thể, gen thờng nằm phân tán cách biệt đoạn trình tự khơng mã hóa Các đoạn trình tự đợc gọi đoạn ADN liên gen ADN liên gen dài, nh ngời gen chiếm dới 30% toàn hệ gen Xét gen, mạch chuỗi xoắn kép mang thông tin đợc gọi mạch khuôn dùng để tạo phân tử ARN mang trình tự bổ trợ để điều khiển trình tổng hợp chuỗi polypeptit Mạch đợc gọi mạch không làm khuôn Cả hai mạch phân tử ADN đợc dùng làm mạch để mã hố cho gen khác Ngồi ra, ngời ta cịn dùng số thuật ngữ khác để mạch khuôn mạch không làm khuôn, nh mạch đối nghĩa / mạch mang nghĩa, mạch khơng mã hố / mạch mã hoá Cần ý là, mạch đối nghĩa mạch khơng mã hóa mạch khn để tổng hợp phõn t ARN

Khả lu giữ thông tin di truyền ADN lớn Với phân tử ADN có n bazơ có 4n khả tổ hợp trình tự bazơ khác Trong thực tế, số l ợng hạn chế các trình tự mang thông tin có ích (thông tin mà hóa phân tử ARN protein có chức sinh học)

I VỊ tỉ chøc cđa gen

Hầu hết gen phân bố ngẫu nhiên nhiễm sắc thể, nhiên có số gen đợc tổ chức thành nhóm, cụm Có hai kiểu cụm gen, operon họ gen

Operon cụm gen vi khuẩn Chúng chứa gen đợc điều hồ hoạt động đồng thời mã hố cho protein thờng có chức liên quan với Ví dụ nh operon lac E coli chứa ba gen mã hoá cho enzym mà vi khuẩn cần để thủy phân lactose Khi có lactose làm nguồn lợng (và vắng mặt glucose) vi khuẩn cần ba enzym operon lac mã hoá Sự dùng chung trình tự khởi đầu phiên mã (promoter) gen operon (hình 1) cho phép gen đợc điều khiển biểu đồng thời sinh vật sử dụng nguồn lợng cách hiệu

ở sinh vật bậc cao khơng có operon, cụm gen đợc gọi họ gen Không giống nh operon, gen họ gen giống nhau, nhng không đợc điều khiển biểu đồng thời Sự cụm lại gen họ gen có lẽ phản ánh nhu cầu cần có nhiều gen định xu hớng lặp đoạn nhiều gen trình tiến hóa Một số họ gen tồn thành nhiều cụm riêng biệt nhiều nhiễm sắc thể khác Hiện t-ợng có lẽ tái cấu trúc ADN q trình tiến hố phá vỡ cụm gen Các họ gen có cấu trúc đơn giản phức tạp họ gen đơn giản, gen giống hệt Ví dụ nh họ gen mã hóa ARN ribosom 5S (rARN 5S) tế bào ngời, có khoảng 2000 cụm gen gen này, phản ánh tế bào cần số lợng lớn sản phẩm gen (hình 2a) Trong đó, họ gen phức tạp chứa gen tơng tự nhng khơng giống hệt Ví dụ nh họ gen globin ngời mã hóa cho cho chuỗi polypeptit tơng ứng với loại globin , , , ,  (hình 2b) khác vài axit amin Các chuỗi polypeptit globin tơng

ADN

Trình tự điều hòa

lac Z lac Y lac A

H×nh Operon Lac Ba gen (lac Z, lac Y vµ lac A) xÕp liỊn kỊ đ ợc điều khiển chung

ADN a)

C¸c gen m hãa ARN ribosom (rARN)·

Các trình tự liên gen (ADN đệm)

Nhãm gen m· hãa β globin ë ng êi

ADN b)

 G A 

1  

tác với thành phức hệ, kết hợp với phân tử hem để tạo hemoglobin (một loại protein vận chuyển oxy máu)

I Trình tự khởi đầu phiên mà (promoter)

Sự biểu gen đợc điều khiển chặt chẽ Khơng phải tất gen có ADN tế bào đợc biểu đồng thời Những gen khác đợc hoạt hoá biểu vào thời điểm tế bào khác Tất gen đợc biểu tế bào xác định đặc tính chức tế bào Ví dụ, gen biểu tế bào khác với gen đợc biểu tế bào máu Sự biểu gen đợc điều khiển đoạn trình tự ADN đứng trớc (nằm ngợc dịng phía đầu 5’) so với đoạn trình tự mã hóa đợc gọi trình tự khởi đầu phiên mã (promoter, cịn gọi trình tự khởi động) Đoạn trình tự khởi động chứa trình tự đặc hiệu đợc ARN polymerase protein đặc biệt gọi các yếu tố phiên mã nhận biết để gắn vào trình phiên mã gen Mức độ biểu gen tế bào đợc xác định mức độ gắn kết (ái lực) ARN polymerase yếu tố phiên mã với promoter

I Exon vµ Intron

ở sinh vật bậc cao (sinh vật nhân chuẩn), thông tin di truyền mã hoá NST th-ờng bị phân cắt thành nhiều đoạn trình tự ADN cách biệt đợc gọi exon Các exon bị ngăn cách trình tự khơng mang thơng tin có ích đợc gọi intron (hình 3) Số l-ợng intron gen biến động lớn, có thẻ từ đến 50 phân đoạn Độ dài intron exon biến động, nhng intron thờng dài chiếm phần lớn trình tự gen Trớc thông tin gen đợc sử dụng để tổng hợp phân tử protein tơng ứng, intron phải đợc cắt bỏ khỏi phân tử ARN nhờ trình đợc gọi q trình cắt bỏ (q trình hồn thiện phân tử mARN) Trong q trình đó, exon đợc giữ lại nối lại với thành trình tự mã hoá liên tục

Việc xác định intron trình tự gen thực đợc nhờ intron điển hình có trình tự bắt đầu 5 -GU’ kết thúc AG-3’ Tuy vậy, thực tế dấu hiệu này, việc cắt bỏ intron cịn cần trình tự khác vùng nối intron exon (xem thêm mục III.1)

ADN Promoter Intron Exon

Intron Exon

I Gen gi¶ (pseudogene)

Có số gen giống với gen khác nhng trình tự bazơ chúng có sai sót làm cho chúng khơng có khả chứa thơng tin sinh học hữu ích Những gen đợc gọi gen giả sai sót đột biến trình tự ADN chúng xuất trình tiến hố làm thơng tin bị lẫn lộn đến mức khơng cịn điều khiển q trình sinh tổng hợp protein bình thờng đợc Những gen giả dấu vết q trình tiến hố Trải qua tiến hố, biến đổi ban đầu bazơ gây thông tin đợc lặp lặp lại đến mức trí trình tự bazơ gen giả khác hẳn với trình tự gen gốc ban đầu Ví dụ nh gen globin giả cụm gen globin

II Mã DI TRUYềN II Khung đọc

Ngoài việc quy định điểm bắt đầu trình tổng hợp protein, ba mã khởi đầu (AUG) xác định khung đọc trình tự ARN Có thể có ba ba cho trình tự bazơ nào, phụ thuộc vào bazơ đợc chọn làm bazơ bắt đầu codon Thực tế trình tổng hợp protein, thờng có khung đọc đợc sử dụng Cịn hai khung đọc thờng chứa số ba kết thúc ngăn cản chúng đợc sử dụng để tổng hợp trực tiếp nên phân tử protein (hình 4)

Khung đọc 5’ - AUG ACU AAG AGA UCC GG - 3’ Met Thr Lys Arg Ser

Khung đọc 5’ - A UGA CUA AGA GAU CCG G - 3' Stop Leu Arg Asp Pro

Khung đọc 5’ - AU GAC UAA GAG AUC CGG - 3’ Asp Stop Glu Ile Arg

Hình Mỗi trình tự ADN đọc theo ba khung đọc khác nhau, phụ thuộc vào bazơ đ ợc chọn làm bazơ khởi đầu Trên phân đoạn ADN mạch kép lý thuyết có tối đa sáu khung đọc mở (ORF) khác

Đoạn trình tự nằm ba khởi đầu ba kết thúc tơng ứng khung đọc đợc gọi khung đọc mở (ORF = open reading frame) Đặc điểm đợc dùng để xác định trình tự ADN mã hố protein dự án gii mó h gen

II.2 Tính vạn m· di truyÒn

Ban đầu, ngời ta tin mã di truyền vạn Nghĩa sinh vật, codon giống quy định axit amin nh Tuy vậy, thực tế cho thấy có số trờng hợp ngoại lệ Ví dụ, hệ gen ty thể có khác biệt ba khởi đầu ba kết thúc Cụ thể, AUG bình thờng ba kết thúc, ty thể lại mã hố cho tryptophan; AGA AGG bình thờng quy định arginin, ty thể lại có vai trị ba kết thúc; AUA bình th-ờng mã hóa cho isoleucin ty thể lại xác định methionin Ngời ta cho thay đổi tồn đợc nhờ ty thể hệ thống kín Ngồi hệ gen ty thể, số tr ờng hợp ngoại lệ khác đợc tìm thấy số sinh vật đơn bào Ví dụ số động vật nguyên sinh, ba UAA UAG bình thờng ba kết thúc lại mã hố cho axit glutamic

III hoàn thiện marn eukaryote III.1 Cắt bá c¸c intron

Q trình xảy nhân nhằm cắt bỏ trình tự intron khơng mã hóa khỏi phân tử tiền-mARN để hình thành nên phân tử mARN hồn chỉnh chứa trình tự mã hố liên tục tơng ứng với exon Sau đó, phân tử mARN hoàn chỉnh đợc chuyển tế bào chất để làm khn tổng hợp protein

Q trình cắt bỏ intron phụ thuộc vào trình tự tín hiệu đoạn nối intron exon Các intron điển hình đợc giới hạn đầu 5’-GT 3’-AG Đoạn trình tự tín hiệu đầy đủ đầu 5’ gặp phần lớn gen là: AGGTAAGT-3’ đầu 3’ 5’-YYYYYYNCAG-3’ (Y = pyrimidin, N = nucleotit bất kỳ)

Việc cắt bỏ intron đợc thực phức hệ gọi spliceosom, gồm phân tử tiền-mARN liên kết với hạt ribonucleoprotein nhân kích thớc nhỏ snRNP (small

nuclear ribonucleoprotein particle, đợc đọc tắt snớp) snRNP đợc tạo thành tự liên kết snARN protein Có loại snARN phổ biến đợc kí hiệu U1, U2, U4, U5 U6 Mỗi loại liên kết với số phân tử protein để hình thành nên snRNP Trừ U4 U6 thờng tìm thấy snRNP, cịn loại khác tìm thấy snRNP riêng biệt

1) U1 snRNP gắn vào vị trí cắt đầu intron Việc gắn dựa nguyên tắc bổ trợ U1 snARN có snRNP với trình tự đoạn nối với exon gần ®Çu 5’ cđa intron

2) U2 snRNP gắn vào trình tự gọi điểm phân nhánh nằm ngợc dịng so với đoạn nối với exon phía đầu 3’ intron Điểm phân nhánh vị trí đặc thù intron, chứa adenyl vị trí gắn vào đầu 5’ tự intron trình cắt bỏ intron

3) Phøc hệ U4/U6 snRNP tơng tác với U5 snRNP gắn vào phức hệ U1 U2 snRNP làm hai đầu intron tiến lại gần nhau, tạo thành cấu trúc thòng lọng

4) U4 snRNP tách khỏi phức hệ, lúc spliceosome chuyển thành dạng có hoạt tính cắt (exonuclease)

5) snRNP cắt intron đầu tạo đầu tự Đầu liên kết với nucleotit A điểm phân nhánh vào vị trí nhóm 2-OH (liên kết phosphodieste 5-2) Nhóm 3-OH adênyl liên kết bình thờng với nucleotit khác chuỗi

6) Intron đợc cắt phía đầu 5’ (intron dạng thòng lọng) exon liền kề hai đầu 5’ 3’ intron liên kết với Lúc phức hệ snRNP rời khỏi phân tử ARN Và trình cắt intron nh đợc lặp lặp lại

Exon Exon

Tr×nh tù điểm phân nhánh

Vị trí cắt đầu Vị trí cắt đầu

Intron

Tiền-mARN

Sự hình thành cấu trúc thòng lọng

Cắt đầu nối exon

Các exon đ ợc nối víi nhau

Q trình cắt intron nh đợc tìm thấy gen đợc phiên mã nhờ ARN polymerase II Ngoài chế đây, số loại phân tử ARN tự cắt bỏ intron Q trình cắt bỏ intron khơng phụ thuộc vào protein đợc gọi intron nhóm I Cơ chế tự cắt intron nhóm I đợc tìm thấy gen rARN, số gen mã hóa protein ti thể số gen mã hóa mARN tARN thực khuẩn thể

Một ví dụ q trình tự cắt intron nhóm I (ở Tetrachynema) đợc mơ tả nh sau: 1) Phân tử tiền-mARN đợc cắt vị trí nối với exon phía đầu 5’ nucleoit G gắn

vào vị chí cắt

2) Intron c cắt vị trí nối đầu 3’ 3) Hai exon liền kề đợc nối lại với

4) Phần intron đợc cắt đóng vịng tạo thành phân tử ADN dạng vòng Sản phẩm tạo intron dạng mạch vòng phân tử ADN chứa exon dạng mạch thẳng

Quá trình tự cắt intron nhóm I ARN tự xúc tác, ARN có hoạt tính nh đợc gọi ribozym Tuy vậy, hoạt tính tự xúc tác ARN khơng nên coi hoạt tính enzym Bởi, không giống nh enzym protein, phân tử ARN không trở dạng ban đầu sau phản ứng kết thúc

Việc tìm ARN có hoạt tính xúc tác gần giống với protein làm thay đổi quan điểm nguồn gốc sống Trớc đây, ngời ta cho protein yếu tố thiết yếu để trình chép nucleotit xảy Nhng lý thuyết gần cho axit nucleic có khả tự chép thơng qua hoạt tính kiểu ribozym

III.2 L¾p mị

Đầu 5’ phân tử mARN sinh vật nhân chuẩn đợc sửa đổi cách gắn thêm nucleotit bị cải biến 7-methylguanosin (7-mG); q trình đợc gọi lắp mũ Mũ 7-mG đợc gắn nhờ enzym guanyltransferase nối GTP với nucleotit mARN liên kết triphotphat 5’ 5’ khác thờng Sau enzym methyl transferase gắn thêm nhóm -CH3 vào nitơ số vòng guanin; đồng thời thờng gắn thêm vào nhóm 2’-OH đờng ribose hai nucleotit Việc tạo mũ giúp bảo vệ đầu 5’ mARN không bị phân hủy exonuclease tế bào chất, đồng thời làm tín hiệu cho ribosom nhận biết điểm bắt đầu phân tử mARN

III.3 G¾n ®u«i poly(A)

Đầu 3’ phân tử tiền-mARN hầu hết sinh vật nhân chuẩn đợc sửa đổi cách thêm vào đoạn trình tự poly A (cịn đợc gọi polyA) dài tới 250 bazơ adenin Sự sửa đổi đợc gọi đa adenin hóa cần có trình tự tín hiệu phân tử tiền-mARN Đó trình tự 5’-AAUAAA-3’ nằm gần đầu 3’ phân tử tiền-mARN Khoảng 11 - 20 bazơ có trình tự YA (Y = pyrimidin), tiếp đến đoạn trình tự giàu GU nằm xi dịng Có nhiều protein đặc hiệu có khả nhận biết gắn vào đoạn trình tự tín hiệu tạo thành phức hệ cắt mARN vị trí khoảng 20 nucleotit phía sau trình tự 5’-AAUAAA-3’ Sau đó, enzym poly(A) polymerase bổ sung thêm adenin vào đầu 3’

Exon Trình tự điểm phân nhánh Exon Vị trí cắt đầu Vị trí cắt đầu

Intron

TiÒn mARN

U1, U2

U2 U1

U5, U4/6

Exon Exon

Phøc hƯ c¾t intron (spliceosom) Intron

U1

U2

U6 U4 U5

5

Hình 6. Sự hình thành phøc hƯ c¾t intron (spliceosom)

mARN Mục đích tạo A cịn cha rõ, nhng có vai trị bảo vệ cho mARN khơng bị phân hủy đầu 3’ exonuclease Tuy nhiên, số mARN, nh mARN mã hoá protein histon, khơng có polyA (nhng thờng có thời gian tồn ngắn)

III.4 TÝnh bỊn v÷ng cđa mARN

Khơng giống nh rARN tARN có tính bền vững cao tế bào, mARN có vịng đời tơng đối ngắn Điều tế bào cần điều tiết mức độ tổng hợp loại protein tế bào tùy theo yêu cầu thông qua thay đổi mức độ phiên mã Sự thay đổi lợng mARN dịch mã phản ánh thay đổi mức độ phiên mã tế bào vi khuẩn, mARN có thời gian bán phân hủy khoảng vài phút Trong khi, tế bào nhân chuẩn, mARN có thời gian bán phân hủy lên đến Mặc dù số mARN, nh mARN mã hố globin cấu tạo nên hemoglobin, tồn lâu tế bào

III.5 Các phân tử mARN đợc hoàn thiện theo cách khác nhau

Một trình tự ADN phiên mã cho phân tử tiền-mARN, nhng phân tử tiền-mARN đợc hoàn thiện cách khác để tạo nhiều loại phân tử mARN hoàn chỉnh khác trớc đợc sử dụng làm khn tổng hợp protein Đó chế cắt bỏ tiền-mARN khác nhau, tế bào sử dụng điểm cắt khác biệt để loại bỏ hay giữ lại exon trình cắt bỏ Ngồi ra, việc tồn tín hiệu poly(A) khác phân tử tiền-mARN dẫn đến việc sinh phân tử mARN có trình tự dài ngắn khác đầu 3’ Ví dụ, việc sử dụng điểm poly(A) nằm phía trớc điểm kết thúc đoạn trình tự mã hố loại bỏ số exon nằm sau sinh mARN mã hóa cho loại protein ngắn

Một phân tử tiền-mARN đợc cắt bỏ intron theo cách khác lúc giai đoạn phát triển khác tế bào, khác tế bào khác Các protein đợc sinh theo chế thờng có quan hệ với nhau, song chúng thờng biểu chức có đặc điểm riêng Ví dụ, q trình hồn thiện phân tử tiền-mARN globulin miễn dịch dẫn đến việc tổng hợp protein chứa khơng chứa trình tự axit amin kỵ nớc cho phép liên kết đợc vào màng tế bào Điều giúp tạo nhiều dạng globulin miễn dịch liên kết với màng dạng để tiết khỏi tế bào

Các phân tử tiền-mARN cịn trải qua q trình sửa đổi trình tự ARN Trong q trình đó, trình tự phân tử tiền-mARN bị biến đổi cách thêm vào, bớt hay thay bazơ Sự sửa đổi trình tự ARN đợc xác định số nguyên sinh động vật ký sinh loài này, ngời ta thấy phiên mã nhiều gen ty thể bị sửa đổi cách đợc bổ sung thêm gốc uracil Quá trình gặp động vật có xơng sống, nhng mức độ sửa đổi nhiều ngời, phân tử tiền-mARN gen apolipoprotein B bị sửa đổi tế bào ruột non cách thay bazơ C U để tạo nên ba kết thúc, dẫn đến việc tổng hợp phân tử protein ngắn Trong tế bào gan, nơi trình tự ARN khơng bị sửa đổi, protein có độ dài đầy đủ

IV VỊ bƯnh di trun

VI.1 Các dạng bệnh di truyền

Cú mt nhúm a dạng bệnh lý rối loạn gây đột biến gen thay đổi bất thờng nhiễm sắc thể Các rối loạn có chất di truyền chia làm nhóm chính:

Các sai hỏng đơn gen

Các sai hỏng đơn gen đợc gọi các rối loạn di truyền Mendel (Mendelian disorders), các rối loạn đơn gen (monogenic disorders), hay các rối loạn đơn locut (single locus disorders) Đây nhóm dạng bệnh lý gây có mặt gen đột biến thể bị bệnh Đột biến gen làm thay đổi thơng tin mã hóa gen và, dẫn đến việc tạo phân tử protein bị sai hỏng chức năng, trí ức chế hồn tồn tổng hợp protein mà gen mã hóa Sự thiếu hụt protein đột biến gen gây nên biểu trạng thái bệnh lý Đột biến gen đợc di truyền hệ (từ bố, mẹ sang con, cháu) xuất cách tự phát (de novo) tế bào sinh dục (tinh trùng trứng) thể bố mẹ, sau thụ tinh, đứa trẻ hình thành mang đột bin mi t bo

Các rối loạn nhiễm s¾c thĨ

tợng lệch bội) Các dạng bất thờng cấu trúc nhiễm sắc thể gây đứt gẫy nhiễm sắc thể liên quan đến tợng đoạn, lặp đoạn hoc o on nhim sc th

Các rối loạn ®a nh©n tè

Đây nhóm gồm nhiều bệnh phổ biến, ví dụ nh đái tháo đờng, bệnh mạch vành phần lớn dị tất bẩm sinh Các bệnh gây ảnh hởng nhiều gen theo chế bệnh lý phức tạp cha đợc hiểu biết đầy đủ, nhng đợc biết có liên quan đến tơng tác nhiều gen với nhau, gen với yếu tố môi trờng

Trong khoảng 20 năm qua, nhờ phát triển công nghệ ADN tái tổ hợp, có nhiều phát mang tính bớc ngoặt liên quan đến bệnh lý rối loạn đơn gen gây Thông tin đợc nêu phần dới liên quan đến số rối loạn bệnh lý nh

VI.2 H×nh thøc di trun

Các rối loạn di truyền đơn gen đợc truyền từ hệ bố, mẹ sang hệ con, cháu Có ba hình thức di truyền phổ biến: di truyền trội nhiễm sắc thể thờng, di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thờng di truyền liên kết nhiễm sắc thể X (Bảng 1)

Trong trờng hợp bệnh di truyền alen trội nằm nhiễm sắc thể thờng quy định, việc truyền alen gây bệnh từ bố mẹ sang đủ để cá thể biểu bệnh Các cá thể bị bệnh có alen bình thờng alen đột biến gây bệnh đợc gọi thể dị hợp tử Các cá thể có nguy truyền cho 50 % số alen đột biến biểu bệnh (hình 7a)

Trong trờng hợp bệnh di truyền alen lặn nằm nhiễm sắc thể thờng quy định, cá thể biểu bệnh phải mang đủ cặp alen đột biến gây bệnh, bắt nguồn từ bố, từ mẹ Cá thể biểu bệnh trờng hợp gọi cá thể đồng hợp từ alen đột biến Các cá thể dị hợp tử với alen gây bệnh khơng biểu bệnh nhng có khả truyền alen gây bệnh sang 50% số cá thể Đối bố mẹ cá thể dị hợp tử mang alen lặn gây bệnh nhiễm sắc thể thờng, phần t số biểu bệnh, phần t bình thờng nửa số cá thể thể mang alen gây bệnh nhng không biểu bệnh (hình 7b)

Trong trờng hợp bệnh di truyền liên kết với nhiễm sắc thể X, gen đột biến gây bệnh chỉ xuất nhiễm sắc thể X Do đực có nhiễm sắc thể X nhất, việc truyền alen đột biến sang cá thể giới đực đủ để cá thể biểu bệnh Các cá thể đực biểu bệnh gọi cá thể dị giao tử Các có hai nhiễm sắc thể X th ờng không biểu bệnh phần lớn gen đột biến gây bệnh nằm nhiễm sắc thể X alen lặn Đối với cá thể mang gen gây bệnh nhng không biểu bệnh, 50% đực hệ có nguy bị bệnh 50% thể mang gen gây bệnh nh ng khơng biểu bệnh (hình 7c)

Hình (a) Alen trội NST thờng Sự di truyền alen đột biến (a) dẫn đến biểu hiện bệnh (b) Alen lặn NST thờng Các cá thể bị bệnh phải mang hai alen đột biến (aa) Các cá thể dị hợp tử (Aa) thể mang (c) Alen liên kết NST X, thể mang cái, 50% số cá thể giới đực bị bệnh, 50% số cá thể giới thể mang

Bảng Một số bệnh lý di truyền n gen

Bệnh lý Tần số 1000

trẻ Hình thức di truyền Gen đột biến Đặc điểm

Máu khó đơng dạng

A 0,1 Liªn kÕt NST X Nhân tố VIII Chảy máu bất thờng

Máu khó đơng dạng

B 0,03 Liªn kÕt NST X Nhân tố IX Chảy máu bất thờng

Loạn dỡng 0,3 Liên kết NST X Dystrophin Hao mòn (a)

Bị bệnh

Bị bệnh Bị bệnh

Bị bệnh Bị bệnh

Bình th ờng

B×nh th êng B×nh th êng

B×nh th êng B×nh th êng ThĨ B×nh th êng mang

ThĨ

mang mangThĨ ThĨ mang

ThĨ mang B×nh th êng ThĨ mang

Alen bình th ờng Alen đột biến Cá thể đực Cá thể

(b)

Duchene Loạn dỡng

Becker 0,05 Liên kết NST X Dystrophin Hao mòn

Hội chøng NST X

yÕu 0,5 Liªn kÕt NST X FMR1 ChËm ph¸t triĨn trÝ t

BƯnh móa giËt Huntington

0,5 Trội, NST thờng Hungtingtin Chứng tâm thần phân liệt U sơ thần kinh 0,4 Trội, NST thêng NF-1,2 Ung th

Héi chøng thalassemi

0,05 Lặn, NST thờng Các gen globin Thiếu máu Thiếu máu hồng cầu

hình liềm 0,1 Lặn, NST thêng  - globin ThiÕu m¸u; ThiÕu m¸u cơc Phenylketo niệu 0,1 Lặn, NST thờng

Phenylalanine-hydroxylase Không có khả chuyển hóa phenylalanin Hóa xơ nang 0,4 Lặn, NST thờng CFTR Bệnh hỏng phổi tích lũy

các triệu chứng khác

cú cân đực lợng sản phẩm gen nằm nhiễm sắc thể X mã hóa, tự nhiên có tợng hai nhiễm sắc thể X tế bào bị bất hoạt Quá trình đợc gọi hiện tợng Lyon hóa (giả thiết Lyon) thờng diễn q trình phát triển phơi Trong tế bào, nhiễm sắc thể X bị bất hoạt đợc “chọn” cách ngẫu nhiên Tuy vậy, số thể mang gen gây bệnh nằm nhiễm sắc thể X biểu bệnh mức độ nhẹ bất hoạt nhiễm sắc thể X bình thờng

VI.3 Sai hỏng đơn gen

Có nhiều bệnh di truyền gen đơn quy định xuất ngời (Bảng 7) Các bệnh có đặc điểm biểu đa dạng khác hậu cá thể bị bệnh khác tùy thuộc vào mức độ quan trọng gen bị đột biến chất loại đột biến xuất Một số bệnh, nh bệnh máu khó đơng, gây nên triệu chứng bệnh điều trị đợc, nhng bệnh khác chẳng hạn nh hội chứng múa giật Huntington, đến cha có biện pháp điều trị triệt để ngời bệnh thờng chết trẻ

Các bệnh di truyền đơn gen quy định thờng xuất với tần số tơng đối thấp nằm khoảng 0,01 đến 5,0 trờng hợp 1000 em bé sơ sinh Tần số rối loạn di truyền thờng khác chủng tộc ngời khác Chẳng hạn, tần số bệnh nhân bị xơ nang cao nớc Bắc Âu, bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm xảy với tần số cao Châu Phi bệnh -thalassemia phổ biến quần thể Châu Đối với bệnh di truyền đơn gen phổ biến ngời đến xác định tách dòng đợc gen gây bệnh đồng thời xác định đợc đột biến gây bệnh

VI.4 Các đột biến sai hỏng đơn gen

Có thể chia loại đột biến tạo alen gây bệnh thành hai loại chính: các đột biến điểm liên quan đến thay đổi bazơ nitơ các đột biến lớn liên quan đến thay đổi trình tự ADN với kích thớc lớn Đối với loại bệnh, có vài dạng đột biến khác Ngoài ra, cá thể bị bệnh lúc mang gen đột biến khác Ví dụ, có khoảng 20% trờng hợp bị bệnh máu khó động dạng A kết đột biến lớn gây Các trờng hợp lại dạng đột biến điểm mà đến nhà nghiên cứu tìm mơ tả 250 kiểu đột biến khác

Các đột biến điểm

Các đột biến điểm gây nên bệnh di truyền chia thành số kiểu sau:

Các tế bào hồng cầu hình liềm có tuổi thọ ngắn gây nên tợng thiếu máu nằm mao mạch làm giảm khả cung cấp máu tới quan (chứng thiếu m¸u cơc bé)

(2) Các đột biến vơ nghĩa Đây thay đổi nucleotit phân tử ADN làm chuyển mã ba mã hóa axit amin thành mã ba kết thúc trình phiên mã kết thúc sớm bình thờng dẫn đến hình thành phân tử protein có kích thớc ngắn Các đột biến vơ nghĩa thờng gây hậu nghiêm trọng phân tử protein đợc mã hóa, đặc biệt xuất gần đầu 5’ gen Nhiều bệnh di truyền khác đ ợc xác định có liên quan đến đột biến vơ nghĩa Ví dụ nh đột biến C thành T ba số 39 gen mã hóa -globin làm thay đổi mã ba bình thờng CAG quy định glutamin thành TAG ba mã kết thúc Đột biến gây nên kết thúc phiên mã sớm phân tử mARN mã hóa cho -globin dẫn đến thiếu hụt chuỗi polypeptit  gây nên dạng bệnh lý gọi -thalassemia với triệu chứng bệnh thiếu máu phân tử hemoglobin bình thờng khơng đợc tạo thành

(3) Các đột biến dịch khung Những đột biến xảy thêm vào hay hay số bazơ nitơ làm thay đổi khung đọc tập hợp ba mã hóa đợc hình thành kể từ điểm đột biến xảy Đột biến dịch khung thờng gây nên hậu nghiêm trọng phân tử protein đợc mã hóa, đặc biệt đột biến xuất gần đầu 5’ gen Nhiều bệnh lý đợc mô tả liên quan đến đột biến dịch khung Chẳng hạn đột biến dịch khung đợc tìm thấy nguyên nhân gây nên bệnh máu khó đơng nhiều bệnh nhân mắc bệnh Trong bao gồm trờng hợp bazơ nitơ gây nên thay đổi khung đọc từ ba mã hóa thứ 50 đột biến thêm 10 bazơ làm thay đổi khung đọc từ ba mã hóa thứ 38 Cả hai kiểu đột biến gây triệu chứng bệnh nghiêm trọng

(4) Đột biến vị trí cắt intron Đây đột biến làm thay đổi trình tự tín hiệu gần đầu 3’ 5’ đoạn intron dẫn đến việc cắt intron sai trình hoàn thiện phân tử mARN sinh vật nhân chuẩn Các đột biến kiểu xảy bên intron tạo nên điểm cắt intron dẫn đến cắt sai trình tự intron Một loạt đột biến vị trí cắt intron đợc tìm thấy liên quan đến đột biến gen -globin làm thiếu hoàn toàn chuỗi -globin thể đồng hợp tử gây bệnh -thalassemia

(5) Đột biến trình tự gen điều hịa Các đột biến xảy tơng đối ảnh hởng đến việc điều hòa hoạt động gen, thờng làm giảm làm tăng mức độ biểu gen Một đột biến nh đợc xác định trình tự huy gen mã hóa protein đơng máu (là protein yếu tố IX) nguyên nhân gây nên bệnh máu khó đơng Các cá thể mang đột biến không tạo đợc protein yếu tố IX bị chảy máu cách bất thờng Thông thờng, triệu chứng bệnh thờng sau tuổi dậy nhờ hócmơn steroid kích thích biểu gen

Các đột biến lớn

Có nhiều bệnh lý gây đột biến liên quan đến trình tự dài nucleotit phân tử ADN Phần lớn đột biến có ảnh hởng nghiêm trọng đến chức gen gây bệnh nặng

(1) Các đột biến đoạn Sự gen biểu hiển với mức độ kích thớc khác nhau, từ vài bazơ nitơ đến tồn gen, trí nhiều gen lúc Sự hồn tồn gen mã hóa -globin gây nên bệnh -thalassemia (bệnh khả sản xuất hemoglobin bình thờng) Ví dụ nh, phần gen mã hóa dystrophin gây nên bệnh mịn cơ, bệnh loạn dỡng cơ; hay ba mã hóa gen tổng hợp protein điều hòa độ dẫn xuyên màng bệnh xơ nang CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) nguyên nhân gây bệnh gặp phải 70% số bệnh nhân bị bệnh xơ nang

(2) Các đột biến thêm đoạn Nhiều đột biến thêm đoạn đợc ghi nhận Ví dụ nh trờng hợp bệnh nhân bị máu khó đơng dạng A gặp có nguyên nhân gây bệnh thêm vào gen mã hóa yếu tố VIII trình tự lặp lại gọi yếu tố LINE

(3) Các đột biến thay đoạn gen Cũng có nhiều đột biến thay đoạn gen gây nên bệnh di truyền đợc ghi nhận Ví dụ nh đột biến gây bệnh máu khó đơng dạng A xảy tái tổ hợp trình tự nằm vùng intron thứ 22 gen mã hóa yếu tố VIII trình tự lặp lại kép dọc theo nhiễm sắc thể X Do lỗi xảy trình tái tổ hợp, gen mã hóa yếu tố VIII bị cắt thành mảnh tách biệt hàng triệu cặp bazơ nitơ, làm hoàn toàn chức gen

VI.5 VỊ mét sè bƯnh di trun

1) Trao đổi chéo nguyên phân tạo thể khảm di truyền số bệnh ung th ngời

Trao đổi chéo đặc tính quan trọng q trình giảm phân Phức hệ trao đổi chéo “xác định” vị trí tái tổ hợp đồng thời giữ cho NST tơng đồng gắn kết với nhau, cho phép chúng thành cặp tiến mặt phẳng xích đạo kỳ giảm phân I, sau phân ly hai cực đối diện tế bào Ngoài ra, TĐC giảm phân chế góp phần làm tăng tính đa dạng dạng loại giao tử Vì vậy, khơng có ngạc nhiên thể sinh vật nhân chuẩn biểu đa dạng lớn loại enzym tham gia khởi đầu đặc hiệu TĐC giảm phân TĐC xuất nguyên phân Tuy vậy, không giống kiện diễn giảm phân, TĐC nguyên phân thờng xảy lỗi xuất trình tái NST bị chiếu xạ dẫn đến đứt gãy phân tử ADN, khơng phải chơng trình đợc điều hịa bình thờng tế bào nh giảm phân Vì vậy, TĐC nguyên phân kiện xảy ra, xuất với tần số thấp 10-6 lần phân bào nguyên nhiễm Tuy vậy, việc nuôi cấy tế bào nấm men quá trình phát triển thể đa bào phức tạp có số lần phân chia tế bào đủ lớn để nhà di truyền học hàng ngày phát theo dõi đợc tợng TĐC nguyên phân vốn xảy với tần số thấp Khác với giảm phân, TĐC xảy nguyên phân xảy ngẫu nhiên số tế bào soma, tạo nên tế bào soma mang “hệ gen” khác Do vậy, cá thể mang tế bào soma chứa NST bị TĐC đợc gọi cỏc th khm

ở ngời, số TĐC xảy nguyên phân gây nên hình thành khối u (ví dụ: số bệnh u mắt) số quần thể ngời, số trẻ sơ sinh có bẩm chất di truyền có nguy bị ung th có tần số vào khoảng 1/20.000 trẻ sơ sinh Gen gây khối u võng mạc (RB) nằm NST số 13, alen kiểu dại bình thờng (RB+) mà hóa cho loại protein điều hòa

s phát triển biệt hóa võng mạc Các tế bào mắt cần alen kiểu dại để trì điều hịa hoạt động phân chia tế bào Một đột biến alen RB+ có

thể dẫn đến làm hỏng chức alen kiểu dại đợc ký hiệu RB- Nừu tế bào mất

đi hai RB+, khả điều hịa hoạt động phân chia tế bào bình

th-ờng gây nên hình thành khối u Ví lý này, alen kiểu dại RB+ có đợc xem l mt gen c

chế hình thành khèi u

Những cá thể có bẩm chất di truyền có nguy ung th võng mạc đợc sinh mang alen RB+ NST số 13 thứ hai họ mang alen RB- hồn tồn khơng có

gen RB Nếu tác nhân đột biến (ví dụ: chiếu xạ) hay lỗi xảy trình nguyên phân làm alen RB+ lại tế bào hai mắt khối u

võng mạc bắt đầu phát triển từ vị trí tế bào sai hỏng Một nghiên cứu bệnh nhân bị bệnh u võng mạc cho thấy xuất tế bào mắt với kiểu gen đồng hợp t RB-/RB-,

trong tế bào bạch cầu ngời bệnh dạng dị hợp tử RB+/RB- Nh minh häa ë h×nh A, mét

TĐC nguyên phân gen RB tâm động nhiễm sắc thể mang gen chế gây nên hình thành tế bào mang kiểu gen RB-/RB- Khi tế bào hình thành, đợc phân chia

một cách khơng đợc kiểm sốt dẫn đến hình thành khối u

Chỉ có 40% trờng hợp bị bệnh ung th võng mạc có chế gây bệnh nh trên, cịn 60% cịn lại sinh có kiểu gen bình thờng RB+/RB+ ngời này, hai đột biến phải

cùng xảy hai gen RB gây nên ung th Đột biến đầu tiến dẫn đến alen RB+ bị chuyển thành RB-, cịn sau tế bào xảy TĐC trình nguyên

phân dẫn đến phát triển ung th alen đột biến bị “đồng hợp tử” hóa

Đáng ý TĐC nguyên phân gây nên hình thành số bệnh ung th võng mạc giúp giải thích biểu mức độ bệnh lý khác Những trẻ sơ sinh có kiểu gen RB+/RB- không bị bệnh Hoặc mắc bệnh, phát triển khối u xảy cả

hai mắt, nhng xảy mắt Tất tợng phụ thuộc vào việc tế bào thể xảy tợng TĐC nguyên phân

2) §ét biến gen mà hóa protein cảm thụ ánh sáng thị lực

Nhng nghiờn cu u tiờn mụ tả bất thờng khả cảm thụ ánh sáng ngời đợc khoảng 200 năm trớc Thời đó, ngời ta phát nhiều đột biến gây ảnh hởng đến thị lực ngời Bằng việc phân tích kiểu hình liên quan đến loại đột biến sau kiểm tra biến đổi ADN Ngày nay, có hiểu biết chi tiết chế di truyền phân tử tính trạng cảm nhận ánh sáng, màu sắc loại protein mà gen mã hóa

lý học cung cấp phép thử để xác định so sánh xác kiểu hình Chẳng hạn, phép phân tích dựa kiện ngời cảm nhận màu nh hòa trộn ba dải bớc sóng tơng ứng với màu đỏ, xanh dơng (xanh lam) xanh lục điều chỉnh tỉ lệ cờng độ sáng ba màu để thu đợc dải bớc sóng tơng ứng với màu thứ t, chẳng hạn màu vàng Một ngời với thị lực bình thờng, chọn tỉ lệ màu thích hợp màu đỏ màu xanh lục để tạo nên màu vàng đặc thù, nhng ngời khơng có khả phân biệt màu đỏ với màu xanh lục kết hợp hai màu cho màu giống Cuối cùng, biến dị di truyền liên quan đến thị giác gây ảnh hởng đến hoạt động sinh sản hay tuổi thọ xã hội ngời đại, đột biến tạo nhiều alen làm thay đổi khả cảm nhận màu sắc alen đột biến đợc trì lâu dài quần thể

a) Cơ sở phân tử tế bào cảm nhận màu sắc mắt

Các tế bào cảm nhận ánh sáng màu sắc

Chỳng ta cảm nhận đợc hình ảnh qua nơron thần kinh võng mạc phần phía sau nhãn cầu (hình 8a) Những nơron có hai loại: tế bào hình nón tế bào hình que Các tế bào hình que chiếm 95% số lợng tế bào cảm nhận ánh sáng đợc kích thích ánh sáng yếu bớc sóng ánh sáng cờng độ sáng lớn hơn, tế bào hình que bị bão hịa khơng cịn chức gửi tín hiệu thêm đến não Lúc này, tế bào hình nón tiếp quản chức này, xử lý bớc sóng ánh sáng cờng độ sáng mạnh giúp phân biệt đợc màu sắc Các tế bào hình nón có ba loại Loại thứ chuyên hóa để cảm nhận ánh sáng đỏ, loại thứ hai cảm nhận ánh sáng xanh lục loại thứ ba cảm nhận ánh sáng xanh dơng Đối với tế bào thụ quan ánh sáng nh vậy, hoạt động cảm nhận ánh sáng bao gồm hấp thụ photon từ ảnh sáng dải b-ớc sóng định, chuyển thơng tin số lợng lợng photon thành tín hiệu điện, chuyển tín hiệu qua tế bào thần kinh thị giác tới não

Bèn gen mà hóa bốn chuỗi polypeptit cảm nhận màu sắc

Các protein cảm nhận photon khởi đầu trình truyền tín hiệu tế bào hình nón rhodopsin Protein chuỗi polypeptit gồm 348 axit amin xếp thành chuỗi zigzag xuyên màng tế bào (hình 8.b.1) Một axit amin lysine nằm chuỗi liên kết với phân tử carotenoid sắc tố võng mạc có khả hấp thụ photon Các axit amin gần vùng liên kết võng mạc cấu trúc nên vị trí hoạt động rhodopsin Bằng việc thay đổi vị trí võng mạc qua chế đặc biệt, rhodopsin xác định đáp ứng lại ánh sáng tế bào võng mạc Mỗi tế bào hình que thờng chứa khoảng 100 triệu phân tử rhodopsin lớp màng đặc thù Gen mã hóa tổng hợp rhodopsin ngời nằm NST số

Protein có vai trị cảm nhận khởi đầu q trình truyền tín hiệu tế bào hình nón photon màu xanh dơng có liên quan đến rhodopsin Protein chuỗi polypeptit gồm 348 axit amin bao quanh phân tử sắc tố võng mạc Gần 50% trờn

Các tế bào hình nón hình que

ánh sáng

ánh sáng Võng mạc

Biểu mô sắc tố

Tế bào thụ cảm ánh sáng Hình que Hình nón Võng mạc Rhodopsin a)

b) 1- Protein Rhodopsin 2- Protein cảm nhận màu xanh d ¬ng

4-Protein cảm nhận màu đỏ

3-Protein c¶m nhËn mµu lơc

Các gen m hóa protein cảm nhận ã màu đỏ (1) lục (2) NST X

c)

1 2

d)Sù tiến hóa gen cảm nhận màu sắc

Gen tiền thân

Rhodopsin Xanh d

ơng

Hình Cơ sở phân tử tế bào cảm nhận màu sắc (a) tế bào hình nón hình que võng mạc chứa hàng triệu protein thụ thể cảm nhận ánh sáng liên kết màng tế bào (b) thụ thể cảm nhận ánh sáng tế bào hình que rhodopsin Các protein thụ thể cảm nhận màu đỏ, xanh d ơng lục có tế bào hình nón giống với rhodopsin phần lớn trình tự, nh ng đủ khác biệt dẫn đến khả thụ cảm màu sắc khác (c) gen mã hóa protein cảm nhận màu đỏ (1) lục (2) nằm thành chuỗi NST X Ng ời bình th ờng có gen mã hóa protein cảm nhận màu đỏ từ đến gen mã hóa protein cảm nhận màu lục (d) tiến hóa protein cảm nhận màu sắc cho thấy chúng xuất phát từ gen tiền thân trải qua ba đột biến lặp đoạn gen độc lập phân ly chức gen

phân tử protein cảm nhận ánh sáng xanh dơng giống hệt trình tự rhodopsin; phần cịn lại có khác biệt hai protein phần đặc thù cho cảm nhận ánh sáng màu xanh d-ơng (hình 8.b.2) Gen mã hóa protein cảm nhận ánh sáng xanh dd-ơng nằm NST số

Cũng có quan hệ với protein rhodopsin protein cảm nhận ánh sáng màu đỏ xanh lục nằm tế bào hình nón màu đỏ xanh lục Hai protein gồm chuỗi polypeptit nhất, gồm 364 axit amin, liên kết với võng mạc nằm xuyên qua màng tế bào (các hình 8.b.3 4) Cũng giống nh protein cảm nhận màu xanh dơng, protein cảm nhận màu đỏ xanh lục có khoảng gần 50% trình tự axit amin giống với rhodopsin; protein khác biệt trung bình / 100 axit amin Mặc dù khác biệt nhỏ nh vậy, protein đủ để để biệt hóa hai loại tế bào hình nón mẫn cảm với photon ánh sáng thuộc bớc sóng khác nhau, tế bào hình nón màu đỏ xanh lục Cả hai gen mã hóa cho protein màu đỏ xanh lục nằm NST X thành chuỗi Phần lớn NST X tế bào ngời mang gen mã hóa protein cảm nhận ánh sáng đỏ, cịn có từ đến ba gen mã hóa protein cảm nhận ánh sáng xanh lục

Hä gen rhodopsin h×nh thành tợng lặp đoạn phân ly

Sự giống cấu trúc chức bốn loại protein rhodopsin cho thấy gen mã hóa chuỗi polypeptit xuất hiện tợng lặp đoạn gen thụ thể cảm nhận ánh sáng tiền thân, sau phân ly tích lũy nhiều đột biến Các đột biến thúc đẩy khả cảm nhận màu sắc đợc u tiên chọn lọc qua q trình tiến hóa hàng triệu năm Các protein cảm nhận ánh sáng đỏ xanh lục giống cả, khác khoảng 15 axit amin Điều cho thấy hai gen phân ly thời gian gần Sự khác biệt hai protein so với protein cảm nhận màu xanh dơng rhodopsin cho thấy protein phân ly sớm q trình tiến hóa từ gen mã hóa thụ thể cảm nhận ánh sáng tiền thân (hình 8.d)

b) Các đột biến họ gen rhodopsin gây ảnh hởng đến thị lực khả cảm nhận màu sắc

Nhiều đột biến thay axit amin gen rhodopsin gây nên bệnh mù phần hay mù hoàn toàn

Ngời ta phát đợc 29 loại đột biến axit amin gen mã hóa rhodopsin gây nên nhóm bệnh di truyền trội nằm NST thờng đợc gọi chung bệnh loạn sắc tố võng mạc (retinitis pigmentosa) với triệu chứng chức tế bào hình que, dẫn đến thối hóa tế bào võng mạc ngoại vi Những đột biến thờng gây nên hình thành protein rhodopsin khơng đợc gấp nếp theo cấu trúc không gian thông thờng, trở nên bền vững Do protein rhodopsin bình thờng thành phần cấu trúc quan trọng màng tế bào hình que, protein đột biến chức đợc trì tế bào khơng đợc gắn vào màng tế bào nh bình thờng Các tế bào hình que khơng có đủ rhodopsin màng thờng bị chết sau Tùy thuộc vào số tế bào hình que bị chết, mà ngời bệnh bị mù hoàn toàn hay mù phần

Các đột biến khác gen mã hóa rhodopsin gây nên dạng bệnh lý nghiêm trọng bệnh mù ban đêm Các đột biến có mức độ đa hình cao làm thay đổi trình tự axit amin phân tử protein theo hớng làm tăng ngỡng ánh sáng kích thích cần thiết để khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu cảm nhận ánh sáng Với thay đổi này, cờng độ ánh sáng yếu, mắt không cảm nhận đợc màu sắc

Các đột biến gen mã hóa sắc tố tế bào hình nón làm thay đổi thị lực theo một số cách đốn đợc

Các rối loạn thị lực gây đột biến liên quan đến gen sắc tố thuộc tế bào hình nón nghiêm trọng so với rối loạn thị lực gây đột biến tơng tự xảy với gen rhodopsin tế bào hình que Ngun nhân chủ yếu có lẽ tế bào hình que chiếm đến 95% số nơron thần kinh cảm nhận màu sắc ngời, tế bào hình nón chiếm 5% Một số đột biến liên quan đến gen mã hóa protein cảm nhận màu xanh dơng nằm NST số gây nên hội chứng rối loạn thị lực sắc tố xanh (tritanopia) Các đột biến gen mã hóa protein cảm nhận sắc tố đỏ NST X làm chức cảm nhận màu đỏ tế bào hình nón gây bệnh mù màu đỏ Với số đột biến nhỏ khác liên quan đến gen quy định protein cảm nhận màu đỏ gây nên bệnh mù màu đỏ phần hoàn toàn tùy vào vị trị đột biến

Trao đổi chéo khơng cân gen mã hóa protein xanh lục đỏ gây nên phần lớn biến dị tính trạng cảm nhận màu sắc

Một ngời có thị lực bình thờng thơng thờng có gen mã hóa protein cảm nhận màu đỏ Một số ngời bình thờng có gen xanh lục nằm gần kề, số ng-ời khác có số gen xanh lục dao động từ hai đến năm Các gen đỏ xanh lục giống đến 96% trình tự ADN Các gen màu xanh lục khác giống đến 99,9% Do giống nằm gần gen nên tợng trao đổi chéo không tơng

đồng dễ xảy với gen Hàng loạt dạng TĐC khác vùng gen tạo kiểu hình đột biến thiếu vắng hoàn toàn gen màu đỏ, gen màu xanh lục, có tổ hợp khác gen màu xanh lục, mang gen lai xanh lục - đỏ Do khả cảm nhận màu đỏ xanh lục phụ thuộc vào tỉ lệ ánh sáng đỏ xanh lục đ ợc phản chiếu từ hình ảnh, ngời thiếu gen đỏ xanh lục cảm nhận màu đỏ xanh lục màu giống

Một số đột biến làm hồn tồn khả nhìn màu đỏ xanh lục

Đến nay, nhà di truyền học tìm thấy bảy loại đột biến đoạn gây bệnh mù màu đỏ xanh lục liên kết với NST giới tính X Bệnh lý đợc gọi hội chứng tế bào hình nón đơn sắc xanh dơng (blue cone monochromacy), ngời cảm nhận đợc màu liên quan đến màu xanh dơng Nghiên cứu phân tử cho thấy bảy đột biến đoạn liên quan đến đoạn trình tự gồm 600 bp nằm ngồi vùng mã hóa gen đỏ xanh lục Điều cho thấy khả trình tự đoạn trình tự (gen) điều hịa dài cần thiết cho biểu chuỗi gen đỏ xanh lục

Tóm lại, nhìn đợc cảm nhận đợc màu sắc đa dạng, phong phú vạn vật phần nhờ bốn gen trực tiếp tạo bốn loại phân tử protein tế bào hình que hình nón võng mạc mắt Các đột biến làm thay đổi chuỗi polypeptit số l-ợng chúng làm thay đổi làm hỏng thị lực khả cảm nhận màu sắc mắt

V Phân tích gen sản phẩm gen

V.1 Các kỹ thuật phân tích axit nucleic

V.1.1 Điện di phân tích ADN ARN

Cú nhiu phơng pháp khác đợc sử dụng để phân tích ADN ARN, nhng điện di gel là phơng pháp đợc sử dụng phổ biến nhờ u điểm nhanh tơng đối đơn giản Nguyên tắc phơng pháp do: dới tác động điện trờng, phân tử ADN (thờng tích điện âm) khác kích thớc, điện tích, mức độ cuộn xoắn dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) di chuyển qua hệ mạng gel từ cực âm (cathode) sang cực dơng (anode) với tốc độ di chuyển khác Vì vậy, chúng tách tr-ờng điện di, qua ngời ta thu thập phân tích đợc phân đoạn ADN gen riêng rẽ Trên điện trờng phân đoạn ADN có kích thớc nhỏ có tốc độ di chuyển điện trờng nhanh Sau điện di kết thúc, phân tử ADN quan sát thấy nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang, chẳng hạn nh ethidium (chất gắn kết với ADN cách cài vào khe nucleotit) Mỗi băng điện di thờng phản ánh tập hợp phân tử ADN có kích thớc

Có hai loại vật liệu làm gel đợc sử dụng phổ biến điện di, agarose

polyacrylamid Trong đó, gel polyacrylamid có khả phân tách cao, nhng khoảng kích thớc ADN phân tích hẹp Vì vậy, điện di gel polyacrylamid phân tách đợc phân đoạn ADN khác trí cặp nucleotit (1 bp) nhất, nh ng thờng để phân tích đoạn ADN kích thớc vài trăm bp Cịn gel agarose có khả phân tách thấp phân đoạn ADN kích thớc nhỏ, nhng hiệu phân tách phân đoạn ADN kích thớc lớn tới hàng chục hàng trăm kb (1 kb = 1000 bp)

Các phân đoạn ADN kích thớc lớn khơng thể “lọt” qua lỗ có kích thớc nhỏ gel, kể gel agarose Thay vào đó, chúng “trờn” qua mạng lới gel việc đầu phân tử trớc, đầu theo sau Kết phân đoạn ADN kích thớc lớn (từ 30 đến 50 kb) có tốc độ di chuyển điện trờng gần nh tơng đơng khó phân tách đợc ph-ơng pháp điện di thơng thờng Đối với phân đoạn ADN kích thớc lớn nh vậy, ngời ta phân tách việc sử dụng phơng pháp điện di xung trờng (pulsed-field gel electrophoresis) Trong phơng pháp này, ngời ta sử dụng cặp điện cực nằm chéo góc điện di (hình 9) Việc “bật” “tắt” luân phiên cặp điện cực làm cho phân đoạn ADN lớn thay đổi chiều di chuyển nh họa hình vẽ Các phân đoạn ADN có kích thớc lớn chậm trình thay đổi chiều di chuyển Nhờ vậy, phân đoạn có kích thớc khác phân tách khỏi trình di chuyển Kỹ thuật điện di xung trờng thực tế sử dụng để xác định đợc kích thớc đầy

§iƯn cùc

đủ nhiễm sắc thể vi khuẩn, nhiễm sắc thể loài sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, nh nấm men Những lồi có kích thớc hệ gen khoảng vài Mb

Điện di khơng phân tách phân đoạn ADN khác kích thớc mà hình dạng cấu hình không gian chúng Các phân tử ADN dạng mạch vòng giãn xoắn bị “đứt gãy” số nucleotit di chuyển chậm trờng điện di so với phân tử ADN dạng mạch thẳng có khối lợng Tơng tự nh vậy, phân tử ADN dạng siêu xoắn, kích thớc thể tích thu nhỏ thờng di chuyển nhanh trờng điện di so với phân tử ADN dạng mạch vịng giãn xoắn có mức độ cuộn xoắn thấp có khối lợng

Kỹ thuật điện di đợc sử dụng để phân tách phân tử ARN Các phân đoạn ADN sợi kép mạch thẳng có cấu trúc bậc hai đồng nên tốc độ di chuyển tr ờng điện di tơng quan tỉ lệ thuận với khối lợng phân tử chúng Cũng giống nh ADN, phân tử ARN thờng tích điện âm, nhng cấu trúc dạng mạch đơn, cấu trúc bậc phân tử ARN có ảnh hởng đến tốc độ di chuyển chúng trờng điện di Để hạn chế điều này, thông thờng ngời ta phải xử lý ARN với số hóa chất ngăn cản hình thành liên kết cục phân tử ARN, chẳng hạn nh glyoxal Hợp chất liên kết với nhóm -NH2 bazơ nitơ ngăn cản kết cặp nucleotit Các phân tử ARN đợc xử lý glyoxal khơng hình thành đợc cấu trúc bậc có tốc độ di chuyển trờng điện di dờng nh đơn phụ thuộc vào khối lợng phân tử chúng

V.1.2 Sư dơng enzym giới hạn phân tích ADN

Hu ht phân tử ADN tự nhiên lớn nhiều so với kích thớc thao tác phân tích cách thuận lợi phịng thí nghiệm Trong tế bào, phần lớn nhiễm sắc thể thờng phân tử ADN dài chứa hàng trăm trí hàng nghìn gen khác Vì vậy, để phân lập phân tích gen, ngời ta phải cắt phân tử ADN kích thớc lớn thành phân đoạn nhỏ Công việc đợc thực nhóm enzym đặc biệt gọi enzym giới hạn

Tất enzym giới hạn có hai đặc tính: 1) nhận biết trình tự đặc hiệu phân tử ADN (gọi trình tự giới hạn); 2) cắt bên phân tử ADN vị trí đặc hiệu (hoặc vị trí giới hạn nh nhóm enzym giới hạn loại II; cách vị trí giới hạn số nucleotit định nh nhóm enzym giới hạn thuộc nhóm I III) Trong nhóm enzym giới hạn, nhóm thờng đợc dùng nghiên cứu di truyền phân tử kỹ nghệ gen nhóm II nhờ vị trí trình tự cắt chúng đợc xác định rõ Trong phạm vi giáo trình này, đề cập đến việc ứng dụng nhóm enzym giới hạn Các trình tự giới hạn enzym nhóm II thờng gồm - bp, thơng thờng có tính đối xứng vị trí cắt thờng nằm trình tự giới hạn Ví dụ nh enzym giới hạn EcoRI đợc tìm thấy vi khuẩn E coli có trình tự giới hạn 5’-GAATTC-3’ với vị trí cắt G A Tên enzym gồm ký tự đầu tên lồi vi khuẩn mà từ enzym đợc tìm thấy (Eco = Escherichia coli), ký tự sau tên chủng vi khuẩn số thứ tự enzym đợc tìm thấy lồi vi khuẩn (EcoRI enzym giới hạn đợc tìm thấy E coli)

Một enzym giới hạn có trình tự giới hạn gồm bp giống EcoRI thông thờng đợc trơng đợi có trung bình vị trí cắt đoạn trình tự có kích thớc khoảng kb (bởi theo nguyên tắc xác suất vị trí định xác suất để có loại nucleotit định 1/4, xác suất để có trình tự định gồm bp 1/46 = 1/4096) Giả sử có phân tử ADN mạch thẳng có vị trí cắt enzym EcoRI Việc cắt phân tử ADN EcoRI cho phân đoạn ADN khác Do đó, điện di gel sản phẩm cắt, phân đoạn ADN phân tách chúng khác khối lợng (vì chúng khác thành phần trình tự nucleotit) Nh vậy, phân đoạn ADN tơng ứng với vùng phân tử ADN ban đầu

Việc sử dụng enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII có trình tự giới hạn gồm bp, nhng có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT-3’) cho sản phẩm cắt khác với sử dụng EcoRI (với phân tử ADN ban đầu) Nh vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới hạn tạo kiểu hình phổ điện di phân đoạn cắt giới hạn đặc thù gen phân tích

§èi víi số enzym giới hạn khác, chẳng hạn nh Sau3A1 (t×m thÊy ë vi khuÈn Staphylococcus aureus) cã tr×nh tù giới hạn ngắn (5-GATC-3), nên tần số cắt chúng thờng cao enzym có trình tự giới hạn dài Theo xác suất, Sau3A1 có trung bình vị trí cắt đoạn trình tự khoảng 250 bp (1/44 = 1/256) Ngợc lại, enzym NotI có trình tự giới hạn dài (5-GCGGCCGC-3) trung bình đoạn trình tự dài khoảng 65 kb, có vị trÝ c¾t (1/48 = 1/65536).

vậy chúng có xu hớng “dính” trở lại với nhau, với phân tử ADN đợc cắt loại enzym giới hạn Tính chất đợc ứng dụng rộng rãi công nghệ ADN tái tổ hợp kỹ thuật tách dịng phân tử

V.1.3 C¸c phơng pháp lai phân tử mẫu dò

Cỏc phân tử ADN sợi kép có tính chất đặc biệt khả biến tính (phân tách thành hai mạch đơn) hồi tính (hai mạch đơn có trình tự bổ trợ có xu hớng liên kết trở lại vắng mặt tác nhân gây biến tính) Khả liên kết bổ trợ bazơ nitơ cho phép hai mạch ADN có nguồn gốc khác nhng có trình tự bổ trợ liên kết với điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, độ pH, ion hóa …) để tạo nên phân tử ADN Hiện t-ợng liên kết nh xảy hai mạch ADN với nhau, hai mạch ARN ADN ARN Phân tử axit nucleic sợi kép hình thành đợc gọi phân tử lai trình kết cặp bazơ thuộc hai mạch đơn axit nucleic có nguồn gốc khác theo nguyên tắc bổ trợ nh đợc gọi quá trình lai phân tử

Nhiều kỹ thuật nghiên cứu di truyền phân tử đợc dựa nguyên tắc lai phân tử Chẳng hạn, nguyên tắc ngời ta dùng trình tự ADN biết trớc để xác định trình tự bổ trợ tơng ứng có hệ gen mẫu phân tích Phân đoạn ADN có trình tự biết trớc dùng phản ứng lai nh đợc gọi mẫu dị Các mẫu dị có nguồn gốc từ phân đoạn ADN tự nhiên đợc tổng hợp theo nguyên tắc hóa học, để nhận biết đợc chúng, mẫu dò thờng đợc đánh dấu với chất phóng xạ phát huỳnh quang (ở đây, gọi tắt chất phát quang)

Có hai phơng pháp đánh dấu mẫu dò ADN Phơng pháp thứ dùng nguyên tắc tổng hợp hóa học phân tử ADN với tiền chất phân tử đánh dấu Phơng pháp thứ hai gắn phân tử đánh dấu vào trình tự ADN có sẵn Chẳng hạn, việc sử dụng enzym polynucleotide kinase, ngời ta bổ sung nhóm phosphat  ATP vào nhóm 5’-OH phân tử ADN định đánh dấu Nếu nhóm phosphat đợc đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P phân tử ADN đợc dánh dấu phóng xạ.

Phơng pháp đánh dấu ADN thứ hai (sử dụng tiền chất đánh dấu) thờng đợc thực dựa phản ứng PCR, cần sử dụng đoạn mồi ngắn cho enzym ADN polymerase thực phản ứng kéo dài chuỗi Các tiền chất đánh dấu đợc sử dụng thờng loại nucleotit đợc cải biến thành dạng đợc đánh dấu cách gắn với nhóm chất phát quang nguyên tử phóng xạ Với phơng pháp này, khoảng 25% nucleotit phân tử ADN đợc đánh dấu điều đủ đáp ứng hầu hết nhu cầu nghiên cứu khác

Các phân tử ADN đánh dấu với tiền chất phát quang đợc phát cách chiếu xạ mẫu ADN với ánh sáng UV có bớc sóng phù hợp đo bớc sóng phát xạ tơng ứng Các phân tử ADN đợc đánh dấu phóng xạ thờng đợc phát cách chụp mẫu ADN với phim tia X, đo máy khuếch đại tín hiệu hạt  từ nguyên tố phóng xạ 32P 35S (đây là hai nguyên tố phóng xạ đợc sử dụng phổ biến để dánh dấu ADN)

Trong nghiên cứu di truyền học phân tử nay, có nhiều cách để xác định phân đoạn ADN ARN đặc hiệu dựa phơng pháp lai đây, đề cập đến hai phơng pháp đợc dùng phổ biến:

Xác định phân đoạn ADN ARN điện di mẫu dò

Phơng pháp sử dụng mẫu dò kết hợp với điện di phơng pháp giúp xác định mức độ phổ biến kích thớc đoạn trình tự ADN hoăc ARN đợc quan tâm nghiên cứu Chẳng hạn nh kỹ thuật này, ngời ta xác định so sánh đợc mức biểu gen loại tế bào mô khác thông qua định lợng phiên mã mARN tơng ứng gen tế bào mơ tơng ứng; hay nh để xác định kích thớc đoạn ADN cắt giới hạn mang trình tự gen đợc quan tâm nghiên cứu

ADN bắt cặp với mẫu dị đợc xác định phân lập rõ ràng Các phân đoạn phân đoạn mang trình tự gen A cần phân tích

Một phơng pháp tơng tự nh đợc áp dụng trực tiếp để phân tích sản phẩm phiên mã gen mARN, đợc gọi phơng pháp thẩm tách Northern (lai Northern) Tuy vậy, so với ADN phân tử mARN thờng có kích thớc ngắn (khoảng kb), nên thẩm tách Northern, phân tử mARN khơng cần cắt enzym giới hạn (nếu có cắt số vị trí cắt giới hạn enzym phân tử mARN th ờng thấp) Các phân tử mARN sau phân tách điện di đợc chuyển lên màng tích điện dơng lai với mẫu dị ADN có trình tự bổ trợ tơng ứng thờng đợc đánh dấu phóng xạ (trong trờng hợp này, sản phẩm lai kết cặp bazơ nitơ thuộc hai mạch ARN ADN có trình tự bổ trợ)

Trong thực tiễn nghiên cứu, phơng pháp thẩm tách Northern thờng đợc sử dụng để định lợng loại phân tử mARN định có mẫu phân tích, để xác định kích thớc Lợng mARN đợc xác định đợc xem nh thông số phản ánh mức độ biểu gen mã hóa tơng ứng Chẳng hạn nh, phơng pháp thẩm tách Northern, nhà nghiên cứu đánh giá đợc ảnh hởng tác nhân phiên mã đến biểu gen định tiến hành so sánh lợng mARN gen mã hóa có tế bào đợc xử lý không đợc xử lý với tác nhân phiên mã Tơng tự nh vậy, kỹ thuật cho phép xác định so sánh mức độ biểu gen khác loại tế bào, mô quan khác thể giai đoạn giai đoạn khác trình phát triển thể

Trong kỹ thuật thẩm tách Northern, mẫu dò thờng đợc đa vào phản ứng lai với lợng d vừa đủ để đảm bảo lợng phân tử lai tạo thành tơng ứng với lợng mARN có mặt mẫu nghiên cứu Hay nói cách khác, qua lợng sản phẩm lai, định lợng đợc lợng mARN Nguyên lý phơng pháp lai Northern Southern sở kỹ thuật phân tích gen vi dãy phản ứng (microarray) đợc phát triển ngày đợc sử dụng rộng rãi nghiên cứu di truyền học phân tử gần Trong phơng pháp microarray, mẫu dò thờng đoạn cADN đợc tạo từ việc phiên mã ngợc phân tử mARN tơng ứng đợc tách chiết từ mô tế bào Các mẫu dị sau đợc tiến hành lai với dãy phân tử ADN, dãy thờng liên quan đến gen khác thể sinh vật nghiên cứu Cờng độ biểu hiệu sản phẩm lai (nhờ có mặt phân tử đánh dấu) dãy khác góp phần phản ánh mức độ biểu khác gen phân tích

V.1.4 T¸ch dòng phân tử xây dựng th viện hệ gen

Khái niệm tách dòng phân tử th viƯn hƯ gen

Tách dịng phân tử (molecular cloning) khái niệm nhóm phơng pháp đợc sử dụng để: i) phân lập một trình tự gen (ADN) đặc hiệu từ hỗn hợp phân tử ADN ban đầu đợc tách chiết từ mẫu sinh học vốn có cấu trúc phức tạp, kích thớc lớn; ii) khuếch đại (sao chép) trình tự lên số lợng lớn đủ để tiến hành phân tích cấu trúc chức gen tơng ứng

Khả tinh đoạn gen (ADN) đặc hiệu có số lợng đủ lớn cần thiết để “thao tác” đoạn gen mục tiêu nghiên cứu khác Chẳng hạn, từ phân đoạn ADN đợc tách dịng, ngời ta tạo phân tử ADN tái tổ hợp mang phân đoạn ADN mang nguồn gốc khác Các phân tử ADN tái tổ hợp làm thay đổi mức độ biểu bình thờng gen (chẳng hạn việc dung hợp trình tự mã hóa lồi với trình tự promoter lồi khác) chí mã hóa tổng hợp loại protein “dung hợp” (protein lai) mang trình tự axit amin từ protein có nguồn gốc khác Hiện nay, kỹ thuật tách dòng phân tử (bao gồm PCR) trở thành công cụ thiết yếu nghiên cứu điều hòa biểu gen hệ gen loài sinh vật khác

Q trình tách dịng ADN tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp điển hình th ờng liên quan đến việc sử dụng véctơ trình tự mang thông tin điều khiển hoạt động nhân lên (khuếch đại) và/hoặc biểu tế bào phân tử ADN tái tổ hợp mang đoạn ADN cài

(đoạn trình tự đợc phân lập) bao gồm trình tự gen đợc quan tâm nghiên cứu Các “cơng cụ” để tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp enzym giới hạn giúp cắt phân tử ADN vị trí xác định enzym nối cho phép ghép nối phân đoạn ADN có nguồn gốc khác với Bằng việc tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp tự nhận lên tế bào chủ, đoạn ADN cài xác định đợc phân lập, tinh nhân lên thành số lợng lớn

chung loại véctơ mang phân đoạn ADN cài khác Chúng ta thấy cách phân đoạn ADN đặc hiệu đợc xác định phân lập từ cỏc th vin h gen

Tách dòng ADN véctơ plasmit

Sau mt phõn on ADN đợc cắt khỏi phân tử ADN có kích thớc lớn enzym giới hạn, phân đoạn ADN cần đợc “cài” vào véctơ để nhân lên Hay nói cách khác phân đoạn ADN cần đợc cài vào phân tử ADN thứ hai (véctơ) để nhân lên đợc tế bào chủ nh nói Cho đến nay, tế bào chủ đợc sử dụng rộng rãi để nhân lên đoạn ADN công nghệ ADN tái tổ hợp vi khuẩn E coli

Các véctơ ADN điển hình thờng có đặc tính:

1) Chúng phải chứa trình tự khởi đầu chép (tái bản), cho phép chúng tự chép độc lập với nhiễm sắc thể tế bào chủ

2) Chúng phải mang dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng xác định phân lập đ-ợc tế bào mang véctơ tái tổ hợp (mang đoạn ADN cài) với tế bào không mang véctơ tái tổ hợp

3) Có vị trí cắt nhiều enzym giới hạn khác Đây vị trí cài phân đoạn ADN cần tách dòng vào véctơ

Véctơ tách dòng phổ biến phân tử ADN sợi kép, mạch vịng kích thớc nhỏ (khoảng kb) đợc gọi plasmit Các véctơ phần lớn có nguồn gốc từ lồi vi khuẩn số từ sinh vật nhân chuẩn đơn bào (nấm men) Trong nhiều trờng hợp, phân tử ADN tự nhiên mang sẵn gen mã hóa tính kháng chất kháng sinh Nh vậy, plasmid tự nhiên có sẵn hai thuộc tính là: khả tự chép tế bào chủ có trình tự dấu chuẩn chọn lọc Ngồi ra, véctơ plasmit cịn u điểm chúng đồng thời tồn nhiều tế bào Điều giúp khuếch đại phân lập đợc số lợng lớn phân đoạn ADN từ quần thể tế bào nhỏ

Trớc đây, số véctơ plasmit có vị trí cắt enzym giới hạn Cùng với thời gian, cấu trúc véctơ plasmit đợc cải tiến theo hớng cắt bỏ bớt trình tự khơng cần thiết gắn thêm vào đoạn trình tự đợc cắt nhiều loại enzym giới hạn khác Vị trí véctơ mang đoạn trình tự nh đợc gọi vị trí đa tách dịng

(polycloning site) Có vị trí đa tách dịng có kích thớc ngắn nhng đợc cắt 20 loại enzym giới hạn khác Nhờ đặc tính này, véctơ đợc dùng để tách dịng nhiều phân đoạn ADN có nguồn gốc khác Trên sở nguyên tắc tơng tự, véctơ plasmit, ngời ta phát triển đợc nhiều loại véctơ khác có nguồn gốc phagơ, lai vi khuẩn - phagơ (nh phagemid, cosmid …), có nguồn gốc từ nấm men (ví dụ: YAC)

Việc cài phân đoạn ADN vào véctơ thờng công việc tơng đối đơn giản Ngời ta thờng sử dụng loại enzym giới hạn để cắt véctơ đoạn ADN cài Chẳng hạn nh việc sử dụng enzym EcoRI cắt chuyển véctơ từ dạng “vịng” sang dạng “mạch thẳng” có hai đầu dính Do đợc cắt enzym giới hạn, nên đoạn ADN cài có hai đầu dính với trình tự bổ trợ với trình tự đầu dính véctơ Các đầu dính liên kết véctơ đoạn ADN cài lại với hình thành nên phân tử ADN mạch vòng (phân tử ADN tái tổ hợp) thiếu hai liên kết phosphodieste lại mạch Hai liên kết đợc “hàn” kín nhờ sử dụng enzym ADN ligase có mặt ATP Để hạn chế khả gắn kết lại hai đầu dính véctơ (vì hai đầu dính có trình tự bổ trợ) sau đợc cắt enzym giới hạn, ngời ta thờng cho lợng ADN cài d thừa so với véctơ để phần lớn véctơ sau gắn lại véctơ tái tổ hợp mang đoạn ADN cài

Một số loại véctơ cho phép phân lập tinh đợc phân đoạn gen đó, mà cịn điều hịa biểu gen nằm phân đoạn ADN cài Những véctơ nh đợc gọi véctơ biểu hiện Các véctơ thờng phải chứa trình tự promoter nằm ngợc dịng sát với vị trí cài gen Nếu vùng mã hóa gen (khơng chứa promoter) đợc gắn vào véctơ theo chiều khung đọc gen, gen cài đợc phiên mã thành mARN dịch mã thành protein tế bào chủ Các véctơ biểu thờng đợc sử dụng để biểu gen đột biến gen lai để tiến hành phân tích chức chúng Chúng đợc dùng để sản xuất lợng lớn loại protein vốn khơng thu đợc hiệu suất t-ơng tự đờng tự nhiên Ngoài ra, promoter véctơ biểu đ-ợc lựa chọn cho biểu gen cài đđ-ợc điều hòa việc bổ sung hợp chất đơn giản vào môi trờng nuôi cấy (nh loại đờng axit amin chẳng hạn) Việc điều khiển chủ động biểu gen có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt gen gõy c

Biến nạp véctơ ADN vào tÕ bµo chđ

màng tế bào Các tế bào đợc xử lý với Ca2+ vì đợc gọi tế bào khả biến Ngời ta có thể sử dụng chất kháng sinh mà véctơ plasmid mang gen dấu chuẩn mã hóa tính kháng chất kháng sinh để chọn lọc đợc thể mang plasmid tái tổ hợp Các tế bào mang véctơ tái tổ hợp sinh trởng mơi trờng chứa chất kháng sinh, tế bào khác khơng

Thơng thờng q trình biến nạp có hiệu suất khơng cao Chỉ có tỉ lệ nhỏ tế bào đợc xử lý biến nạp tiếp nhận đợc plasmid tái tổ hợp Nhng, hiệu biến nạp thấp giúp hầu hết tế bào mang véctơ tái tổ hợp thờng tiếp nhận plasmid Thuộc tính giúp cho tế bào biến nạp dòng tế bào chúng sinh (do phân chia trực phân) mang véctơ ADN tái tổ hợp cho phép nhà nghiên cứu thể phân lập tinh đợc gen hoặc sản phẩm gen riêng rẽ từ hỗn hợp biến nạp mang phân tử ADN khác

ThiÕt lËp th viÖn hÖ gen

Đối với hệ gen đơn giản, kỹ thuật tách dòng thờng đơn giản Chẳng hạn nh với hệ gen số virut có kích thớc khoảng 10 kb, ngời ta trực tiếp tách chiết ADN, cắt chúng enzym giới hạn tiến hành phân tích điện di Các phân đoạn ADN tách biệt gel điện di đợc cắt khỏi gel, tinh cài vào véctơ

Trong đó, hệ gen phức tạp, kích thớc lớn (nh hệ gen ngời), việc cắt ADN tổng số enzym giới hạn phân tích điện di thờng dẫn đến hình thành dải băng điện di liên tục có phân bố liên tục phân đoạn ADN đợc cắt giới hạn khác một vài nucleotit Vì vậy, để đơn giản hóa quy trình tách dòng hệ gen này, ngời ta thờng tiến hành biến nạp toàn phân đoạn ADN (thu đợc sau cắt enzym giới hạn) vào véctơ tách dòng biến nạp tất chúng vào tế bào chủ, sau phân lập dịng tế bào mang véctơ tái tổ hợp có đoạn cài ADN khác Tập hợp dòng tế bào nh đợc gọi th viện hệ gen Nh vậy, th viện hệ gen tập hợp dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp chứa đoạn ADN cài khác có nguồn gốc (cùng hệ gen)

Để thiết lập th viện gen, hệ gen tế bào đích (chẳng hạn ADN hệ gen ngời) đợc cắt enzym giới hạn để tạo phân đoạn ADN có kích thớc trung bình mong muốn Kích thớc phân đoạn (đoạn cài) dao động từ 100 bp đến Mb (đối với phân đoạn ADN kích thớc lớn, phân tử ADN th-ờng đợc cắt khơng hồn tồn enzym giới hạn) Các phân đoạn ADN cắt giới hạn sau đợc “trộn” với loại véctơ phù hợp (trớc đợc cắt loại enzym giới hạn) ADN ligase Kết bớc tạo tập hợp véctơ mang đoạn ADN cài khác

Ngời ta tạo nhiều th viện gen khác bắt nguồn từ nguồn vật liệu khác Th viện hệ gen đơn giản bắt nguồn từ ADN hệ gen tổng số đợc cắt enzym giới hạn nhất, gọi th viện hệ gen Loại th viện có ý nghĩa ứng dụng rõ rệt nhằm giải mã trình tự hệ gen Ngợc lại, mục đích tìm phân lập phân đoạn mang gen mong muốn, th viện hệ gen tỏ hiệu hệ gen chứa phần tơng đối nhỏ vùng không mã hóa Đối với hệ gen phức tạp hơn, th viện hệ gen khơng phù hợp cho việc tìm phân đoạn mang gen mong muốn phần lớn dòng th viện mang đoạn cài thuộc vùng khơng mã hóa

Oligo dT

Reverse transcriptase dNTP

Loại ARN

Mồi ngẫu nhiên ADN polymerase dNTP

Nối vào plasmit nhờ enzym giới hạn vµ ADN ligase

Th viƯn cADN

mAR N

ARN ADN

ADN

Để có đợc th viện gen mang hầu hết đoạn cài vùng mã hóa, ngời ta sử dụng th viện cADN Các bớc thiết lập th viện cADN đợc minh họa hình 10 Theo đó, bớc thay ADN, ngời ta phiên mã ngợc trình tự mARN thành trình tự ADN phiên (cADN) Quá trình đợc gọi trình phiên mã ngợc đợc thực nhờ enzym ADN polymerase đặc biệt reverse transcriptase Enzym có khả tổng hợp ADN bắt nguồn từ phân tử ARN mạch đơn làm khn ban đầu Khi có mặt enzym reverse transcriptase, trình tự mARN đợc phiên mã ngợc thành phân tử ADN sợi kép, phân tử đợc gắn vào véctơ

Để phân lập đợc đoạn cài riêng rẽ từ th viện hệ gen, tế bào E coli đợc tiến hành biến nạp với tất phân đoạn th viện Mỗi tế bào biến nạp thờng mang véctơ mang đoạn cài ADN Vì vậy, tế bào nhân lên sau chúng sẽ tạo nhiều dòng tế bào, dòng chứa nhiều phân đoạn th viện cADN Khuẩn lạc đợc tạo từ tế bào mang trình tự ADN mong muốn đợc phân lập từ thu lại ADN Có số cách để xác định dòng tế bào mang gen biến nạp Chẳng hạn phơng pháp đợc nêu dới sử dụng mẫu dò ARN và/hoặc ADN để xác định quần thể tế bào mang đoạn ADN định

Sử dụng lai mẫu dị để xác định dòng tế bào th viện gen

Trong phơng pháp sử dụng mẫu dò, ngời ta sử dụng đoạn trình tự ADN/ARN có trình tự bổ trợ đợc đánh dấu lai với dòng tế bào mang đoạn gen cài khác th viện hệ gen Kỹ thuật đợc gọi phơng pháp lai khuẩn lạc Một th viện hệ gen điển hình thờng chứa hàng ngàn đoạn cài khác đợc mang loại véctơ tách dòng Sau véctơ đợc biến nạp vào chủng vi khuẩn phù hợp, tế bào vi khuẩn đợc cấy bề mặt đĩa petri chứa môi trờng bắn rắn chứa agar Mỗi tế bào sau phát triển lên thành khuẩn lạc riêng rẽ, tế bào khuẩn lạc mang loại véctơ đoạn gen cài giống

Trong kỹ thuật lai khuẩn lạc, ngời ta sử dụng loại màng lai đợc dùng phơng pháp thẩm tách Southern Northern để thu hồi đợc lợng “vết” ADN đủ cho kết cặp với mẫu dò đây, ngời ta dùng màng lai ép lên bề mặt đĩa ni cấy chứa khuẩn lạc in hình chúng lên màng lai (cùng với ADN chúng) cho vị trí dịng tế bào màng lai tơng ứng với vị trí khuẩn lạc chúng đĩa petri (theo nguyên tắc “đóng dấu”) Điều đảm bảo cho việc xác định đợc vị trí màng lai có kết “dơng tính” việc bắt cặp với mẫu dị xác định đợc tơng ứng khuẩn lạc mang dòng tế bào chứa véctơ tái tổ hợp mang đoạn gen cài mong muốn

Màng lai đợc đem lai với mẫu dò nh sau: ngời ta tiến hành xử lý màng lai cho màng tế bào vỡ phân tử ADN ngồi gắn lên màng lai vị trí tế bào chúng Các màng lai sau đợc ủ với mẫu dò đợc đánh dấu từ trớc điều kiện giống nh tiến hành kỹ thuật thẩm tách Northern hay Southern

Trong công nghệ ADN tái tổ hợp, ngồi véctơ plasmit có nguồn gốc vi khuẩn, ngời ta cịn sử dụng véctơ có nguồn gốc virut (bacteriophage), từ sinh vật bậc cao nh nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC), hay nhiễm sắc thể nhân tạo có nguồn gốc vi khuẩn (BAC), số véctơ lai chúng (vd: cosmid, …) Trong véctơ có nguồn gốc bacteriophage, phage  đợc sử dụng phổ biến ADN virut đợc cải biến sử dụng nh véctơ tách dòng Véctơ đợc sử dụng để tách dòng th viện hệ gen nguyên tắc giống hệt nh sử dụng véctơ plasmit Chỉ có điểm khác lai tiến hành lai để xác định dịng gen biến nạp vị trí mẫu dị đợc xác định màng lai tơng ứng với vị trí vết tan thay cho vị trí khuẩn lạc nh sử dụng véctơ tách dòng plasmit

V.1.5 Tổng hợp hóa học sử dụng đoạn oligonucleotit

Các đoạn ADN có trình tự xác định kích thớc ngắn đợc sử dụng nhiều nghiên cứu khác di truyền học phân tử, chẳng hạn nh sử dụng làm mồi phản ứng PCR, hay dùng làm mẫu dò phơng pháp lai phân tử Các đoạn trình tự thờng đợc tổng hợp theo phơng pháp hóa học đợc gọi đoạn oligonucleotit Phơng pháp hóa học đợc sử dụng phổ biến đợc tiến hành bề mặt cứng sử dụng máy tự động Tiền chất để tạo nên nucleotit lần lợt gắn với đoạn oligonucleotit theo trật tự định đợc gọi hợp chất phosphoamidine (xem minh họa hình 11) Phản ứng kéo dài chuỗi oligonucleotit diễn việc gắn thêm tiền chất nucleotit vào phía đầu 5’, nh ngợc chiều với phản ứng kéo dài chuỗi ADN sử dụng enzym ADN polymerase

Phơng pháp tổng hợp hóa học có hiệu độ xác cao tiến hành tổng hợp phân tử ADN mạch đơn có độ dài tới 30 nucleotit Với thiết bị tổng hợp oligonucleotit nay, ngời nghiên cứu dễ dàng tổng hợp trình tự ADN ngắn đơn giản cách gõ nhập trình tự nucleotit mong muốn vào phần mềm máy tính điều khiển máy tổng hợp tự động Tuy Hình 10 Các b ớc xây dựng th viện cADN

H×nh 11 Phosphoramidite gắn thêm H+ Đầu 5-OH bị khóa DMT

Nhãm 5’-OH bÞ khãa bëi dimethoxytrityl

vậy, phân tử ADN đợc tổng hợp có kích thớc lớn độ xác trình tự độ đồng sản phẩm tạo thành giảm lỗi cố hữu mang tính kỹ thuật Thực tế, phân tử ADN có trình tự dài 100 nucleotit khó đợc tổng hợp phơng pháp hóa học mà đảm bảo đợc số lợng chất lợng mong muốn

Các đoạn oligonucleotit kích thớc ngắn ngồi ứng dụng làm mồi phản ứng PCR hay làm mẫu dò nh đợc nêu trên, cịn đợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nghiên cứu di truyền học phân tử Chẳng hạn nh đoạn oligonucleotit kết cặp sai với đoạn ADN đợc tách dịng đợc dùng để tạo đột biến định vị trí Phơng pháp này, gọi phơng pháp gây đột biến định vị trí, đợc thực nh sau: trình tự nucleotit định đợc tiến hành lai với phân đoạn ADN, đoạn oligonucleotit đợc sử dụng làm mồi cịn phân đoạn ADN đích đợc dùng làm khn Trong đoạn ADN sợi kép hình thành có vị trí kết cặp sai, theo nguyên tắc PCR, phân đoạn ADN đợc tạo phản ứng sau mang đột biến vị trí kết cặp sai

Các đoạn oligonucleotit đợc sử dụng theo cách tơng tự nh để tạo nên điểm cắt giới hạn phân tử ADN, để sau điểm cắt giới hạn đ ợc sử dụng để cài đoạn ADN đích vào trình tự mã hóa trình tự khơng mã hóa, sau trình tự promoter hay vị trí gắn ribosom, v.v…

Nh vậy, rõ ràng nghiên cứu di truyền học phân tử, việc đoạn oligonucleotit đợc tổng hợp theo trình tự có nhiều ý nghĩa ứng dụng quan trọng việc xác định khuếch đại đoạn ADN đặc hiệu, để giải mã trình tự ADN, nh nghiên cứu tạo đột biến điểm xác định vị trí, hay sử dụng cho công nghệ ADN tái tổ hợp

V.1.6 Ph¶n øng PCR

Ngồi kỹ thuật tách dòng khuếch đại gen sử dụng loại tế bào chủ, phơng pháp khuếch đại gen có hiệu cao trở thành kỹ thuật phổ biến hầu hết nghiên cứu di truyền học phân tử kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR

(polymerase chain reaction) Đây kỹ thuật hóa sinh invitro túy Kỹ thuật PCR sử dụng enzym ADN polymerase để tổng hợp nên phân tử ADN từ trình tự phân tử ADN làm khuôn với tiền chất deoxyribonucleotit Nh nêu Chơng 2, enzym ADN polymerase tổng hợp ADN theo chiều 5’ 3’ xúc tác gắn nucleotit vào phía đầu 3’ trình tự oligonucleotit có sẵn Nghĩa là, ta có đoạn trình tự oligonucleotit gắn vào mạch ADN làm khn có trình tự bổ sung với trình tự đoạn oligonucleotit, enzym ADN polymerase sử dụng đoạn oligonucleotit làm đoạn mồi tiếp tục kéo dài chuỗi ADN phía đầu 3’ dựa trình tự mạch ADN làm khn

Vậy, cách ngời ta sử dụng phản ứng PCR enzym ADN polymerase để khuếch đại đoạn trình tự ADN đặc hiệu? Ngời ta tổng hợp sử dụng hai đoạn oligonuleotit Đoạn thứ có trình tự bổ sung với đầu 5’ mạch phân đoạn ADN cần khuếch đại (đoạn gọi mồi xi), cịn đoạn trình tự thứ hai bổ sung với đầu 5’ mạch đối diện (mồi ngợc) Phân tử ADN làm khn đợc làm biến tính (bởi nhiệt) mồi xuôi môi ngợc gắn vào trình tự bổ sung hai đầu đoạn ADN cần khuếch đại Với có mặt chất deoxyribonucleotit, enzym ADN polymerase tổng hợp kéo dài mạch phân tử ADN hai đoạn mồi

Trong chu kỳ tiếp theo, phân tử ADN lại đợc gây biến tính trình tổng hợp ADN đợc lặp lại với cặp mồi Kết chu kỳ thứ hai tạo phân đoạn gen mong muốn Theo chế đó, chu kỳ biến tính tổng hợp ADN diễn lặp lặp lại làm khuếch đại phân đoạn ADN nằm trình tự mồi theo cấp số nhân (số tơng ứng qua chu kỳ lần lợt 2, 4, 8, 16, 32, 64, v.v…) Nh vậy, cần từ ADN có mặt lợng mẫu nhỏ, thu đợc lợng lớn xuất phát từ

Xét khía cạnh đó, kỹ thuật tách dòng ADN PCR đợc dùng để khuếch đại phân đoạn ADN đặc thù lên số lợng lớn Nhng điểm khác biệt chỗ, kỹ thuật tách dòng, thờng sử dụng hóa chất chọn lọc hay thiết bị để định vị đợc trình tự ADN đợc khuếch đại th viện ADN có sẵn gồm nhiều dòng tế bào khác nhau, kỹ thuật PCR, hóa chất chọn lọc cặp mồi giúp hạn chế phản ứng khuếch đại tập trung vào đoạn ADN đợc quan tâm từ u

V.1.7 Giải mà trình tự ADN

Trong phần xem xét cách xác định đợc trình tự nucleotit phân đoạn toàn phân tử ADN mong muốn Về khía cạnh đó, coi giải mã trình tự nucleotit việc đánh dấu mẫu dị triệt để hệ gen với tính chọn lọc cao Chúng ta xác định toàn trình tự hệ gen thể sinh vật có mức độ cấu tạo phức tạp khác từ vi khuẩn loài ngời, điều cho phép tìm thấy trình tự đặc hiệu cách nhanh xác thơng qua việc sử dụng phần mềm máy tính với thuật tốn phù hợp Hay nói cách khác, “các chất chọn lọc” chuỗi bazơ nitơ đợc nhập vào phần mềm máy tính Do sở liệu hệ gen ngày trở nên phong phú, nên ngày trở nên dễ dàng để tìm thấy

các trình tự hệ gen trình tự có liên quan loài loài khác Rõ ràng, việc giải mã trình tự nucleotit tạo sở liệu khổng lồ phục vụ cho nghiên cứu giải mã trình tự so sánh hệ gen đợc đề cập d-ới

Nguyên tắc giải mã trình tự ADN dựa việc phân tách phân đoạn ADN có kích thớc khác đợc giới hạn hai đầu Các phân tử ADN giống phần đầu 5’, nhng kết thúc phía đầu 3’ có nucleotit khác Các thành viên nhóm có nucleotit phía đầu 3’ giống Nh vậy, nhóm bao gồm tất phân tử ADN tận đầu 3’ G, nhóm khác tơng ứng A, C T Trong nhóm phân tử có kích thớc khác phụ thuộc vào vị trí nucleotit tơng ứng (ví dụ nh G) nằm phân tử ADN Các phân đoạn khác biệt chiều dài nh phân tách đợc nhờ sử dụng kỹ thuật điện di gel polyacrylamid Chẳng hạn chạy hỗn hợp phân tử ADN tận đầu G ta thu đợc thang băng điện di tơng ứng với phân đoạn, băng tơng ứng với phân đoạn có chiều dài phản ánh vị trí nucleotit G phân tử ADN…

Giải mã trình tự hệ gen vi khuẩn kỹ thuật shotgun ( giải mã đoạn ngẫu nhiên )“ ” Vi khuẩn gây bệnh kiết lị ngời Hemophilus influenza loài sinh vật đợc giải mã toàn hệ gen Sở dĩ hệ gen loài đợc hoàn thành việc giải mã nhờ hệ gen nhỏ, chứa phân tử ADN kích thớc 1,8 Mb Hệ gen vi khuẩn đợc “cắt” thành phân đoạn nhỏ có kích thớc trung bình khoảng kb Các đoạn ADN hệ gen sau đợc tách dịng véctơ ADN plasmit tái tổ hợp ADN từ dòng vi khuẩn chứa phân đoạn ADN tái tổ hợp riêng rẽ đợc giải mã trình tự riêng rẽ máy giải mã trình tự tự động sử dụng phơng pháp ddNTP nh mô tả phần Phơng pháp đợc gọi phơng pháp giải mã trình tự kiểu “shotgun” (bắn ngẫu nhiên) Các khuẩn lạc mang véctơ tơ tái tổ hợp mang đoạn ADN cài ngẫu nhiên đợc phân lập, xử lý giải mã trình tự Để chắn nucleotit hệ gen vi khuẩn có mặt dịng vi khuẩn th viện hệ gen, tổng cộng có khoảng 30.000 - 40.000 dòng tái tổ hợp khác đợc sử dụng giải mã trình tự Từ đó, tạo khoảng 20 Mb liệu thô hệ gen (các phản ứng tạo trình tự có kích thớc trung bình 600 bp, 20 Mb = 600 bp x 33.000 dòng vi khuẩn) Dữ liệu đợc gọi vùng trình tự 10x Bởi vì, nucleotit hệ gen đợc đọc lặp lại khoảng 10 lần

Phơng pháp dờng nh tốn nhiều công sức, nhng chi phí rẻ nhanh so với phơng pháp truyền thống khác Một phơng pháp giải mã trình tự trớc dựa nguyên tắc giải mã phân đoạn ADN cắt giới hạn đồ vật lý nhiễm sắc thể vi khuẩn Một hạn chế kỹ thuật hầu hết phân đoạn cắt giới hạn có kích thớc lớn kích thớc giải mã trình tự hồn tồn phản ứng đợc thực Do vậy, để giải mã toàn hệ gen, ngời ta phải tiến hành cắt giới hạn, lập đồ giải mã trình tự nhiều lần Các bớc lặp lặp lại nhiều lần tồn nhiều thời gian sử dụng phơng pháp giải mã trình tự tự động phân đoạn ADN ngẫu nhiên Hay nói cách khác, nhờ sử dụng phần mềm máy tính việc xếp lại phân đoạn ADN ngẫu nhiên nhanh nhiều việc lập đồ phân đoạn cắt giới hạn NST vi khuẩn

Khoảng 30.000 đoạn trình tự ADN đợc giải mã trình tự ngẫu nhiên đợc trực tiếp nhập vào phần mềm máy tính Nhiều phần mềm máy tính chun dụng xếp đoạn trình tự theo thứ tự dựa trình tự gối lên chúng Sự “lắp ráp” thành trình tự phân đoạn ADN ngắn cuối có trình tự liên tục nhất, đợc gọi contig

Kỹ thuật giải mã trình tự kiểu shotgun cho phép ráp nối phần hệ gen lớn“ ” Nh trình bày việc giải mã đoạn trình tự ADN kích thớc khoảng 600 bp thực cách tơng đối đơn giản nhanh chóng đây, xem cách kỹ thuật “shortgun” đợc áp dụng để giải mã trình tự hệ gen lớn

Chẳng hạn, nhiễm sắc thể ngời có kích thớc trung bình khoảng 150Mb Do vậy, đoạn trình tự ~600 bp đợc giải mã chiếm 0,0004% NST Kết để xác định đợc trình tự đầy đủ NST, ngời ta cần tạo số lợng lớn liệu trình tự từ nhiều phân đoạn ADN ngắn (hình 12) Các phân đoạn ADN nhỏ đợc tạo từ 23 NST hệ gen ngời, sau đợc cắt ngắn thành th viện đoạn ADN nhỏ kỹ thuật “kim áp lực” Thơng thờng, có th viện hệ gen chứa đoạn trình tự có kích thớc khác (tăng dần) đợc tạo ra, chẳng hạn tơng ứng với đoạn trình tự có kích thớc 1, 100 kb Các phân đoạn sau đợc tách dòng ngẫu nhiên vào plasmit vi khuẩn theo phơng pháp đợc mô tả

kích thớc trung bình NST Nh trình bày với kỹ thuật giải mã trình tự vi khuẩn, việc phân tích mẫu với lợng trình tự gấp khoảng 10 lần lợng ADN thực cần giải mã trình tự đảm bảo phần NST đợc phân tích

Q trình tạo th viện tái tổ hợp mang trình tự ngẫu nhiên lợng lớn ADN cần phải giải mã trình tự ngẫu nhiên dờng nh việc làm lãng phí Tuy vậy, với việc sử dụng hệ thống trăm máy giải mã trình tự tự động gồm 384 cột cho phép phân tích 10 lần nhiễm sắc thể ngời chi tiết vịng tuần Phơng pháp nhanh nhiều phơng pháp phân lập phần biết NST, sau giải mã trình tự tập hợp biết đoạn ADN đợc đặt so le Vì vậy, chất cơng nghệ cốt lõi đ-ợc sử dụng để thúc đẩy việc giải mã hệ gen ngời dựa kĩ thuật giải mã trình tự ngẫu nhiên tự động, sau sử dụng phần mềm máy tính để xếp lại đoạn ADN khác giống nh trị chơi “ghép hình” Việc kết hợp sử dụng máy giải mã trình tự tự động với phần mềm máy tính giúp dự án giải mã toàn hệ gen ngời kết thúc sớm nhiều năm so với kế hoạch ban đầu

Các chơng trình máy tính phức tạp đợc sử dụng để tập hợp đoạn ADN ngắn đợc giải mã trình tự ngẫu nhiên thành đoạn trình tự dài kích thớc lớn đợc gọi contig Các đoạn trình tự nằm gối lên đợc phần mềm xử lý nối lại với thành trình tự lớn Kích thớc đoạn contig phụ thuộc vào lợng trình tự đợc giải mã Nếu lợng trình tự giải mã nhiều, đoạn contig có kích thớc lớn khoảng cách trống cha đợc giải mã nhỏ

Thơng thờng đoạn contig riêng rẽ thờng có kích thớc 50.000 - 200.000 bp Nghĩa ngắn nhiều so với kích thớc NST ngời Tuy vậy, đoạn contig hiệu phân tích hệ gen nhỏ Chẳng hạn, hệ gen ruồi dấm (Drosophila) trung bình có mật độ gen / 10 kb Vì vậy, contig điển hình thờng chứa vài gen liên kết với Rất tiếc hệ gen lớn lại thờng chứa mật độ gen thấp Hệ gen ngời có mật độ trung bình gen / 100 kb, contig điển hình thờng khơng chứa đợc trình tự trọn vẹn gen, cha nói đến dãy gen liên kết Bây giờ, nói đến cách đoạn contig t ơng đối ngắn đợc lắp ráp lại thành đoạn khung có kích thớc 1-2Mb

Phơng pháp giải mà trình tự đầu cuối cho phép lắp ráp contig thành đoạn khung ë c¸c hƯ gen kÝch thíc lín

Một khó khăn lớn gặp phải thiết lập đoạn contig xuất đoạn ADN lặp lại Các đoạn trình tự làm việc ráp nối trở nên khó khăn phức tạp đoạn ADN khơng liên kết (từ NST khác nhau) nhng bị xếp thành đoạn trình tự nằm gối lên chúng có trình tự lặp lại Một phơng pháp đợc sử dụng để khắc phục trở ngại kĩ thuật giải mã phần nối trình tự đầu cuối Kỹ thuật tơng đối đơn giản nhng hiệu mà mang lại cao

Ngồi việc ADN hệ gen đợc dùng để tạo nên th viện đoạn ADN ngắn nhằm giải mã trình tự ngẫu nhiên, ADN hệ gen đồng thời đợc dùng để tạo nên đoạn ADN tái tổ hợp mang đoạn có kích thớc lớn, thờng có kích thớc - 100 kb Giả sử có mẫu ADN từ NST ngời Một phần mẫu đợc dùng để tạo nên phân đoạn có kích thớc kb, phần khác đợc dùng để tạo nên phân đoạn có kích thớc kb Kết q trình ngời ta thu đợc th viện hệ gen khác nhau, mang đoạn cài kích thớc ngắn, cịn th viện đoạn cài kích thớc lớn (hình 12)

TiÕp theo, ngêi ta sư dụng đoạn mồi đa (có tính chọn lọc thấp) gắn vào phần đoạn nối plasmit hai vùng biên đoạn ADN cài kích thớc lớn Mỗi phản ứng giải mà trình tự cho phép tạo thông tin trình tự đoạn kích th ớc khoảng 600 bp hai đầu đoạn cài Một ghi nhớ ghi chép lại trình tự hai

HÖ gen ng êi

Th viÖn plasmid 1kb

Th viÖn plasmid 5kb

Th viÖn BAC 100kb

Các trình tự bao phủ lần hệ gen

Các trình tự bao phủ lần hệ gen

Các trình tự bao phủ lần hệ gen

15x106 dòng plasmid

7,5x106 dòng plasmid

2,5x106 dòng BAC

Ráp nối thành trình tự liên tục NST

đầu phân đoạn kích thớc lớn Việc dùng phần mềm sau cho thấy trình tự đợc tìm thấy contig A, cịn trình tự đợc tìm thấy contig B Nếu contig A B có trình tự có mặt phân đoạn kích thớc khoảng kb giả thiết chúng xuất xứ từ vùng NST Trong hầu hết phân đoạn ADN lặp lại thờng có kích thớc nhỏ 2-3 kb Vì vậy, đoạn trình tự ADN đầu cuối xuất xứ từ đoạn cài ~5kb đủ để nối contig bị ngắt quãng đoạn ADN có trình tự lặp lại

Các nghiên cứu ban đầu thờng tạo đoạn contig có kích thớc nhỏ 500 kb Để thu đợc liệu từ đoạn có trình tự dài, có kích thớc vài Mb dài hơn, ngời ta cần liệu từ trình tự đầu cuối từ phân đoạn ADN lớn có kích thớc 100 kb Các đoạn ADN thu đợc từ véctơ tách dòng đặc biệt gọi nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn - BAC (bacterial artificial chromosome) Nguyên tắc đoạn đợc dùng để tạo nên thơng tin trình tự dài giống nh trờng hợp sử dụng đoạn kb đợc mô tả Các đoạn mồi đợc dùng để xác định trình tự ~600kb hai đầu đoạn cài BAC Việc sử dụng BAC cho phép xếp nhiều đoạn contig khác vào đoạn khung có kích thớc lớn tới vài Mb (hình 13)

Chất lợng việc ráp nối hệ gen phép đo kích thớc đoạn khung trung bình Những đoạn khung có kích thớc từ Mb trở lên đợc tìm thấy đợc xem có kết ráp nối tốt Ví dụ nh, lồi cá bể dẹt (Tetraodontidae) có kích thớc hệ gen 800 Mb, trình tự ráp nối tồn hệ gen gồm 500 đoạn khung khác nhau, nh đoạn khung có kích thớc

trung bình 1,6 Mb Một “hiệu quả” ráp nối cao nh tạo thuận lợi cho nhiều phân tích di truyền khác, chẳng hạn nh dễ dàng xác định đợc tất vùng mã hóa hệ gen Đến năm 2000, kích thớc trung bình đoạn khung đợc xây dựng cho hệ gen ngời có kích thớc Mb Điều đủ để tin cậy số gen ớc lợng có hệ gen (xấp xỉ 30.000 gen)

Ph©n tÝch më réng hƯ gen

Đối với hệ gen nhỏ nh vi khuẩn hay loài sinh vật nhân chuẩn đơn giản, việc xác định trình tự mã hóa protein thờng ngoại suy trực tiếp từ kết giải mã trình tự, mà thực chất thơng qua việc xác định ORF Mặc dù tất ORF (đặc biệt ORF ngắn) thực gen mã hóa protein, việc xác định nh thờng hiệu quả, việc khó khăn thờng việc xác định đợc chức gen sản phẩm (protein)

Việc xác định đợc vùng mã hóa protein hệ gen loài động vật vốn phổ biến chứa cấu trúc exon - intron thực tế phức tạp nhiều Trong trờng hợp này, ngời ta phải sử dụng “một loạt” công cụ tin sinh học để xác định đợc gen thành phần di truyền hệ gen phức tạp Các chơng trình máy tính đợc lập trình để xác định đợc vùng có tiềm mã hóa protein dựa số tiêu chí định, bao gồm xuất ORF đợc chặn vị trí cắt hai đầu gần kề trình tự khởi đầu phiên mã (promoter) Tuy vậy, chơng trình phân tích gen đến cha hồn thiện để khẳng định xác 100% Một tỉ lệ khoảng 3/4 số gen đợc xác định phơng pháp này, nhng có nhiều gen bị bỏ sót; chí chi tiết gen, số trình tự exon bị bỏ sót

Một hạn chế đáng kể các chơng trình tìm gen không xác định đợc đầy đủ promoter Ví dụ nh promoter lõi điển hình động vật đa bào có kích

Hình 13 Các contig đ ợc ráp nối với nhờ đọc trình tự đầu phân đoạn lớn Chẳng hạn, đầu phân đoạn ADN hệ gen ngẫu nhiên kích th ớc 100 kb (contig 1) chứa đoạn trình tự đầu giống với trình tự đầu khác phân đoạn thứ hai (contig 2) Kết phân tích trình tự cho phép ráp nối hai contig vào đoạn khung chung

Các trình tự ADN ngắn

Đọc đoạn trình tự đầu nối Đọc đoạn trình tự đầu nối

Đoạn khung

thc khong 60 bp, chứa trình tự định dạng (motif), nh TATA, INR DPE, motif cần thiết cho gắn vào phức hệ khởi động TFIID phức hệ phiên mã enzym ARN Polymerase II Đáng tiếc trình tự yếu tố khởi đầu phiên mã lõi có mức độ biến đổi lớn Mặc dù phức hệ khởi đầu phiên mã tế bào đủ “thông minh” để xác định đợc trình tự này, đến ngời cha viết đợc chơng trình máy tính cho phép xác định đợc đầy đủ promoter lõi dạng Tất nhiên, nhà sinh tin học tiếp tục hồn thiện chơng trình phần mềm để đến ngày xác định, phân tích đợc tất thuộc tính gen nêu trên, bao gồm yếu tố promoter lõi, ORF, điểm cắt tái tổ hợp gen, v.v… để xác định đợc đầy đủ gen mã hóa protein

Phơng pháp quan trọng để kiểm chứng gen mã hóa protein suy đốn xác định gen bị bỏ sót phần mềm máy tính sử dụng liệu cADN cADN đ ợc tạo theo nguyên tắc phiên mã ngợc từ phân tử mARN hồn thiện, phản ánh trình tự exon thực Các phân tử cADN đợc dùng để tạo sở liệu EST, hay gọi

nhãn xác định trình tự biểu hiện (expressed sequence tag), thực chất đoạn trình tự ngắn đợc trích từ trình tự cADN biết Các trình tự cADN ngẫu nhiên (có thể trình tự đầy đủ hay trình tự phần EST) đợc xác định sử dụng phơng pháp giải mã trình tự ngẫu nhiên đợc đối chiếu với đoạn khung hệ gen Các vùng tơng ứng với EST đợc xác định exon, vùng nằm exon tơng ứng với intron (mặc dù, nguyên tắc cắt intron khác sử dụng exon khơng có mặt cADN hay EST đợc giải mã trình tự) Các thơng tin giải mã trình tự cADN EST giúp tìm đợc liên kết contig, đoạn khung chúng với Chẳng hạn nh giả sử có phân tử cADN đợc phiên mã từ gen kích thớc lớn có chiều dài intron 100 kb Có hai đoạn khung chứa trình tự khác phân tử cADN chung này, nhiều khả chúng vùng liên kết hệ gen biểu đoạn gen

V.1.8 Phân tích so sánh hệ gen

Việc so sánh hệ gen loài động vật khác sở trực tiếp để đánh giá biến đổi cấu trúc gen trình tự chúng xuất q trình tiến hóa Việc so sánh hệ gen nh đồng thời giúp khẳng định chắn vùng gen mã hóa protein hệ gen lồi Ví dụ nh exon gen đồng tiến hóa có mức độ bảo thủ cao nhiều so với intron Việc so sánh hệ gen ngời chuột tìm thấy nhiều exon có tính bảo thủ cao Việc so sánh hệ gen đồng thời giúp xác định trình tự exon ngắn (hay tìm thấy phần đầu 5’ gen vùng promoter lõi) vốn th ờng bị sót xác định phần mềm máy tính

Một khám phá bật phép phân tích so sánh hệ gen việc tìm phổ biến tính bảo thủ liên kết gen NST ngời chuột, bảo thủ tính liên kết gen NST phổ biến Trong nhiều trờng hợp, tính bảo thủ đợc tìm thấy lồi xa q trình tiến hóa, ví dụ nh lồi cá bể dẹt có tổ tiên chung với lồi động vật có vú từ 400 triệu năm trớc Hiện tợng phổ biến bảo thủ tính liên kết nhiều gen cho thấy có nhiều khả gen “láng giềng” dùng chung trình tự điều hịa gen Một điều tra dùng phần mềm máy tính gần tìm thấy đoạn NST có kích thớc 100 - 200 kb ruồi dấm Drosophila có 10 - 20 gen liên kết có hình thức điều hịa biểu giống hệt ruồi dấm có khoảng 500 - 1000 đoạn NST trì liên kết bảo thủ gen liên kết phụ thuộc vào trình tự điều hịa chung vùng NST

Các trình tự mã hóa protein khơng vùng hệ gen đợc giới hạn chức Các trình tự điều hịa (vị trí gắn yếu tố phiên mã yếu tố điều hòa hoạt động gen, nh yếu tố tăng cờng enhancer) thờng có tính bảo thủ cao Các trình tự thờng đợc xác định trình tự khơng mã hóa protein ngắn bảo thủ Ví dụ chơng trình máy tính gọi VISTA (khơng phải hệ điều hành Microsoft) phân tích hệ gen nhiều lồi khác tìm thấy bảo thủ ở tỉ lệ 70% đoạn trình tự phân tích 50 - 75 bp số trình tự ADN có vai trị điều hịa Hai lồi cá bể dẹt chuột có khoảng 10.000 đoạn trình tự khơng mã hóa ngắn giống nhau, chúng trình tự tăng cờng đặc trng mơ Tuy vậy, hai lồi này, đặc biệt chuột, dờng nh có nhiều trình tự điều hịa bị bỏ sót sử dụng phần mềm máy tính để phân tích trình tự gen Ngời ta xác định đ-ợc loài động vật bậc thấp Ciona intestialis có chứa khoảng 20.000 trình tự enhancer, khơng có ngạc nhiên ngời chuột có khoảng 50.000 - 100.000 trình tự enhancer hệ gen

vậy, dờng nh việc phải phối hợp nhiều phơng pháp sinh tin học chơng trình máy tính cần thiết để xác định đợc trình tự ADN điều hịa tồn hệ gen

Cơng cụ phần mềm phân tích hệ gen đợc sử dụng rộng rãi BLAST (basic local alignment tool) Có số cải biến khác chơng trình BLAST, tất chơng trình có đặc điểm chung tìm đợc vùng giống gen mã hoa protein khác Có nhiều cách để tìm liệu từ BLAST Một cách sử dụng cơng cụ tìm kiếm hệ gen hệ gen tất trình tự protein đợc dự đốn trớc gọi “querry sequence” Chẳng hạn nh ví dụ sau: gen eve mã hóa protein điều hịa phiên mã thiết yếu cho phân hóa tế bào phơi Drosophila Protein Eve có 376 axit amin Vùng chức protein nằm axit amin 71 -130 Khi sử dụng trình tự 60 axit amin để tìm kiếm, kết cho thấy hệ gen Drosophila có 75 gen mã hóa chứa trình tự Nh vậy, chơng trình BLAST nhanh chóng xác định đợc loạt gen có chức tơng tự

Một cách khác để khai thác sở liệu BLAST tra cứu theo trình tự nucleotit Chẳng hạn nh thí dụ trên, ngời ta sử dụng tơng ứng trình tự 180 bp mã hóa cho hộp định loại gen (homeobox)

Tóm lại, việc trình tự hệ gen đầy đủ loài khác ngày tăng lên cung cấp sở liệu ngày phong phú đầy đủ cho nghiên cứu hệ gen học so sánh Ngày có nhiều chơng trình máy tính đợc phát triển hồn thiện để khai thác vốn thông tin di truyền ngày đợc tạo đầy đủ qua chơng trình giải mó ADN t ng

V.1 Các kỹ thuật phân tÝch protein

V.1.1 Chuẩn bị dịch chiết tế bào để tinh protein

Việc phân lập tinh đợc loại protein riêng rẽ có ý nghĩa định đến khả tìm hiểu đợc chức chúng Mặc dù số trờng hợp, nghiên cứu chức protein dạng hỗn hợp phức tạp, nhng phần lớn nghiên cứu thờng dẫn đến kết luận “mù mờ” Chẳng hạn nh nghiên cứu hoạt tính enzym ADN polymerase hỗn hợp protein thô (chẳng hạn từ dịch phân giải tế bào), enzym ADN polymerase protein thành phần khác ảnh hởng đến hiệu suất tổng hợp ADN quan sát đợc thực nghiệm Vì vậy, việc tinh protein bớc quan trong trình tìm hiểu chức chúng

Mỗi protein thờng có số đặc tính riêng làm việc tinh chúng thờng có tính đặc thù Điều trái ngợc với ADN, vốn giống cấu trúc thành phần, khác trình tự nucleotit Các bớc tinh loại protein thờng dựa đặc tính đặc thù kích thớc, hình dạng, điện tích nhiều chức chúng

Vật liệu khởi đầu cho hầu hết trình tinh protein từ sinh vật dịch chiết tế bào Khơng giống ADN vốn có tính phục hồi cao điều kiện nhiệt độ sống khác nhau, protein dễ bị biến tính phá hủy sau bị giải phóng khỏi tế bào Vì lý này, hầu hết trình chuẩn bị dịch chiết tinh protein đợc tiến hành nhiệt độ lạnh (4oC) Có số cách chuẩn bị dịch chiết tế bào Các tế bào phân giải sử dụng chất tẩy, lực làm vỡ thành tế bào, xử lý với dung dịch nhợc trơng (làm tế bào trơng lên nớc vào vỡ ra), thay đổi đột ngột áp suất Điểm chung tất phơng pháp làm thành tế bào vỡ protein đợc giải phóng Trong số trờng hợp, tế bào đợc chuyển trạng thái đông lạnh trớc đợc nghiền máy nghiền mẫu phịng thí nghiệm

V.1.2 Sư dơng s¾c ký cét tinh chÕ protein

Phơng pháp chiết xuất tinh protein phổ biến sắc ký cột Trong trờng hợp này, phân đoạn protein đợc cho chạy qua cột nhồi hạt agarose polyacrylamit nhỏ đợc cải biến cho phù hợp Có số phơng án khác việc sử dụng cột tách chiết tinh protein Các quy trình khác đợc thiết lập khác đặc tính khác loại protein mô tả ba phơng pháp Trong hai phơng pháp đầu, protein đợc phân lập dựa vào kích thớc tính tích điện chúng Tóm tắt phơng pháp đợc nêu hình 14

kể phân tử có đặc tính tích điện gần giống đợc phân tách thành phân đoạn khác chúng đợc hồi lu từ cột

Sắc ký lọc gel: Kỹ thuật cho phép phân tách loại protein cở sở đặc điểm khác loại protein hình dạng kích thớc Khác với kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, hạt đợc sử dụng để nhồi cột kỹ thuật khơng mang nhóm tích điện mà thay vào mang lỗ có kích thớc khác Các phân tử protein nhỏ có nhiều khả thâm nhập vào tất lỗ; vậy, thời gian chạy qua cột dài thời gian hồi lu muộn Ngợc lại, phân tử protein kích thớc lớn có thời gian hồi lu (chạy qua tồn cột) sớm

Đối với loại cột, phân đoạn sắc ký đợc thu nồng độ muối khác thời gian hồi lu khác để thu đợc loại protein đợc quan tâm nghiên cứu Các phân đoạn có hoạt tính protein đợc quan tâm cao đợc tích lũy tiến hành tinh bổ sung

Độ tinh sản phẩm protein tăng lên phân đoạn protein đợc chạy qua nhiều cột sắc ký khác Thông thờng cột sắc ký đơn lẻ không đủ để tinh đ-ợc loại phân tử protein mong muốn dù q trình sắc ký đợc lặp lặp lại nhiều lần, thay vào ngời ta thờng phải áp dụng chuỗi bớc kỹ thuật để thu đợc phân đoạn chứa lợng lớn loại protein cần quan tâm nghiên cứu Chẳng hạn nh, dù có nhiều phân tử protein đợc hồi lu dung dịch muối đậm đặc từ cột tích điện dơng (đối với protein tích đợc âm) đợc hồi lu sắc ký lọc gel (đối với protein kích thớc tơng đối nhỏ), kỹ thuật đơn lẻ th-ờng không đủ để thu đợc sản phẩm protein đợc tinh hoàn toàn

V.1.3 Sắc ký lực hỗ trợ trình tinh chế protein

Các đặc tính đặc trng loại protein đợc tận dụng để giúp tinh loại protein tơng ứng đợc thuận tiện hiệu Giả sử, biết loại protein hoạt động liên kết đặc hiệu với ATP, dùng cột sắc ký mang vật liệu gắn kết ATP để phân tách protein Chỉ có protein liên kết với ATP đợc cột giữ lại, cho phép hầu hết loại protein không liên kết với ATP đợc chảy trôi qua cột Kỹ thuật tinh đợc gọi sắc ký lực Có nhiều hợp chất khác đợc sử dụng để gắn kết với cột giúp trình tinh protein dễ dàng hiệu Các hợp chất bao gồm trình tự ADN (để tinh protein liên kết ADN) trí loại protein để tinh loại protein khác đợc biết đợc mong đợi có tơng tác phân tử với loại protein Nh vậy, để bắt đầu tinh loại protein đó, cần phải có hiểu biết loại protein tìm cách khai thác, ứng dụng đặc tính có cho q trình tách chiết tinh

Một dạng phổ biến sắc ký lực sắc ký lực miễn dịch Trong phơng pháp này, ngời ta gắn kháng thể đặc hiệu với protein đích lên vật liệu làm cột sắc ký Trong trờng hợp lý tởng, loại kháng thể liên kết với loại protein cần quan tâm cho phép tất loại protein khác chảy trôi qua cột Loại protein liên kết sau đợc thu hồi

(hồi lu) cách sử dụng dung dịch muối Hình 14 đổi ion (a) sắc ký lọc gel (b).Nguyên tắc sắc ký trao

Protein mang điện d ơng Vật liệu nhồi cột mang điện âm Protein mang điện âm

D ới tác động dung dịch chảy (pha động), protein nhỏ qua khe các hạt nhồi cột (pha tĩnh)

hoặc dung dịch chất tẩy nhẹ chảy qua cột Khó khăn gặp phải ph-ơng pháp liên kết kháng thể protein bền vững đến mức phải gây biến tính protein thu hồi đợc sản phẩm Trong khác với ADN, protein sau biến tính thờng khơng có khả hồi tính, protein thu đợc theo cách nhiều dạng không hoạt động chức giá trị sử dụng nghiên cứu

Để tăng hiệu tinh sạch, protein đợc cải biến Những cải biến bổ sung trình tự axit amin ngắn vào đầu C vào đầu N phân tử protein cần phân tích Những bổ sung này, hay cịn gọi “trình tự đánh dấu” tạo đợc cơng nghệ ADN tái tổ hợp Các trình tự peptit đánh dấu giúp thay đổi thuộc tính phân tử protein mong muốn giúp tinh chế protein dễ dàng Ví dụ nh, số protein ngời ta tiến hành bổ sung chuỗi gồm histidin giúp protein liên kết với Ni2+ gắn cột chặt dễ phân tách hơn, thuộc tính thờng khơng có ở phần lớn loại protein khác Ngoài việc sử dụng epitop đặc hiệu (thờng trình tự peptit có - axit amin đặc hiệu xác định kháng nguyên) đợc gắn vào phân tử protein cần tinh chế Các cải biến cho phép tinh loại protein sở nguyên tắc sắc ký lực miễn dịch sử dụng dị kháng nguyên mang epitop đ ợc bổ sung Điều đặc biệt là, kháng thể epitop thay đổi tính liên kết kháng thể tùy thuộc vào điều kiện khác môi trờng (chẳng hạn, lực tăng khơng có Ca2+, lực giảm có Ca2+) Điều giúp làm giảm ảnh hởng yếu tố gây biến tính khác.

Nguyên tắc sắc ký lực miễn dịch đợc dùng để làm kết tủa nhanh loại protein đặc hiệu (và loại protein liên kết chặt với nó) từ dịch chiết thơ Trong trờng hợp này, phản ứng kết tủa thu đợc kháng thể đợc gắn vào loại hạt đợc sử dụng sắc ký cột Do hạt có kích thớc lớn, nên chúng lắng nhanh xuống đáy ống nghiệm mang theo kháng thể protein liên kết với chúng Kỹthuật đợc gọi kỹ thuật kết tủa miễn dịch, kỹ thuật ngày sử dụng phổ biến để tinh nhanh protein phức hệ protein từ dịch chiết thô Mặc dù sử dụng phơng pháp riêng rẽ, thu đợc sản phẩm protein đợc tinh hoàn toàn, song phơng pháp th-ờng hiệu để xác định loại phân tử protein hợp chất khác (ví dụ nh ADN) có tơng tác với loại protein đích

V.1.4 Ph©n tÝch protein trªn gel polyacrylamid

Các loại protein thờng khơng mang điện tích âm đồng hay có cấu trúc bậc hai đồng Thay vào đó, chúng đợc tạo từ 20 loại axit amin khác nhau, số chúng khơng mang điện tích, số mang điện tích âm, cịn số mang điện tích dơng Ngồi cấu trúc bậc hai, protein hoạt động cịn có cấu trúc bậc ba, bậc bốn điển hình Tuy vậy, protein đợc xử lý với chất tẩy ion hóa mạnh nh SDS (sodium dodecyl sulphat) hợp chất khử, ví dụ nh mercapthoethanol, cấu trúc bậc 2, phân tử protein bị phá vỡ Nghĩa là, sau xử lý với SDS, protein trở thành dạng phân tử polymer khơng có cấu trúc Đồng thời, SDS tạo thành lớp vỏ ion làm phân tử protein trở nên tích điện âm đồng Mecarptoethanol làm giảm liên kết disulphit hình thành tiểu phần cystein Kết là, phân tử ADN ARN đợc gây biến tính SDS mercaptoethanol, phân tách loại phân tử protein điện di chủ yếu khác biệt trọng lợng kích thớc phân tử Sau điện di, phân tử protein đợc nhuộm với thuốc nhuộm liên kết protein nh Coomassie brilliant blue quan sát Khi khơng có SDS, điện di phân tách đợc loại protein, nhng lúc cịn có yếu tố khác loại protein trọng lợng phân tử, tổng điện tích điểm đẳng điện (xem dới õy)

V.1.5 Định tính protein dựa phơng pháp thẩm tách miễn dịch (immunoblotting)

Mc dự cú bn chất khác ADN ARN, việc xác định có mặt loại protein số protein có mẫu sinh học theo nguyên tắc gần giống với phơng pháp thẩm tách (còn gọi lai) Southern Northern (tơng ứng với trờng hợp ADN ARN) Tuy vậy, protein, phơng định tính dựa dựa nguyên tắc miễn dịch đặc thù protein nên đợc gọi phơng pháp thẩm tách miễn dịch (immunoblotting) hay ph-ơng pháp thẩm tách (lai) Western Trong phph-ơng pháp thẩm tách miễn dịch, phân tử protein sau đợc phân tách điện di đợc chuyển gắn lên màng Màng sau đợc ủ dung dịch chứa kháng thể đặc hiệu với loại protein tinh đợc quan tâm nghiên cứu Kháng thể tìm thấy loại protein tơng ứng màng lọc gắn vào Cuối cùng, việc sử dụng phản ứng enzym màu, ngời ta quan sát đợc vị trí kháng thể liên kết màng Nh vậy, tất phơng pháp lai Southern, Northern Western có điểm chung sử dụng hợp chất chọn lọc để quan sát có mặt loại phân tử đặc thù hỗn hợp phức tạp

V.1.6 Giải trình tự trực tiếp protein

nhiều nghiên cứu hệ protein học (proteomics) hệ gen học (genomics) Bởi với việc xác định đợc dù trình tự ngắn axit amin phân tử protein đó, xác định đợc gen mã hóa cho protein sở đối chiếu với khung đọc mở có hệ gen nhiều lồi vốn đợc giải mã hoàn toàn gần nh hoàn toàn nhng nhng cha biết đầy đủ chức nhiều gen

Phơng pháp biến tính Edman phản ứng hóa học tiểu phần axit amin đợc giải phóng lần lợt từ đầu N chuỗi polypeptit Điểm mấu chốt phơng pháp axit amin tận đầu N chuỗi polypeptit đợc cải biến xử lý với

phenylisothyocyanate (PITC) dẫn đến thay đổi gốc -amino Axit amin đợc cải biến sau đợc cắt rời khỏi chuỗi polypeptit xử lý với axit điều kiện khơng làm phá hủy phần cịn lại chuỗi polypeptit Việc xác định trình tự axit amin đợc tiến hành dựa thứ tự hồi lu axit amin đợc cắt khỏi chuỗi kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao HPLC (high performance liquid chromatography), nhờ đặc điểm loại axit amin có thời gian hồi lu đặc trng Mỗi vịng gây biến đổi axit amin cắt khỏi chuỗi polypeptit nh tạo chuỗi polypeptit nhóm -amino Với việc lặp đi, lặp lại phản ứng cắt axit amin cho phép xác định đợc trình tự đầu N chuỗi polypeptit Trong thực tế, chu kỳ gây biến tính nh đợc lặp lặp lại từ - 15 lần để xác định protein Số chu kỳ nh thông thờng đủ để xác định đợc loại protein đặc thù

Phơng pháp giải mã trình tự tự động dựa nguyên lý biến tính Edman phơng pháp hiệu đợc sử dụng rộng rãi Tuy kỹ thuật gặp trở ngại đầu N tận phân tử protein bị cải biến mặt hóa học (ví dụ nh nhóm acetyl formyl), mà tợng vốn xảy tự nhiên điều kiện in vivo, trình tách chiết tinh protein Để khắc phục tợng này, ngời ta sử dụng protease để cắt chuỗi polypeptit phân tích trình tự bên chuỗi

Phơng pháp khối phổ kế tiếp (MS/MS) đợc dùng để xác định vùng trình tự protein khác Khối phổ phơng pháp xác định xác khối lợng các phân tử nhỏ Một cách vắn tắt phơng pháp đợc mô tả nh sau: phân tử cần phân tích đợc cho bay qua thiết bị (trong điều kiện chân không) điều kiện tốc độ di chuyển tơng quan với tỉ số khối lợng / điện tích Trên sở ngời ta đo đợc thời gian bay phân tử xác định đợc khối lợng Đối với phân tử sinh học có kích thớc nhỏ nh chuỗi peptit phân tử protein nhỏ, trọng lợng phân tử xác định xác đến Dalton

Để xác định khối lợng phân tử protein phơng pháp MS/MS, trớc tiên phân tử protein thờng đợc cắt thành đoạn peptit có trình tự ngắn (thờng dới 20 axit amin) nhờ sử dụng enzym đặc hiệu, chẳng hạn nh trypsin Hỗn hợp đoạn peptit sau đợc đa vào phân tích khối phổ chúng phân tách dựa tỉ số khối lợng / điện tích Các đoạn peptit riêng rẽ sau bị bắt giữ phân đoạn thành chuỗi peptit thành phần Khối lợng peptit thành phần đợc xác định phổ khối nh minh họa hình 15 Sự kết hợp liệu khối lợng đoạn peptit thành phần cho biết trình tự rõ ràng phân tử protein ban đầu Cũng giống nh phơng pháp biến tính Edman, việc xác định đợc trình tự của khoảng 15 axit amin đủ để so sánh với trình tự protein đợc luận từ trình tự ADN đợc giải mã

Kỹ thuật MS/MS thực kỹ thuật có tính cách mạng việc xác định giải trình tự protein Trong phơng pháp này, thông thờng cần lợng mẫu nhỏ hết phân tích hỗn hợp nhiều loại protein đồng thời

Hình 15 Phân tích hệ protein học (proteomics) điện di hai chiều khối phổ a) Các protein đ ợc tách chiết từ tế bào phân lập điện di chiều, chiều dựa nguyên tắc hội tụ đẳng điện (IEF), chiều khác biệt khối l ợng phân tử protein sau đ ợc gây biến tính SDS gel polyacrylamid (SDS-PAGE) b) Các protein riêng biệt t ơng ứng với điểm điện di đ ợc phân tách, xử lý cắt enzym trypsin đ a phân tích khối phổ c) phổ khối cho thấy peptit đ ợc phân tách riêng rẽ khác biệt tỉ lệ [khối l ợng / điện tích] chúng, qua cho phép xác định loại protein có mẫu

V.1.7 HÖ protein häc (proteomics)

Việc phát triển kỹ thuật giải mã trình tự ADN, kết hợp với ph ơng pháp tách chiết, tinh phân tích trình tự protein mở đờng cho hình thành chuyên ngành gọi hệ protein học Hệ protein học (proteomics) chuyên ngành nghiên cứu tồn tập hợp protein đợc mơ, tế bào thể tạo điều kiện đặc thù, phân tích mức độ phổ biến protein tơng tác chúng với với phân tử khác (ví dụ nh ADN) trình hoạt động tế bào Nếu nh kỹ thuật phân tích vi dãy phản ứng (microarray) giúp nhận biết đợc biểu gen cở sở phân tích hệ gen, kỹ thuật proteomics cho phép xác định đợc hình ảnh tổng thể toàn vốn protein tế bào, mô thể

Hệ protein học đợc dựa ba phơng pháp bản: điện di hai chiều gel polyacrylamid để tiến hành phân tách protein, khối phổ để xác định khối lợng phân tử định tính protein (hoặc đoạn peptit từ phân tử protein đó), sinh tin học để đối chiếu phân tử protein đoạn peptit với trình tự mã hóa chúng hệ gen Một tế bào riêng lẻ thờng tạo hàng nghìn loại protein khác nhau, việc sử dụng đơn lẻ phơng pháp điện di truyền thống gel polyacrylamid thờng không đủ để phân lập tách biệt protein Vì vậy, nh tên gọi nó, phơng pháp điện di hai chiều cho phép phân tách phân tử protein gel điện di theo hai chiều đợc thực

Trong bớc thứ nhất, phân tử protein đợc phân đoạn dựa điểm đẳng điện chúng (theo nguyên tắc hội tụ đẳng điện) Theo nguyên tắc này, gradient pH đợc tạo từ đầu đến đầu điện di, vị trí pH tơng ứng làm trung hịa điện tích phân tử protein làm phân tử protein tập trung (hội tụ) vị trí Trong bớc thứ hai, phân tử protein điểm hội tụ đợc tiếp tục phân tách sở khối lợng kích thớc chúng di chuyển trờng điện di polyacrylamid đợc gây biến tính SDS nh mơ tả Do phân tử protein đợc đồng thời phân tách dựa hai thuộc tính (điểm đẳng điện trọng lợng phân tử), nên hàng nghìn loại protein khác đợc phân tách khỏi thí nghiệm Sau đợc phân đoạn theo phơng pháp điện di hai chiều, loại protein riêng biệt đợc đa vào phân tích khối phổ để xác định xác khối lợng phân tử Nh nói trên, để tăng hiệu phân tích, thơng thờng protein đợc cắt thành đoạn peptit nhỏ nhờ sử dụng protease thay cho việc phân tích phân tử protein dạng nguyên vẹn có phân tử lợng lớn cấu trúc phức tạp Kỹ thuật phân tích MS/MS cho phép giải trình tự chi tiết đoạn peptit xác định phân tử protein

Cuối liệu trình tự hệ gen hồn chỉnh thể trình tự peptit từ loại protein đợc quan tâm nghiên cứu đợc đa vào phân tích phần mềm sinh tin học để xác định đợc trình tự mã hóa đặc thù hệ gen tơng ứng với loại protein có chức đợc quan tâm nghiên cứu Nh vậy, nghiên cứu hệ gen học (genomics) hệ protein học (proteomics) có mối quan hệ chặt chẽ nghiên cứu di truyền học phân tử