ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN QUỐC ÂN Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khoá học : 2016 - 2020 Thái Nguyên, năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN QUỐC ÂN Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2016 – 2020 Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CÁM ƠN Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo ThS Ngũn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em thời gian thực hiện đề tài Em xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chị kỹ tḥt viên tại phịng thí nghiệm ni cấy mô tế bào thực vật, Khoa CNSH & CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ em trình làm khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn gia đình và bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khún khích, động viên tạo động lực để em hồn thành khóa ḷn Trong q trình làm khóa ḷn khơng tránh khỏi sai sót, em mong nhận được sự đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè để em làm tốt Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Quốc Ân ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) Bảng 3.1 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 21 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau ngày nuôi cấy) .31 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của số môi trường đến khả tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 33 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 35 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 37 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 39 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) .43 Biểu đồ 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 43 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ Hài Hương Lan (sau tuần nuôi cấy) .45 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh về Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tại nhà lưới khoa CNSH&CNTP 10 Hình 4.2 Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 34 Hình 4.3 Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 20 ngày nuôi cấy) 37 Hình 4.4 Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 39 Hình 4.5 Hình ảnh ảnh hưởng của BA và Kinetin kết hợp với TDZ đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 42 Hình 4.6 Hình Hài Hương Lan ảnh hưởng của NAA đến khả rễ hoàn chỉnh (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 44 Hình 4.7 Hình ảnh ảnh hưởng của NAA kết hợp với THT đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 47 iv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau ngày nuôi cấy) .31 Biểu đồ 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của số môi trường đến khả tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) .33 Biểu đồ 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 35 Biểu đồ 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 38 Biểu đồ 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii (sau tuần nuôi cấy) .40 Biểu đồ 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 43 Biểu đồ 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 45 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BA : 6-Benzyladenine CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng H2 O2 : oxi già IUCN : International Union for Conservation of Nature and Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog’s, 1962 MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế ND : Nước dừa TDZ : Thidiazol THT : Than hoạt tính TN : Thí nghiệm WPM : Woody Plant Medium – Lioyd Mc Cown, 1980 vi MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích nghiên cứu .2 1.3 Yêu cầu của đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài .2 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về lan Hài 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc .4 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Hiện trạng lan Hài Việt Nam và phương thức bảo tồn .6 2.2 Giới thiệu về giống Hài Hương lan .9 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố 2.2.2 Hình dạng 10 2.2.3 Các điều kiện bản để nuôi trồng loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 11 2.2.4 Các phương pháp nhân giống vơ tính Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 11 2.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật .12 2.2.6 Môi trường dinh dưỡng 13 2.3 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài thế giới và nước 17 vii 2.3.1 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài thế giới 17 2.3.2 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài nước .18 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 21 3.1.2 Hoá chất sử dụng .21 3.1.3 Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu 21 3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu .22 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.3.1.Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng của Hài Hương Lan .22 3.3.2.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi rường đến khả tái sinh của chồi Hài Hương Lan từ đoạn thân mang chồi ngủ .22 3.3.3.Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ số Cytokinnetin đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan 22 3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả rễ của Hài Hương Lan 23 3.4 Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 23 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24 3.5 Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 27 3.5.1 Thu thập số liệu .27 3.5.2 Các chỉ tiêu theo dõi 28 3.5.3 Phương pháp sử lý số liệu .29 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .30 viii 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng 30 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 32 4.3 Kết qủa nghiên cứu của số Cytokinnetin đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) từ đoạn thân mang mầm ngủ 34 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 34 4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 37 4.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA,Kinetin kết hợp với TDZ đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 39 Kết quả thu được ở bảng 4.5 cho thấy: Giá trị CV (%): 6,7 LSD0.5 đạt 0,63; thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ không tin cậy 95% Cho thấy tất cả cơng thức có bở sung nờng độ BA 2,0 mg/l; Kinetin 1,0 mg/l; TDZ 03,0mg/l vào mơi trường ni cấy có ảnh hưởng tới việc nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 40 4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả rễ của .42 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của Hài Hương Lan 42 4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính (THT) đến khả rễ Hài Hương Lan .45 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 40 Hệ số nhân chồi (%) 1.4 1.3 1.2 0.9 0.8 Hệ số nhân chồi (%) 0.6 0.4 0.4 0.3 0.27 0.2 0,0 1,0 1,5 2,0 3,0 Biểu đồ 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) Kết quả thu được ở bảng 4.5 cho thấy: Giá trị CV (%): 6,7 LSD0.5 đạt 0,63; các thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ không tin cậy 95% Cho thấy tất cả các cơng thức có bở sung nờng độ BA 2,0 mg/l; Kinetin 1,0 mg/l; TDZ 03,0mg/l vào mơi trường ni cấy có ảnh hưởng tới việc nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) Khi bổ sung BA 2,0 mg/l (CT3), Kinetin 1,0 mg/l (CT4) TDZ từ 0,0 đến 3,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy co ảnh hưởng dến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) Các cơng thức có bở sung TDZ đều cho hệ số nhân chồi cao công thức đối chứng không bổ sung TDZ và tăng nờng độ TDZ từ 0,0 đến 3,0 mg/l cho tổng số chồi thu được đã từ CT2 (BA 2,0 mg/l + Kinetin 1,0 mg/l + TDZ 1,0 mg/l) thu được 39 chồi hệ số nhân cao 1.3 lần Tuy nhiên nồng độ từ CT3 (1,5 mg/l) ; CT4 (2,0 mg/l) CT5 (3,0mg/l) có dấu hiệu giảm dần với tổng số chồi thu được CT3 , CT4, CT5 lần lượt 27 chồi, 14 chồi, chồi hệ số nhân chồi 0,9 ; 0,4 ; 0,27 lần 41 Xét chỉ tiêu chất lượng chồi với công thức đối chứng ban đầu CT1 khơng có TDZ cho chất lượng chời thu được xanh nhạt, gầy CT2 (BA 2,0 mg/l + Kinetin 1,0 mg/l + TDZ 1,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được xanh đậm, mập Kết quả thí nghiệm được giải thích sau: TDZ là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích tế bào phân chia hình thành chồi mới Ở công thức đối chứng khơng có TDZ mơi trường ni cấy nên khả tạo chồi thấp các công thức bổ sung TDZ Ở CT2 với nồng độ TDZ 1,0 mg/l có tác dụng kích thích phát triển chời mới nờng độ TDZ thấp nên mẫu chịu tác động kích thích phân chia tế bào của chất này Khi nồng độ TDZ tăng dần từ 1,5 – 3,0 mg/l ứng với CT3, CT4 và CT5 có sự hình thành của nhiều chồi nhỏ chồi này kéo dài hoặc bị biến dạng, nồng độ TDZ càng cao thì hệ số nhân chồi càng giảm dần Kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cs (2005) [32] cho thấy nuôi cấy lan hài P delenatii môi trường MS lỏng bổ sung TDZ 1,0 mg/l, NAA 0,5 mg/l than hoạt tính 1,0 mg/l, sucrose 20 g/l, agar g/l (sau tháng) thu được nhiều chời nhất, có hệ số nhân chời là 52 lần So sánh kết quả nghiên cứu của chúng với kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt thấy kết quả nghiên cứu của hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả Kết quả nghiên cứu của cho hệ số nhân chồi cao là 1,3 lần thấp 17,5 lần so với kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt vì thời gian thí nghiệm ngắn (30 ngày) và mẫu nghiên cứu của là chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tái sinh từ đoạn thân mang chồi ngủ nuôi cấy môi trường MS bán rắn, còn nghiên cứu sử dụng mẫu tái sinh từ gốc chồi lan hài Hồng được gây vết thương nuôi cấy mơi trường lỏng Vậy khn khở thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi cần bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin 1,0 mg/l, TDZ 1,0 mg/l thu được tổng số chồi là 39 với hệ số nhân chồi là 1,3 lần 42 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Xanh nhạt, gầy) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh nhạt, gầy) (Xanh nhạt, gầy) Hình 4.5 Hình ảnh ảnh hưởng của BA và Kinetin kết hợp với TDZ đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) CT1: 0mg/l TDZ ; CT2: 1,0mg/l TDZ ; CT3: 1,5mg/l TDZ ;CT4: 2,0mg/l TDZ ; CT5: 3,0mg/l TDZ 4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả rễ của Bộ rễ là quan quan trọng đối với tất cả các loài thực vật Trong nuôi cấy mô, sau nhân chồi với số lượng lớn, giai đoạn tiếp theo là tạo hoàn chỉnh để đưa ngoài vườn ươm Một được chuyển môi trường tự nhiên cần phải có rễ khỏe mạnh, hồn chỉnh giúp có khả hút nước và dinh dưỡng khoáng tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng phát triển sau Vì vậy, giai đoạn kích thích tạo rễ của chồi là giai đoạn quan trọng thiếu Sau kết thúc giai đoạn nhân nhanh tạo số lượng chồi Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) đồng khỏe mạnh, chồi tạo thành đạt tiêu chuẩn được tách đưa vào mỗi trường kích thích rễ.Chất kích thích sinh trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn thuộc nhóm auxin 4.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của Hài Hương Lan Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng NAA (có dụng kích thích chời tạo rễ) với nồng độ khác (0,5- 2,0mg/l) công thức thí nghiệm để 43 nghiên cứu ảnh hưởng của nờng độ NAA đến khả rễ của Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) Bảng 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ Số mẫu Số mẫu Công Tỷ lệ mẫu NAA nuôi cấy rễ Chất lượng rễ thức rễ (%) (mg/l) (mẫu) (mẫu) CT1(Đ/c) 0,0 30 16,67 Ngắn, nhỏ CT 0,5 30 14 46,67 Ngắn, nhỏ CT 1,0 30 CT 1,5 30 26 22 86,67 78,11 Ngắn, mập Ngắn, mập CT 2,0 30 18 60 7,3 8,7 Ngắn, nhỏ LSD05 CV(%) Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đờ 4.6 Tỷ lệ mẫu rễ (%) 100 86.67 90 81.11 80 70 60 60 46.67 50 Tỷ lệ mẫu rễ (%) 40 30 20 16.67 10 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Biểu đồ 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 44 Từ bảng kết quả 4.6 cho thấy: giá trị CV (%): 8,7 LSD05 đạt 7,3; CT khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% Nờng độ NAA có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành rễ đối với Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) Xét chỉ tiêu nhân nhanh rễ, từ CT2 dến CT5 tương ứng với bổ sung NAA ở các nồng độ 0,5-2,0 mg/l, sau tuần nuôi cấy thì tổng số rễ thu được nhiều với cơng thức đối chứng (5 rễ) Trong thí nghiệm này, sử dụng NAA ở nồng độ 1,0 mg/l (CT3) cho tổng số rễ thu được cao (26 chồi ) với hệ số nhân rễ là 86,67 lần Xét chỉ tiêu chất lượng rễ, CT3 thu được chất lượng rễ tốt nhất, ngắn và mập Kết quả được giả thích sau: NAA có dụng kích thích chời tạo rễ CT đối chứng (CT1) vì khơng bổ sung NAA nên số mẫu tạo rễ không lớn và rễ Nờng độ NAA 1.0 mg/l (CT3) cho nhiều rễ và có số rễ lớn là NAA ở nờng độ này có tác dụng kích thích chời lan rễ mạnh đờng thời tạo điều kiện cho sinh trưởng và phát triển tốt CT2, CT4, CT5, nồng độ NAA lần lượt là 0,5 mg/l, 1,5 mg/l, 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ rễ và số rễ giảm dần, bởi vì NAA ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, chồi yếu nên số lượng rễ hình thành giảm, rễ sinh dài và nhỏ Kết quả nghiên cứu của chúng cho thây bổ sung NAA ở nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ rễ cao đạt 86.6% Vì vậy chúng tơi lựa chọn phương pháp này để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo CT1 (Ngắn, nhỏ) CT2 CT3 CT4 CT5 (Ngắn, nhỏ) (Ngắn ,mập) (Ngắn, mập) (Ngắn, nhỏ) Hình 4.6 Hình Hài Hương Lan ảnh hưởng của NAA đến khả rễ hoàn chỉnh (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) CT1: mg/l NAA; CT2: 0,5 mg/l NAA; CT3: 1.0 mg/l NAA; CT4: 1,5 mg/l NAA; CT5: 2.0 mg/l NAA 45 4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính (THT) đến khả rễ Hài Hương Lan Kết quả được thể hiện ở bảng 4.7 Bảng 4.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ Hài Hương Lan (sau tuần nuôi cấy) Công thức Nồng độ Nồng độ Số mẫu Tổng số Tỷ lệ Số lượng Chất lượng NAA THT nuôi cấy chồi rễ mẫu rễ (rễ) rễ (mg/l) (g/l) (mẫu) (chồi) rễ (lần) CT 0,0 30 27 23,33 Ngắn, mập CT 0,5 30 27 71 90 Dài, mập 1,0 30 21 60 70 Ngắn, mập CT 1,5 30 15 49 50 Dài, nhỏ CT 2,0 30 12 36 40 Dài, nhỏ CT 1.0 LSD05 CV (%) 7,4 9,3 Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đờ 4.7 Tỷ lệ rễ (lần) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 90 70 50 40 Tỷ lệ rễ (lần) 23.33 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Biểu đồ 4.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 46 Từ bảng kết quả 4.7 cho thấy: giá trị CV (%): 9,3 LSD05 đạt 7,4; cơng thức khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% Nờng độ NAA kết hợp THT có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành rễ đối với Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) Xét chỉ tiêu nồng độ THT tăng tỷ lệ rễ tăng, CT2( 0,5g/l) THT cho kết quả cao đạt 90% Khi nồng độ THT tăng lên từ CT3 (1,0g/l) , CT4 (1,5g/l) CT5 (2,0g/l) tỷ lệ rễ giảm xuống lần lượt 70%; 50%; 40% Xét theo tổng số chồi rễ thì CT2 (0,5g/l) THT cho số lượng chồi cao là 27 chồi và được tăng lượng THT lên từ CT3 (1,0 g/l ) ; CT4 ( 1,5 g/l ) ; CT5 (2,0 g/l) thì tổng số chồi rễ giảm dần lần lượt là 21 chồi, 15 chồi 12 chồi Đối với tỷ lệ rễ cao là CT2 (0,5g/l) cho số lượng rễ là 71 rễ tăng lượng THT từ CT3 (1,0 g/l) đến CT5 (2,0 g/l) thì lượng rễ cung giảm xuống từ 60 đến 36 rễ Kết quả cho thấy chất lượng rễ của các cơng thức có bở sung NAA THT cho chất lượng rễ tốt, nhiều rễ, khỏe, dài, mập Tác giả Nguyễn Thị Sơn và cs (2012) nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook (lan Hoàng thảo long nhãn) đã kết luận: Hàm lượng THT phù hợp cho lan Hoàng thảo long nhãn rễ là 1,0 g/l, tỷ lệ rễ đạt 100% sau 30 ngày nuôi cấy , số rễ đạt/cây cao là 5,6 rễ/cây, chiều dai rễ lớn là 2,87cm, hàm lượng THT cao 1,0 g/l chiều cao thấp dần Kết quả nghiên cứu của chúng cho thấy: Hàm lượng THT phù hợp cho Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) rễ là 0,5 g/l, cho tỷ lệ rễ đạt 90% sau tuần nuôi cấy, tổng số rễ nhiều là 71 rễ So với kết quả nghiên cứu của tác giả thấy: Tỷ lệ mẫu rễ của thấp kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Sơn Nguyên nhân là mẫu nuôi cấy, môi trường và điều kiên ni cấy ở hai thí nghiệm là khác Kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng THT thích hợp cho Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) rễ là 0,5 g/l, tởng số rễ là 71 rễ và cho rễ dài, mập 47 Từ kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng THT thích hợp cho Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) rễ là 0,5 g/l, tởng số rễ là 71 rễ và cho rễ dài, mập Than hoạt tính là hợp chất vô thường được sử dụng giai đoạn rễ nuôi cấy mô tế bào thực vật THT có vai trò là tạo điều kiện tối cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật Ngoài ra, THT còn có khả làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thể ở số loài thực vật Để số mẫu ni cấy nhiều rễ với chất lượng rễ tốt, thí nghiệm này chúng tơi sử dụng nờng độ NAA 1,0 mg/l thích hợp cho quá trình rễ kết hợp với THT ở các hàm lượng khác để thử nghiệm khả rễ của Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) CT1 (Ngắn, mập) CT2 (Dài , mập) CT3 CT4 CT5 (Ngắn, mập) (Dài, nhỏ) (Dài,nhỏ) Hình 4.7 Hình ảnh ảnh hưởng của NAA kết hợp với THT đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) CT1: 1,0mg/l NAA + 0,0g/l THT; CT2: 1,0mg/l NAA + 0,5g/lTHT ; CT3: 1,0g/l NAA + 1,0g/l THT;CT4: 1,0mg/l NAA + 1,5g/l THT;CT5: 1,0mg/l NAA + 2,0g/l THT 48 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trong khuôn khổ thí nghiệm nghiên cứu chúng tơi đưa số kết luận nghiên cứu sau: - Xác định được hóa chất khử trùng tốt đối với đoạn thân mang chồi ngủ của Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) dung dịch H2O2 3% thời gian ngâm mẫu 20 phút Với hóa chất khử trùng tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 64,66 % - Xác định được mơi trường thích hợp cho tái sinh chời Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) là môi trường MS+ Đường 30g/l + Agar 5,5g/l + Nước dừa 150 ml/l + Inositol 100mg/l+0,5g/l THT, pH 5,6 – 5,8; cho tỷ lệ tái sinh đạt 63,33% - Xác định được hàm lượng 2,0 mg/l BA; 1,0 mg/l Kinetin; 1,0 mg/l TDZ tốt cho nhân nhanh chồi Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) nền môi trường MS + Đường 30g/l + Nước dừa 150ml/l + Agar 5,5 g/l +Inositol 100 mg/l +0,5g/l THT, pH 5,6-5,8, hệ số nhân chồi đạt 1,3 lần - Xác định được nồng độ NAA 1,0 mg/l ; THT 0,5 g/l thích hợp cho giai đoạn rễ tỷ lệ đạt 90% rễ có chất lượng tốt, môi trường MS + Đường 30g/l + Nước dừa 150ml/l + Agar 5,5 g/l +Inositol 100 mg/l+0,5g/l THT , pH 5,6-5,8 5.2 Kiến nghị - Nghiên cứu điều kiện ngoại cảnh (ẩm độ, nhiệt độ, dinh dưỡng) đến sinh trưởng phát triển Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) giai đoạn vườn ươm để hồnh thiện cơng nghệ nhân giống in vitro đối với lồi lan hài q có giá trị - Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của số chất kích thích sinh trưởng khác đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) - Nghiên cứu thêm nồng độ của BA > 2mg/l đến khả nhân nhanh Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) - Cần nghiên cứu bảo tờn phát triển lồi lan hài của Việt Nam 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tiếng việt Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2008), Lan Hài Việt Nam, Nxb Giao thơng Vận tải TP Hờ Chí Minh Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài quý P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2010 - tập 8, số 2, tr 194-201, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (2002), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều hoà sinh trưởng thục vật, Nxb Giáo dục Việt Nam Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014), “Ảnh hưởng của chất bổ sung hữu lên quá trình sinh trưởng phát triển của chồi lan Vân Hài (Paphiopedilum callosum) ni cấy intro”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập 52 (số 1), trang 49 – 62 Mai Xuân Lương (2005), Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Đại học Đà Lạt 10 Nguyễn Thị Tuyết Mai (2011), “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) Vân Hài (Paphiopedilum callosum) phương pháp chiếu xạ”, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM 11.Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ 11 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp 12 Hoàng Thị Sản (2002), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục 50 13 Trương Thị Đẹp (2017), Thực vật dược, NXB Y học, Hà Nội 14 Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010), Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan Hài quý P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Phát triển, số 2, tr 194-201 15 Võ Văn Chi (2017), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, NXB Giáo Dục 16 Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014), “Ảnh hưởng của chất bổ sung hữu lên quá trình sinh trưởng phát triển của chồi lan Vân Hài (Paphiopedilum callosum) ni cấy intro”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 52 (số 1), trang 49 – 62 17 Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hờ Chí Minh Vũ Văn Vụ, Ngũn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009), Công nghệ sinh học tập – Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo dục 18 Nguyễn Thị Tuyết Mai (2011), “ Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) Vân Hài (Paphiopedilum callosum) phương pháp chiếu xạ”, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM II.Tiếng anh 19 Nhut D T, Thuy D T T., Don N T., Luan V Q., Hai N T., Tran Thanh Van K., Chinnappa C C (2007), “In vitro stem elongation of Paphiopedilum delenatiii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture”, Propagation of Ornamental Plants 7, p 29-36 20 Nhut D T, Thuy D T T., Luan V Q., Don N T., Khiem D V., Tran Thanh Van K (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & BioSystem Engineering, p 184-190 21 Nhut D T., Trang P T T., Vu N H., Thuy D T T., Khiem D V., Binh N V., Tran Thanh Van K (2005), “A wounding method and liquid culture in 51 Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants 5(3), p.156-161 22 Nhut D T, Thuy D T T., Don N T., Luan V Q., Hai N T., Tran Thanh Van K., Chinnappa C C (2007), “In vitro stem elongation of Paphiopedilum delenatiii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture”, Propagation of Ornamental Plants 7, p 29-36 23 Nhut D T, Thuy D T T., Luan V Q., Don N T., Khiem D V., Tran Thanh Van K (2005), “Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & BioSystem Engineering, p 184-190 24 Nhut D T., Trang P T T., Vu N H., Thuy D T T., Khiem D V., Binh N V., Tran Thanh Van K (2005), “A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants 5(3), p.156-161 PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bảng 1: Thành phần bản môi trường MS (Muashige & Skoog) Stock Bottle Component Solution (g/l) NH4NO3 I II III V take preparation (ml) 20 Final concentratic (mg/l) 1.650,0 KNO3 95 MgSO4.7H2O 37 MnSO4.4H2O 2,23 ZnSO4.7H2O 1,058 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 1.900,0 370,0 10 10,6 0,083 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 17 170,0 H3BO4 0,62 Na2MoO4.2H2O 0,025 FeSO4.7H2O 2,784 Na2EDTA.2H2O 3,724 10 22,3 KI KH2PO4 IV 82,5 Amount to 10 0,83 6,2 0,25 10 27,85 37,25 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 30.0000,0 Agar 5.500,0 pH 5,6 - 5,8 Bảng 2: Thành phần bản môi trường WPM (Woody Plant Medium Lioyd Mc Cown, 1980) Muối khoáng Vi lượng Đa lượng Các chất hữa Nồng độ (mg/l) CuSO4.5H2O 0.25 Na2EDTA.2H2O 37.2 H3BO3 6.20 MnSO4.H2O 22.30 FeSO4.7H2O 27.8 ZnSO4.7H2O 8.6 CaCl2.2H2O 96 Ca(NO3)2.4H2O 556 KH2PO4 170 K2SO4 990 MgSO4.7H2O 370 NH4NO3 400 NaMoO4.2H2O 0.25 Myo – inositol 100 Pyridoxine HCl 0.5 Glycine 2.0 Nicotinic acid 0.5 Thiamine HCl 1.0 Agar Đường 30 Bảng 3: Thành phần bản mơi trường B5 (Gamborg cs, 1976) Muối khống (NH4)2SO4 134 CaCl2.2H2O 150 MgSO4.7H2O 246 KNO3 Đa lượng MnSO4.2H2O Các chất hữu 2.258 10 KI 0.75 Na2MoO4.2H2O 0.25 Na2H2PO4.2H2O 150 ZnSO4.7H2O 2.0 Na2EDTA.2H2O 37.2 H3BO3 Vi lượng Nồng dộ (mg/l) CoCl2.6H2O 0.025 CuSO4.5H2O 0.025 FeSO4.7H2O 27.8 Myo- inositol 100 Nicotinic acid Pyrodoxine HCl Thiamine 10 Đường 30 ... “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO? ?? KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh... loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) phương pháp in vitro? ?? 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống Hài Hương Lan từ đoạn thân non mang chồi ngủ phương. .. 0,5mg/l Kinetin; CT4: 1,0 mg/l Kinetin; CT5: 2,0 mg/l Kinetin 4.3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng của BA,Kinetin kết hợp với TDZ đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii)