ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN QUỐC ÂN Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHI[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN QUỐC ÂN Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khoá học : 2016 - 2020 Thái Nguyên, năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN QUỐC ÂN Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2016 – 2020 Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CÁM ƠN Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo ThS Ngũn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em thời gian thực hiện đề tài Em xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chị kỹ tḥt viên tại phịng thí nghiệm ni cấy mô tế bào thực vật, Khoa CNSH & CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ em trình làm khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn gia đình và bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khún khích, động viên tạo động lực để em hồn thành khóa ḷn Trong q trình làm khóa ḷn khơng tránh khỏi sai sót, em mong nhận được sự đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè để em làm tốt Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Quốc Ân ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) Bảng 3.1 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 21 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau ngày nuôi cấy) .31 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của số môi trường đến khả tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 33 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 35 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 37 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 39 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) .43 Biểu đồ 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 43 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ Hài Hương Lan (sau tuần nuôi cấy) .45 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh về Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tại nhà lưới khoa CNSH&CNTP 10 Hình 4.2 Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 34 Hình 4.3 Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 20 ngày nuôi cấy) 37 Hình 4.4 Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 39 Hình 4.5 Hình ảnh ảnh hưởng của BA và Kinetin kết hợp với TDZ đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 42 Hình 4.6 Hình Hài Hương Lan ảnh hưởng của NAA đến khả rễ hoàn chỉnh (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 44 Hình 4.7 Hình ảnh ảnh hưởng của NAA kết hợp với THT đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 47 iv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau ngày nuôi cấy) .31 Biểu đồ 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của số môi trường đến khả tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) .33 Biểu đồ 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 35 Biểu đồ 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 38 Biểu đồ 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii (sau tuần nuôi cấy) .40 Biểu đồ 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 43 Biểu đồ 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau tuần nuôi cấy) 45 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BA : 6-Benzyladenine CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng H2 O2 : oxi già IUCN : International Union for Conservation of Nature and Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog’s, 1962 MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế ND : Nước dừa TDZ : Thidiazol THT : Than hoạt tính TN : Thí nghiệm WPM : Woody Plant Medium – Lioyd Mc Cown, 1980 vi MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích nghiên cứu .2 1.3 Yêu cầu của đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài .2 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về lan Hài 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc .4 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Hiện trạng lan Hài Việt Nam và phương thức bảo tồn .6 2.2 Giới thiệu về giống Hài Hương lan .9 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố 2.2.2 Hình dạng 10 2.2.3 Các điều kiện bản để nuôi trồng loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 11 2.2.4 Các phương pháp nhân giống vơ tính Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 11 2.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật .12 2.2.6 Môi trường dinh dưỡng 13 2.3 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài thế giới và nước 17 vii 2.3.1 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài thế giới 17 2.3.2 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài nước .18 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 21 3.1.2 Hoá chất sử dụng .21 3.1.3 Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu 21 3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu .22 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.3.1.Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng của Hài Hương Lan .22 3.3.2.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi rường đến khả tái sinh của chồi Hài Hương Lan từ đoạn thân mang chồi ngủ .22 3.3.3.Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ số Cytokinnetin đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan 22 3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả rễ của Hài Hương Lan 23 3.4 Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 23 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24 3.5 Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 27 3.5.1 Thu thập số liệu .27 3.5.2 Các chỉ tiêu theo dõi 28 3.5.3 Phương pháp sử lý số liệu .29 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .30 viii 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng 30 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 32 4.3 Kết qủa nghiên cứu của số Cytokinnetin đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) từ đoạn thân mang mầm ngủ 34 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 34 4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 37 4.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA,Kinetin kết hợp với TDZ đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 39 Kết quả thu được ở bảng 4.5 cho thấy: Giá trị CV (%): 6,7 LSD0.5 đạt 0,63; thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ không tin cậy 95% Cho thấy tất cả cơng thức có bở sung nờng độ BA 2,0 mg/l; Kinetin 1,0 mg/l; TDZ 03,0mg/l vào mơi trường ni cấy có ảnh hưởng tới việc nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 40 4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả rễ của .42 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của Hài Hương Lan 42 4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính (THT) đến khả rễ Hài Hương Lan .45 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Họ Lan, hay họ Phong lan, (danh pháp khoa học: Orchidaceae) họ thực vật có hoa, thuộc Măng tây (Asparagales), lớp thực vật mầm Họ Orchideceae họ lớn của thực vật có thành viên mọc tồn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực; có hoa lan sống dưới mặt đất chỉ nở hoa mặt đất có hoa lan sống tại vùng cao ngun của dãy núi Himalaya; hoa lan tìm thấy tại vùng có khí hậu nhiệt đới rừng già của Brasil đến vùng có tuyết phủ mùa đơng tại bình ngun của Manitoba, Canada Các loài lan chủ yếu mọc cao, sống biểu sinh lâu năm Chúng được gọi chung phong lan Bên cạnh có các loài mọc đất, tức là địa lan có số loài mọc đá tức thạch lan Họ Orchidaceae phân bở rộng khắp thế giới, gần có mặt mọi môi trường sống, ngoại trừ sa mạc và sơng băng Phần lớn các loài được tìm thấy khu vực nhiệt đới, chủ yếu châu Á, Nam Mỹ Trung Mỹ Chúng được tìm thấy tại các vĩ độ cao vòng Bắc cực, ở miền nam Patagonia thậm chí đảo Macquarie, gần với châu Nam Cực Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) có khu phân bố hẹp tại số nơi Thái Nguyên và Vĩnh Phúc với số lượng cá thể ít, vách núi dựng đứng lồi làm cảnh q hoa có màu sắc đẹp dịu dàng với cấu tạo mơi có hạt độc đáo, cánh hoa hình bầu dục rộng - gần trịn, ở gốc có lơng dài chấm tía, mép bên uốn vào trong; môi màu vàng hay da cam nhạt, gân hình cầu với chấm to trắng đục hạt ngọc lại hiếm có giá trị thẩm mỹ cao nên được thế giới ưa chuộng dẫn đến tình trạng thu thập xuất khẩu hài hương lan khiến chúng đứng bờ vực của sự tuyệt chủng thiên nhiên việc thu mẫu ờ ạt nhằm mục đích thương mại Hiện nay, quá trình phát triển kinh tế xã hội, nhiều loài lan quý hiếm bị đe doạ tuyệt chủng Trong phải kể đến hài Hương Lan là các loài lan Hài quý của Việt Nam bị đe doạ nghiêm trọng Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) nhân giống đã trở nên phổ biến Nuôi cấy in vitro tạo giống trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao hệ số nhân lớn thời gian ngắn Bởi vậy, phương pháp nhân giống hài vơ tính in vitro Hài Hương Lan.đã và mở triển vọng tốt cho việc bảo tồn các loài thực vật quý hiếm và phát triển các giống lan quy hiếm này Xuất phát từ thực tiễn chúng tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) phương pháp in vitro” 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống Hài Hương Lan từ đoạn thân non mang chồi ngủ phương pháp in vitro 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng - Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả tái sinh chồi Hài Hương Lan - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ số Cytokiinine đến khả nhân nhanh Hài Hương Lan - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả rễ Hài Hương Lan 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau 3 - Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các liệu khoa học mới về nhân giống Hài Hương lan phương pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật, góp phần làm phong phú sở liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) phương phán nuôi cấy in vitro, tạo số lượng giống hài Hương Lan góp phần bảo tờn giống hoa q hiếm trước nguy tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học 4 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan lan Hài 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1 Phân loại Lan Hài (Paphiopedium) nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc Lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp chời (Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta) Lan Hài nhóm đặc trưng họ lan Chúng dễ dàng nhận bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với cánh hoa hình túi sâu trơng giống chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp của hoa, tạo nên vẻ ngoài đặc sắc dễ dàng phân biệt với loại lan khác Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông, Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1],[13] 2.1.1.2 Ng̀n gớc Chi Paphiopedilum có ng̀n gốc từ vùng lục địa Đơng Nam Á, có Việt Nam Các loài nguyên thuỷ của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, mỡi loại chi này đều có khu phân bố hạn chế Hầu tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong) Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa bản dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay nhị đực tồn tại hoa Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tơng Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại hoa [1],[13] 2.1.2 Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có hình dạng bên ngoài đa dạng nhiên chúng đều mang đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đơi có dạng thân bò Tất cả các loài đều có thân rễ đa số ngắn [1] - Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thn và mở rộng Mỡi lá có đốt ở gốc, dưới là bẹ hình chữ V xếp lợp xít lên thân Độ dài của lá từ 3- 50 cm Mặt của lá có màu xanh lá hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nởi rõ Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1] - Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong Một số loài có cuống hoa nằm ngang, số loài lại có cuống hoa chúc xuống, hầu hầu các loài đều có cuống hoa dựng đứng Phần lớn các loài chỉ có hoa riêng lẻ Tuy nhiên có loài có cụm hoa mang hai hoa, xong hiếm Trục cụm hoa có lơng tơ dầy và ngắn hay có lơng nhung hoặc nhẵn Lá hoa của cụm hoa gấp đơi và có hình dạng khác tùy lồi, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục trịn Lá hoa thường có lơng tơ các phần khác của cụm hoa nói chung thường có lơng ở mép lông cứng gần ở mặt ngoài lá, ở số loài có lá hoa nhẵn - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, lá đài lưng, lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp và hướng xuống phía dưới Lá đài hợp nằm phía sau của mơi thường có màu tối xỉn và nổi bật so với lá đài lưng Cả hai lá đều thường có lơng tơ dày ở mặt ngoài [1] Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường xoè xuống dưới theo chiều ngang Chúng có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh Cánh hoa thứ ba biến dạng rõ rệt thành môi giống cái bao hoặc hình chiếc hài Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lơng ở mặt và nhẵn ở mặt ngoài Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ Hai nhị đực hữu thụ của vòng có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cột Bầu dưới, ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lơng tơ, hình trụ, màu xanh lá hay đỏ tía xỉn [1] - Quả: Dạng quả nang, khơ, dài, có với ba van rộng và ba van hẹp Quả mở ở gần đỉnh rãnh nứt Quả thường chín điều kiên tự nhiên sau thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1] - Hạt: Có hình bầu dục, hình suốt chỉ ngắn dạng thn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm Hạt khơng có nội nhũ khó nảy mầm điều kiện tự nhiên [1] 2.1.3 Hiện trạng lan Hài Việt Nam và phương thức bảo tồn Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao, được sưu tầm và tìm kiếm nhiều Với sự hiện hữu của 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là các quốc gia có ng̀n lan Hài tự nhiên phong phú Không phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng [3] Vì vậy tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài cách ồ ạt, không kiểm soát dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm tự nhiên Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt hiện nay, lan Hài càng biến nhanh chóng 7 Dựa nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1 Bảng Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] Tình trạng Đã bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên Đang bị tuyệt chủng trầm trọng Đang bị tuyệt chủng Sắp bị tuyệt chủng Thiếu dẫn liệu P vietnamense Tên loài (tiếng Việt) Hài Việt P delenatii Hài Đỏ P aspersum P barbigerum var lokianum P callosum P dianthum P emersonii P gratrixianum P hangiannum P helenae P henryanum P herrmannii P malipoense var jackii P malipoense P micranthum P purpuratum P tralienianum P appletonianum P concolor P hirsutissimum var chiwuawnum P hirsutissimum var esquirolai P villosun var annamense P affine P datalanse P villosum var boxalli (Nguồn: Averyanov et al, 2008) Chưa rõ tên gọi Hài Lộc Hài Vân Hài Xoắn Hài Hương Lan Hài Đuôi công Hài Hằng Hài len Hài Henry Hài Herman Hài Jack Hài Giáp Hài Mốc Hờng Hài Tía Hài Trần liên Hài Cánh Sen Hài Gia Định Hài Tiên biến dị Hài Tiên Hài Lông Hài Hoà Chưa rõ tên gọi Chưa rõ tên gọi Tên loài (tiếng Latinh) Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt Nam được chỉ ở bảng đã bị thay đổi nhiều thời gian gần sự suy giảm nhanh các quần thể được biết Trong năm gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện tốc độ phá huỷ mạnh mẽ diện rộng của khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu các đỉnh núi đá vôi [8],[9],[10] Sự thay đổi môi trường sống người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện là nhân tố làm suy giảm nhanh chóng số lượng các loài lan Hài Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam Các loài lan Hài nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều và biến trước tiên sau nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam năm gần là việc thu hái diện rộng của người dân địa phương để bán và xuất khẩu lượng lớn các loài lan Hài mọc tự nhiên nước ngoài Do biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu có nởi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn toàn lãnh thở [1] Nếu khơng có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật phải đối mặt với nguy tuyệt chủng tương lai gần Điều này kéo theo sự tuyệt chủng của số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1] Một mạng lưới rộng khắp khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam Đặc biệt hàng loạt khu bảo tồn đã bảo tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắk Lắk), Núi Bà (Lâm Đờng) bảo tờn lồi P appletonianum 9 - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đờng) bảo tờn lồi P callosum - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tờn Cát Bà (Hải Phịng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) bảo tồn P.dalatensis - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) bảo tờn lồi P dianthum, P.micranthum - Khu bảo tờn Na Hang (Tun Quang) bảo tờn lồi P emersoii, P.hangianum, P malipoense varijackii - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn bảo tờn lồi P.gratrixianum - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) bảo tờn lồi P helanae - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha bảo tờn lồi P malipoense Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài Đầu tiên phải kế đến PGS TS Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng năm 2005 Sau đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác hài Hằng, hài Tam Đảo các phương pháp nuôi cấy mô khác 2.2 Giới thiệu giống Hài Hương lan 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố 2.2.1.1 Nguồn gốc - Sau nhiều nghi ngờ về sự tụt chủng của chúng lồi cuối cùng đã được tìm thấy năm 2000 ở vùng núi đá vôi cao ngất thuộc tỉnh Tuyên Quang Từ lâu, lan này được ghi nhận loài đặc hữu của Trung Quốc Nhưng mãi đầu năm 2001 nhà thực vật học người Nga Averyanov cộng sự đã phát hiện nơi mọc ở phần nhỏ của khu vực núi đá vôi thuộc tỉnh Bắc Cạn phía bắc tỉnh Thái Nguyên 10 2.2.1.2 Phân bớ - Lồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) này được phân bố ở nước ta điển hình tại huyện Võ Nhai - Thái Nguyên, Vĩnh phúc [16] 2.2.2 Hình dạng - Lồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) có lâu năm, có - xếp thành dãy Lá giống P hangianum, chất da, có hình thoi - bầu dục, cỡ 15 - 25 x - cm,mặt màu lục bóng, mặt dưới màu lục nhạt Cụm hoa có cuống dài 10 15 cm, mang hoa Lá bắc hình bầu dục rộng, cỡ 2,8 - x 1,2 - cm, màu trắng Hoa thơm dịu, rộng - 9,5 cm; lá đài và cánh hoa dày, màu trắng, có lơng ngắn ở cả mặt; lá đài ở gần trục hoa hình bầu dục - trứng, cỡ - 4,5 x - cm; lá đài hình bầu dục rộng - gần tròn, cỡ 2,5 - 3,5 x 2,4 - 3,5 cm; cánh hoa hình bầu dục rộng - gần tròn, cỡ - 4,5 x 2,5 - 3,5 cm, ở gốc có lơng dài chấm tía, mép bên uốn vào trong; môi màu vàng hay da cam nhạt, gân hình cầu với chấm to trắng đục hạt ngọc, cỡ 3,5 - 4,5 x - cm, mép vào với mạng gân lõm; nhị lép màu vàng với vệt màu đỏ cam, cỡ 1,6 - x 0,8 - 1,1 cm; bầu dài khoảng cm, có lơng nhung trắng [16] Hình 2.1 Hình ảnh về Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tại nhà lưới khoa CNSH&CNTP ... “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO? ?? KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh... loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) phương pháp in vitro? ?? 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống Hài Hương Lan từ đoạn thân non mang chồi ngủ phương. .. trường dinh dưỡng đến khả tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 32 4.3 Kết qủa nghiên cứu của số Cytokinnetin đến khả nhân nhanh chồi Hài Hương