ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NÔNG THỊ MINH Tên đề tài NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chính quy Ngành Côn[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -o0o NÔNG THỊ MINH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khóa học : 2015 – 2019 Thái Nguyên, 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NÔNG THỊ MINH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 47 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Tiến Dũng Thái Nguyên, 2019 i LỜI CẢM ƠN Được đồng ý Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học công nghệ thực phẩm, thời gian thực tập em tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa Việt Nam” Trong trình thực tập để hồn thành khóa luận ngồi nỗ lực thân em nhận nhiều giúp đỡ nhà trường với dạy tận tình thầy giáo khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Tiến Dũng tận tình bảo, giúp đỡ hướng dẫn em thời gian thực đề tài Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình tạo điều kiện vật chất tốt ln chỗ dựa tinh thần cho em trình học tập; cảm ơn bạn bè giúp đỡ em thời gian vừa qua Mặc dù thân cố gắng thời gian thực đề tài có hạn nên khóa luận khơng thể tránh khỏi thiếu xót, em mong nhận ý kiến đóng góp chân thành từ thầy bạn để đề tài hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Nông Thị Minh ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng NaOCl 3% tới hiệu khử trùng mẫu 23 Bảng 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo số giống lúa (sau 28 ngày) 24 Bảng 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi số giống lúa (sau 28 ngày) 27 Bảng 4.4 Ảnh hưởng Kinetin đến tái sinh chồi số giống lúa Việt Nam (sau 28 ngày) 30 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Q trình phân hóa tế bào Hình 2.1 Tình hình sản xuất diện tích lúa toàn cầu năm 2017 (Nguồn: FAO, 2017) 10 Hình 3.1 Tình hình sản xuất xuất lúa Việt Nam từ 1993 đến 2017 (Nguồn: GAIN, FAS Hoa Kỳ 2017) 13 Hình 4.1 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo số giống lúa (sau 28 ngày) 26 Hình 4.2 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi số giống lúa (sau 28 ngày) 29 Hình 4.3 Ảnh hưởng kinetin đến tái sinh chồi số giống lúa (sau 28 ngày) 31 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BAP: 6-Benzylaminopurine CS: Cộng CT: Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/c : Đối chứng Kinetin :Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS: Murashige&Skoog MT: Môi trường v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Giới thiệu lúa 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.2 Đặc điểm sinh thái học số giống lúa nghiên cứu 2.3 Cơ sở khoa học nhân giống trồng nuôi cấy mô tế bào 2.3.1 Tính tồn tế bào thực vật 2.3.2 Sự phân hóa phản phân hóa 2.4 Một số chất điều hịa sinh trưởng ni cấy mơ tế bào thực vật 2.4.1 Auxin 2.4.2 Cytokinin 2.5 Tình hình nghiên cứu thuộc lính vực đề tài giới nước 10 vi 2.5.1 Tình hình sản xuất lúa giới: 10 2.5.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa giới 12 2.5.3 Tình hình sản xuất lúa Việt Nam 13 2.5.4 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa Việt Nam 14 2.5.4.1 Chọn tạo giống lai hữu tính 14 2.5.4.2 Chọn tạo giống công nghệ tế bào 14 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 17 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.1.2 Hóa chất sử dụng phạm vi nghiên cứu 17 3.1.3 Thiết bị sử dụng 17 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 17 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Nội dung : Nghiên cứu ảnh hưởng NaOCl đến hiệu vô trùng mẫu nuôi cấy 18 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi 19 3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi 20 3.4 Điều kiện bố trí thí nghiệm 20 3.5 Phương pháp theo dõi, đánh giá 21 3.5.2 Các tiêu đánh giá 21 PHẦN 23 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NaOCl đến hiệu vô trùng mẫu nuôi cấy 23 4.2 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo số giống lúa 24 4.3 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi số giống lúa 27 vii 4.4 Ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi số giống lúa Việt Nam 30 PHẦN 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 I Tài liệu tiếng việt 34 II Tài liệu Tiếng Anh 35 PHỤ LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Lúa lương thực phổ biến giới nói chung Việt Nam nói riêng, có lịch sử phát triển lâu đời trồng khắp vùng sinh thái giới Ở nước ta lúa trồng chủ yếu đồng bằng, hai đồng châu thổ sơng Hồng sơng Cửu Long Ngồi ra, lúa trồng thêm số đồng ven biển… việc trồng lúa mang lại thu nhập cao cho nơng dân đóng góp phần khơng nhỏ vào việc phát triển kinh tế chung nước, nâng cao chất lượng sống cho người dân Lúa loại lương thực có giá trị dinh dưỡng cao như: tinh bột, protein, lipit, vitamin,… Chính vậy, lương thực có vai trị quan trọng cho người gia súc Do đó, nghiên cứu lúa quan tâm sâu sắc nhiều nhà nghiên cứu Để đảm bảo an ninh lương thực điều kiện dân số giới tăng nhanh, diện tích đất trồng bị thu hẹp, tượng hạn hán, lũ lụt ngày tăng ảnh hưởng biến đổi khí hậu tồn cầu, địi hỏi phải chọn tạo giống lúa có suất cao, chất lượng tốt, có khả kháng với sâu, bệnh, điều kiện ngoại cảnh Phương pháp chọn tạo giống truyền thống thu nhiều giống có suất cao, sử dụng cách mạng xanh Tuy nhiên, để tạo giống phương pháp truyền thống thường 3-4 năm Do đó, để tạo giống lúa mang tính trạng mong muốn thời gian ngắn hơn, phương pháp truyền thống cần kết hợp với kết thu phương pháp Công nghệ sinh học tạo Việc tạo giống biến đổi di truyền có khả kháng sâu, bệnh côn trùng nhờ kỹ thuật chuyển gen thực vật quan tâm nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao suất tính chống chịu trồng để đem lại lợi ích tối đa cho nông nghiệp Hiệu biến nạp gen lúa phụ thuộc vào nhiều yếu tố: phương pháp biến nạp, giống, mô sử dụng để biến nạp, thành phần mơi trường ni cấy, chất điều hịa sinh trưởng, điều kiện tái sinh [15] Nhiều nghiên cứu giống lúa indica hiệu tạo mô sẹo tái sinh in vitro thấp giống japonica [13] Do đó, để tăng hiệu tạo mô sẹo tái sinh cần thiết tối ưu hóa mơi trường ni cấy cho giống Trên sở ý nghĩa lý luận thực tiễn hướng nghiên cứu này, tiến hành đề tài “ Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa Việt Nam” 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu chất kích thích sinh trưởng để xác định thành phần phù hợp để tái sinh in vitro số giống lúa Việt Nam 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định phương pháp khử trùng cho hiệu vô trùng cao - Xác định ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh, tạo đa chồi 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Xác định phương pháp khử trùng cho hiệu khử trùng số giống lúa Việt Nam - Đánh giá ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng số giống lúa nghiên cứu 3 - Góp phần xây dựng quy trình ni cấy in vitro phù hợp với số giống lúa Việt Nam 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết nghiên cứu đánh giá khả tái sinh in vitro giống lúa có giá trị Việt Nam Qua chọn giống có khả tái sinh cao, phục vụ công tác chọn tạo giống, đặc biệt chuyển gen 4 PHẦN TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Giới thiệu lúa Lúa lương thực cho nhiều người đồng thời lúa gạo tham gia vào hoạt động kinh tế quan trọng giới Châu Á nơi sản xuất 90% tổng sản lượng nơi tiêu thụ lúa gạo nhiều Khoảng 85% sản lượng gạo, 72% lúa mì 19% ngơ người tiêu thụ trực tiếp [20] Lúa gạo cung cấp 21% lượng 15% protein cho loài người [14] Từ 1989 trở lại đây, Việt Nam trở thành nước xuất gạo hàng đầu giới Năm 2001 nước xuất gạo (tính theo triệu tấn), bao gồm: Thái Lan (6,4), Việt Nam (4,0), Trung Quốc (3,0), Mỹ (2,8) (USDA, 2001) 18 năm qua, lúa đặc biệt ĐBSCL đóng góp cho đất nước gần tỷ USD trị giá xuất góp phần to lớn cho cơng đổi Việt Nam có kết Tuy sản xuất với số lượng nhiều, chất lượng giá gạo xuất Việt Nam thường thấp so với số nước Thái Lan, Mỹ, Úc, đặc biệt có chệnh lệch lớn loại gạo đặc sản gạo cao cấp [3] 2.1.1 Vị trí phân loại Lớp: Monocotyledonae Họ: Poaceae Giống: Oryza Loài: Oryza sativa L Lúa O sativa có 2n =24 nhiễm sắc thể, thường phân biệt làm nhóm: - Lúa Indica: thường trồng khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới, có thân cao, dễ đổ ngã, nhiều chồi, xanh cong, kháng nhiều sâu bệnh nhiệt đới Hạt gạo dài trung bình, có nhiều tinh bột suất lúa Japonica - Lúa Japonica: thường trồng vùng ôn đới nơi có độ cao 1000m (trên mặt biển), có thân ngắn, chống đổ ngã, xanh đậm, thẳng đứng, chồi, hạt gạo thường trồn, ngắn trung bình, dẻo nấu chất tinh bột Lúa Japonica có suất cao - Lúa Javanica (bulu) hay lúa Japonica nhiệt đới trồng Indonexia, có đặc tính hai loại lúa Japonica Indica Hình thức gần giống lúa Japonica, có rộng với nhiều lơng chồi Thân cứng, cảm quang Hạt lúa thường có [2] 2.1.2 Nguồn gốc phân bố Cây lúa canh tác từ vĩ tuyến 40° phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 53° bắc bán cầu, trồng từ mặt đất thấp mặt nước biển độ cao 2000m mặt biển Trên giới có 20 lồi lúa hoang loài canh tác Cây lúa canh tác đại trà để cung cấp lương thực cho người giới Oryza sativa L châu Á, có suất cao ưa chuộng Lồi lúa Oryza glaberrima Steud canh tác Tây châu Phi, có suất số thu hoạch thấp O.sativa Các nghiên cứu đất gạch trấu thành phố danh tiếng đổ nát Ấn Độ vùng sông Cửu Long Myanma, Thái lan, Lào, Campuchia Việt Nam phát lúa trồng Đông Dương phát triển theo ngả: từ Lào theo sơng Cửu Long xuống phương nam có đặc tính lúa Japonica nhiệt đới, ngả khác Ấn Độ qua vịnh Bengal đến bờ biển Đông Dương, với đặc tính lúa Indica Vì vậy, Việt Nam với khí hậu nhiệt đới nằm vùng đa dạng sinh thái thảo mộc gồm lúa Indica Japonica nhiệt đới [2] 2.2 Đặc điểm sinh thái học số giống lúa nghiên cứu Giống lúa Bao thai: Nguồn gốc: Vào năm 70, giống lúa Bao thai thức nhập nội vào Việt Nam, giống lúa có nguồn gốc từ Trung Quốc Đặc điểm: Đặc tính giống có tính cảm quang, gieo cấy vụ mùa, thời gian sinh trưởng từ 160 ngày đến 170 ngày Cây cứng đẻ khỏe, cao từ 90 đến 100 cm, dài 19 đến 20 cm, khối lượng 1000 hạt 23 đến 25 gram, vỏ trấu màu sẫm Phẩm chất gạo ngon, đậm cơm khô, cứng Khả chịu lạnh nên thích hợp cấy tỉnh miền núi Trung du phía Bắc Giống lúa Đồn kết: Nguồn giống: Do nông dân tự trữ giống Đặc điểm: Thời gian sinh trưởng 150 đến 160 ngày, suất 37 đến 40 tạ/ha, chiều cao 120 đến 130 cm, dài 25 đến 30 cm Chất lượng gạo ngon trồng chủ yếu tỉnh miền núi phía bắc Giống lúa Khang dân: Nguồn gốc: Là giống lúa Trung Quốc Đặc điểm: Ngắn ngày, vụ Đông Xuân từ 105 đến 110 ngày, vụ Hè Thu khoảng 85 đến 90 ngày Dạng gọn, cứng cây, dạng hạt thon có màu vàng, suất bình qn đạt 60 tạ/ha Khả chống chịu điều kiện ngoại cảnh tương đối tốt, chịu rét tốt, thích ứng rộng Giống lúa Nếp 87: Nguồn gốc: Do Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo 7 Đặc điểm: Gieo trồng hai vụ, vụ mùa vụ xuân Thời gian sinh trưởng vụ xuân từ 135 đến 140 ngày, vụ mùa từ 110 đến 115 ngày Chiều cao từ 100 đến 110 cm, cứng cây, chống đổ, kháng bệnh đạo ôn, khô vằn, bạc lá, đẻ nhánh khỏe, bơng dài Năng suất trung bình đạt 55 đến 60 tạ/ha 2.3 Cơ sở khoa học nhân giống trồng nuôi cấy mô tế bào 2.3.1 Tính tồn tế bào thực vật Ngun lí nhân giống ni cấy mơ tế bào tính tồn tế bào thực vật Mỗi tế bào thể thực vật mang tồn lượng thơng tin di truyền tồn thể Trong điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh Tính tồn tế bào sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay, người ta thực khả tạo thể hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ [11] 2.3.2 Sự phân hóa phản phân hóa Cơ thể thực vật hình thành chỉnh thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, hình thành từ nhiều loại tế bào khác Tuy nhiên tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phơi sinh chưa mang chức riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó, từ tế bào phôi sinh chúng tiếp tục biến đổi thành tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho mơ, quan có chức khác [11] Sự phân hóa tế bào chuyển tế bào phôi sinh thành tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo chức khác Q trình phân hóa tế bào biểu thị: Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hóa có chức riêng biệt Tuy nhiên, tế bào phân hóa thành tế bào có chức chun, chúng khơng hồn tồn khả biến đổi Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng trở dạng tế bào phôi sinh phân chia mạnh mẽ, trình gọi phản phân hóa tế bào, ngược lại với phân hóa tế bào Hình 1.1 Q trình phân hóa tế bào Về chất phân hóa phản phân hóa q trình hoạt hóa, ức chế gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể, có số gen hoạt hóa (mà vốn trước bị ức chế) ta tính trạng mới, cịn số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chương trình mã hóa cấu trúc phân tử DNA tế bào khiến cho trình sinh trưởng phát triển thể thực vật hài hòa Mặt khác, tế bào nằm khối mô thể thường bị ức chế tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào giảm kích thước khối mơ tạo điều kiện cho hoạt hóa gen tế bào [11] 9 2.4 Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.1 Auxin Chất auxin tự nhiên tìm thấy nhiều thực vật indol axetic acid (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào điều khiển hình thành rễ Ngồi IAA, cịn có dẫn xuất naphthalene axetic acid (NAA) 2,4 – Diclophenoxy acid (2,4D) Các dẫn xuất đóng vai trị quan trọng phân chia mơ q trình hình thành rễ NAA có tác dụng hô hấp tế bào mô nuôi cấy, tăng khả tiếp nhận sử dụng đường mơi trường NAA auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trị quan trọng phân chia tế bào tạo rễ [12] 2.4.2 Cytokinin Cytokinin chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp kinetin, – Benzyl aminopurin (BA) Kinetin thực chất dẫn xuất bazơ nitơ adenine BA cytokinin tổng hợp nhân tạo có hạt tính mạnh nhiều kinetin Kinetin BA có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động tế bào phân sinh làm hạn chế già hóa tế bào Ngồi chất có tác dụng lên trình trao đổi chất, trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein làm tăng cường hoạt tính số enzyme Cơ chế tác dụng auxin mức độ phân tử tê bào thể tác dụng tương hỗ cytokinin với nucleoprotein làm yếu mối liên kết histone với AND, tạo điều kiện cho tổng hợp AND [12] 10 2.5 Tình hình nghiên cứu thuộc lính vực đề tài giới nước 2.5.1 Tình hình sản xuất lúa giới: Theo quan FAO Rome, sản xuất lúa giới 2017 tương đối thuận lợi đạt đến 756,7 triệu tấn, 0,2 % vụ 2016, điều kiện khí hậu bất thường xảy nhiều nơi, với diện tích trồng tồn cầu khoảng 163 triệu Hình 2.1 Tình hình sản xuất diện tích lúa tồn cầu năm 2017 (Nguồn: FAO, 2017) Tại Châu Á, sản xuất lúa chiếm gần 75% tổng sản ngạch giới hay đạt đến 684,2 triệu 2017, tăng 1,4 triệu so với mùa kỷ lục 2016 Ở Châu Phi, sản xuất 31,1 triệu tấn, hay 1% 2016 dù gặp hạn hán ngập lụt vài nơi Burkina Faso, Gambia, Niger, Tanzania Madagascar Ở Nam Mỹ Caribbean, sản xuất lúa đạt đến 28,4 triệu tấn, Brazil nước sản xuất lúa lơn vùng, năm 2017 trúng mùa với sản lượng 12,3 triệu tấn, tăng 16% so với 2016 11 Ở Châu Âu, sản xuất 2017 khoảng triệu lúa Hai nước trồng lúa lớn Châu Âu Ý Tây Ban Nha Châu Úc, năm 2017 sản xuất lúa châu lục tăng 195% so với 2016, Sản ngạch lúa thu hoạch đạt đến 809.000 xuất 0,3 triệu gạo ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NÔNG THỊ MINH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào... trình ni cấy in vitro phù hợp với số giống lúa Việt Nam 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết nghiên cứu đánh giá khả tái sinh in vitro giống lúa có giá trị Việt Nam Qua chọn giống có khả tái sinh cao, phục... sở ý nghĩa lý luận thực tiễn hướng nghiên cứu này, tiến hành đề tài “ Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa Việt Nam? ?? 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu chất kích thích sinh trưởng để