Khóa luận tốt nghiệp đại học nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o - ĐỖ NGỌC HÀ Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI TRẦN LIÊN (Paphiopedilum tranlienianum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH – CNTP Khoá học : 2015 – 2020 Giảng viên HD : ThS Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) phương pháp in vitro” Lời khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa ḷn tớt nghiệp này Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo ThS Nguyễn Thị Tình giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em thời gian thực hiện đề tài Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ tḥt viên phịng cấy mơ tế bào thực vật Khoa CNSH-CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn cho em suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và là chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập Trong quá trình thực tập, cũng là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn nên đề tài khơng thể tránh khỏi những sai sót Em mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này ii Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo nhà trường, khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn sinh viên có sức khoẻ, thành cơng c̣c sống Thái Nguyên, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện Đỗ Ngọc Hà iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tờn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) 34 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả tái sinh phôi lan 36 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh phôi Trần liên (sau tuần nuôi cấy) 38 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên 40 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy) 42 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Trần liên (sau tuần nuôi cấy) 45 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Trần liên (sau tuổi nuôi cấy) 47 Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả sinh trưởng phát triển của lan Trần liên 49 iv DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1: Hình ảnh về lan Hài Paphiopedilum tranlienianum 13 Hình 3.1 Quả lan Hài Trần Liên 23 Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên 26 Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên 35 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%) 37 Biểu đồ 4.3 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA 39 Biểu đồ 4.4 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin 41 Biểu đồ 4.5 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin TDZ 43 Biểu đồ 4.6 Tỷ lệ mẫu rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA 45 Biểu đồ 4.7 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với than hoạt tính 47 Biểu đồ 4.8 Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể 49 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B5 : Gamborg cs, 1976 BAP : 6-Benzyl amino purine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation – Hệ số biến động Đ/C : Đối chứng LSD : Least Singnificant DifferenceTest MS : Murashighe Skoog, 1962 MT : Môi trường GA3 : Gibberellic acid NAA : α-Napthalene acetic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế P : Paphiopedilum tranlienuanum tranlienuanum P malipoens : Paphiopedilum malipones WPM : Woody Plant Medium – Lioyd Mc Cown, 1980 vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu của đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về Lan Hài 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Sinh thái 2.1.4 Hiện trạng lan Hài Việt Nam 2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) 11 2.2.1 Nguồn gốc sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) ở Việt Nam 11 2.2.2 Hình Thái 12 2.2.3 Các điều kiện bản để ni trờng lồi lan Hài Trần Liên 13 2.3.4 Tổng quan về môi trường nuôi cấy thành phần dinh dưỡng sử dụng nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên 14 2.4 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài thế giới và nước 19 vii 2.4.1 Trên thế giới 19 2.4.2 Trong nước 21 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 23 3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 23 3.1.2 Hoá chất sử dụng 23 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 24 3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 24 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 24 3.2.3 Thời gian nghiên cứu 25 3.3 Nội dung nghiên cứu 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 25 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giớng 26 3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 31 3.5 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá 31 3.5.1 Thu thập số liệu 31 3.5.2 Các chỉ tiêu theo dõi 31 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng 34 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả tái sinh phôi lan Hài Trần Liên 36 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên 38 viii 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi của lan Hài Trần Liên 38 4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên 40 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả nhân nhanh giống 42 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA than hoạt tính đến khả rễ lan 44 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ của lan 44 4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ của lan hài Trần liên 46 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả sinh trưởng phát triển của lan 48 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Lan Hài là loài hoa đẹp có giá trị thẩm mĩ và kinh tế cao Được người yêu hoa và ngoài nước tìm kiếm, điều này đã dẫn đến hầu hết loài lan hài thế giới cũng của Việt Nam rơi vào mức báo động nguy tuyệt chủng tự nhiên Hài Trần Liên (hài Bắc Thái) một số loài lan hài đặc hữu của Việt Nam, có khu phân bớ hẹp (khu vực Bắc Kạn Thái Nguyên), hiện lan hài Trần Liên được tìm thấy ở khu vực đệm của Hồ Ba Bể - nơi xuất hiện nhiều loài phong lan, địa lan có giá trị thẩm mỹ Hài Trần Liên được nhiều nhà sưu tầm lan quan tâm bởi kiểu dáng độc đáo với điểm nhấn cánh môi của hoa ́n cong giớng hình chiếc hài hai cánh bên lượn sóng, màu đỏ thẫm, hấp dẫn người chơi lan Hài Trần Liên tái sinh phôi nếu kết hợp được với lồi nấm cợng sinh, khả tái sinh tự nhiên thấp, là nguyên nhân thứ khiến lồi hoa có giá trị này được liệt kê vào phụ lục của công ước CITES danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, q hiếm (nhóm 1) của Nghị định sớ 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006 Xuất phát từ thực tiễn em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) phương pháp in vitro” 1.2 Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần liên từ phôi phương pháp in vitro 2 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng - Xác định được ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến khả tái sinh phôi của Hài Trần Liên - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả nhân nhanh Hài Trần Liên - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả rễ Hài Trần Liên - Xác định ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của Hài Trần Liên 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn đề tài * Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố hệ thống lại kiến thức đã học bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau * Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan hài Trần Liên (paphiopedilum tranlienianum) phương phán ni cấy in vitro, góp phần bảo tờn giớng hoa quý hiếm trước nguy tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học 3 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Lan Hài 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1 Phân loại Lan Hài là mợt nhóm khác biệt họ lan Chúng dễ dàng được nhận bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống một chiếc hài nằm ở vị trí thấp của hoa Chiếc môi đặc sắc và hình dạng khác thường của hoa tạo nên vẻ bề ngoài dễ dàng phân biệt lan Hài với các loài lan khác Vì vậy trở thành tên chung của loài lan này Về mặt thực vật học, các loài lan Hài tḥc vào chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae).[1] 2.1.1.2 Ng̀n gớc Chi Paphiopedilum có ng̀n gớc từ vùng lục địa Đơng Nam Á, có Việt Nam Các loài nguyên thuỷ của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và Bắc Việt Nam, mỗi loại chi này đều có khu phân bớ hạn chế Hầu tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong) Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa bản dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay mợt nhị đực tồn tại hoa Trong họ Lan, chi lan Hài (tḥc tơng Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại hoa 2.1.2 Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài đa dạng nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đơi có dạng thân bò Tất cả các loài đều có thân rễ đa sớ ngắn[1] - Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rợng Mỡi lá có đớt ở gớc, dưới là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên thân Đợ dài của lá có thể từ 3- 50 cm Mặt của lá có thể có màu xanh lá hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nởi rõ Mặt dưới lá có các đớm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1] - Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong Một số loài có ćng hoa nằm ngang, mợt sớ loài lại có ćng hoa chúc x́ng, hầu hầu các loài đều có ćng hoa dựng đứng Phần lớn các loài chỉ có mợt hoa riêng lẻ Tuy nhiên cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song hiếm Trục cụm hoa có lơng tơ dầy và ngắn hay có lơng nhung hoặc nhẵn Lá hoa của cụm hoa gấp đơi và có hình dạng khác tùy loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn Lá hoa thường có ít lơng tơ các phần khác của cụm hoa nói chung thường có lơng ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở mợt sớ loài có lá hoa nhẵn.[1] - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp và hướng xuống phía dưới Lá đài hợp nằm phía sau của mơi thường có mợt màu tới xỉn và nởi bật so với lá đài lưng Cả hai lá đều thường có lơng tơ dày ở mặt ngoài[1] Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường xoè xuống dưới theo chiều ngang Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống cái bao hoặc hình chiếc hài Môi dạng túi sâu và phờng lên, hình giầy, có lơng ở mặt và nhẵn ở mặt ngoài.[1] Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ Hai nhị đực hữu thụ của vòng có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lơng tơ, hình trụ, màu xanh lá hay đỏ tía xỉn [1] - Qủa: Dạng quả nang, khơ, dài, có mợt ô với ba van rộng và ba van hẹp Qủa mở ở gần đỉnh rãnh nứt Qủa thường chín điều kiên tự nhiên sau thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1] - Hạt: Có hình bầu dục, hình suốt chỉ ngắn,dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm Hạt khơng có nợi nhũ khó nảy mầm điều kiện tự nhiên [1] - Rễ: Rễ chùm, có mợt lớp mơ xớp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng xớp này có vai trò việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt Sau rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và khơng có các búi nấm xung quanh rễ [1] 2.1.3 Sinh thái Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng Mợt nhóm phân bớ ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m, nhóm còn lại phân bớ ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở đợ cao từ 700-2200m Ngoài ra, có mợt vài cá thể nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit Lan Hài của Việt Nam có thể sống đất, bám đá và phụ sinh mùn Các loài sớng đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán rừng, ở nơi sườn núi dớc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn Các loài lan Hài mọc đá thường mọc dưới bóng của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và bên dưới các đường đỉnh Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám vỏ gỗ các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm đợ cao Tuy nhiên đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi tớt để có thể sớng sót được qua đợt khơ hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hời mùa mưa trở lại Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều ở các hướng của sườn núi Nhưng các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành đám nhỏ Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài khắp các vùng của Việt Nam.[1] 2.1.4 Hiện trạng lan Hài Việt Nam Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng thế giới cũng nước ngày càng gia tăng Vì vậy việc trồng lan đã trở thành một ngành kinh tế của nhiều nước thế giới và nhiều nước phát triển khu vực Đông Nam Á Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được u cḥng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều thế giới Với sự hiện hữu của 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là mợt các q́c gia có ng̀n lan Hài tự nhiên phong phú Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm tự nhiên Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt hiện nay, lan Hài càng biến nhanh chóng[2] Lan Hài lồi tḥc bợ Lan những lồi thực vật bị đe dọa biến trước tiên mơi trường sớng tự nhiên bị suy thối Nền kinh tế phát triển nhanh chóng dẫn đến nhiễm mơi trường với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm nhanh chóng hoạt đợng khai thác làm giảm nơi sống tự nhiên của lan Hài gây nguy tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện [1] Dựa những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1 Bảng 2.1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) Tình trạng Đã bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên Đang bị tuyệt chủng trầm trọng Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (tiếng Việt) P vietnamense Hài Việt p delenatii Hài Đỏ P  aspersum Chưa rõ tên gọi P barbigerum var lokianum Hài Lộc P callosum Hài Vân P dianthum Hài Xoắn P emersonii Hài Hương Lan P gratrixianum Hài Đuôi công Đang bị tuyệt chủng P hangiannum Hài Hằng P helenae Hài len P henryanum Hài Henry P  herrmannii Hài Herman P malipoense var jackii Hài Jack P malipoense Hài Giáp P micranthum Hài Mốc Hồng Tình trạng Tên loài (tiếng Latinh) P purpuratum Tên loài (tiếng Việt) Hìa Tía P tralienianum Hài Trần liên P appletonianum P concolor Sắp bị tuyệt chủng P hirsutissimum var chiwuawnum P hirsutissimum var esquirolai P villosun var annamense Thiếu dẫn liệu Hài Cánh Sen Hài Gia Định Hài Tiên biến dị Hài Tiên Hài Lông P  affine Hài Hoà P  datalanse Chưa rõ tên gọi P villosum var boxalli Chưa rõ tên gọi Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt Nam được chỉ ở bảng đã bị thay đổi nhiều thời gian gần sự suy giảm nhanh các quần thể được biết Trong những năm gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện tốc độ phá huỷ mạnh mẽ diện rợng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu các đỉnh núi đá vôi [12],[13],[14] Sự thay đổi môi trường sống người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng sớ lượng các loài lan Hài Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tớc đợ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam Các loài lan Hài nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều và sẽ biến trước tiên sau nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái 10 Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam những năm gần là việc thu hái diện rộng của người dân địa phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc tự nhiên nước ngoài Do khơng có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu có nởi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn toàn bộ lãnh thổ.[1] Nếu khơng có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy tuyệt chủng tương lai gần Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1] Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã bảo tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm Đờng) bảo tờn lồi P appletonianum - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đờng) bảo tờn lồi P callosum - Vườn Q́c Gia Ba Bể, khu bảo tờn Cát Bà (Hải Phịng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hịa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) bảo tồn P.dalatensis 11 - Vườn Q́c Gia Hồng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) bảo tồn lồi P dianthum, P.micranthum - Khu bảo tờn Na Hang (Tun Quang) bảo tờn lồi P emersoii, P.hangianum, P malipoense varijackii - Vườn q́c gia Tam Đảo, Hồng Liên Sơn bảo tờn lồi P.gratrixianum - Khu bảo tờn Trùng Khánh (Cao Bằng) bảo tờn lồi P helanae - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha bảo tồn lồi P malipoense Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài Đầu tiên phải kế đến PGS TS Dương Tấn Nhựt, người nuôi cấy thành cơng lan hài Hờng năm 2005 Sau đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã ni cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác hài Hằng, hài Tam Đảo các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau, Khoa CNSH – CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bước đầu đã thành công nhân giống phương pháp in vitro một số loài lan Hài như: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen 2.2 Tổng quan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) 2.2.1 Nguồn gốc sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) Việt Nam 2.2.1.1 Nguồn gôc Lan hài Trần liên - Paphiopedilum Tranlienianum là một loài lan hài nhỏ, là dài khoảng 8-15cm màu xanh bóng Loài này có hoa tao nhã với lá đài lưng trắng có sọc tía nâu, cánh hoa tía nâu lượn sóng mạnh ở mép, môi nâu tía và nhị lép vàng tươi Hài Trần Liên là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam, ưa râm mát, nở hoa khoảng tháng 9-12, độ bền của hoa khá dài 25-30 ngày Lan Hài Trần Liên được mô tả chính thống năm 1988 dựa một sống ... tài: ? ?Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) phương pháp in vitro? ?? 1.2 Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần. .. sinh học và Công nghệ thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: ? ?Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) phương pháp in. .. đến khả nhân nhanh chồi của lan Hài Trần Liên 38 4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên