Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in v

Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên ..... Xuất phát từ thực tiễn trên em tiến hành đ

ĐỖ NGỌC HÀ

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI TRẦN LIÊN

(Paphiopedilum tranlienianum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Thái Nguyên, năm 2020

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo ThS Nguyễn Thị Tình giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên trên phòng cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH-CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập

Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn sinh viên có sức khoẻ, thành công trong cuộc sống

Thái Nguyên, ngày tháng năm

Sinh viên thực hiện

Đỗ Ngọc Hà

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo

tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) 8 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của

H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) 34 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng

tái sinh phôi lan 36 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

nhanh phôi Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) 38 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin

đến khả năng nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên 40 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ

đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy) 42 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

cây lan hài Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) 45 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính

đến khả năng ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuổi nuôi cấy) 47 Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng

và phát triển của lan Trần liên 49

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ

Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum 13

Hình 3.1 Quả lan Hài Trần Liên 23

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên 26

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên 35

Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%) 37

Biểu đồ 4.3 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA 39

Biểu đồ 4.4 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin 41

Biểu đồ 4.5 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin và TDZ 43

Biểu đồ 4.6 Tỷ lệ mẫu ra rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA 45

Biểu đồ 4.7 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với than hoạt tính 47

Biểu đồ 4.8 Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể 49

IBA : Indole-3-butyric acid

IUCN : International Union for Conservation of Nature and

Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế

P

tranlienuanum

: Paphiopedilum tranlienuanum

P malipoens : Paphiopedilum malipones

WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

MỤC LỤC vi

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 1

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về Lan Hài 3

2.1.1 Phân loại và nguồn gốc 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 4

2.1.3 Sinh thái 6

2.1.4 Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam 7

2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) 11

2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) ở Việt Nam 11

2.2.2 Hình Thái 12

2.2.3 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài lan Hài Trần Liên 13

2.3.4 Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên 14

2.4 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài trên thế giới và trong nước 19

2.4.1 Trên thế giới 19

2.4.2 Trong nước 21

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 23

3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 23

3.1.2 Hoá chất sử dụng 23

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 24

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 24

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 24

3.2.3 Thời gian nghiên cứu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 25

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống 26

3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 31

3.5 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá 31

3.5.1 Thu thập số liệu 31

3.5.2 Các chỉ tiêu theo dõi 31

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 34

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên 36

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng nhân nhanh cây lan Hài Trần Liên 38

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

chồi của cây lan Hài Trần Liên 38

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên 40

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả năng nhân nhanh giống cây 42

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan 44

4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây lan 44

4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây lan hài Trần liên 46

4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan 48

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

Hài Trần Liên (hài Bắc Thái) là một trong số loài lan hài đặc hữu của Việt Nam, có khu phân bố hẹp (khu vực Bắc Kạn và Thái Nguyên), hiện lan hài Trần Liên được tìm thấy ở khu vực đệm của Hồ Ba Bể - nơi xuất hiện nhiều loài phong lan, địa lan có giá trị thẩm mỹ

Hài Trần Liên được nhiều nhà sưu tầm lan quan tâm bởi kiểu dáng độc đáo với điểm nhấn cánh môi của hoa uốn cong giống hình chiếc hài và hai cánh bên lượn sóng, màu đỏ thẫm, hấp dẫn người chơi lan

Hài Trần Liên tái sinh bằng phôi nếu kết hợp được với loài nấm cộng sinh,

do đó khả năng tái sinh trong tự nhiên thấp, đây là nguyên nhân thứ 2 khiến loài hoa có giá trị này được liệt kê vào phụ lục 1 của công ước CITES và danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006

Xuất phát từ thực tiễn trên em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng

nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro”

1.2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần liên từ

phôi bằng phương pháp in vitro

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng

- Xác định được ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh phôi của cây Hài Trần Liên

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng nhân nhanh Hài Trần Liên

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Trần Liên

- Xác định ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Hài Trần Liên

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

* Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn

- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này

* Ý nghĩa thực tiễn

Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan hài Trần Liên

(paphiopedilum tranlienianum) bằng phương phán nuôi cấy in vitro, góp phần

bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về Lan Hài

2.1.1 Phân loại và nguồn gốc

2.1.1.1 Phân loại

Lan Hài là một nhóm rất khác biệt trong họ lan Chúng dễ dàng được nhận

ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa Chiếc môi đặc sắc và hình dạng khác thường của hoa tạo nên vẻ bề ngoài dễ dàng phân biệt lan Hài với các loài lan khác Vì vậy nó trở thành tên chung của loài lan này

Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là:

- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân

bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc

- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng

25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ

- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á

từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon

Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae).[1]

2.1.1.2 Nguồn gốc

Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó

có Việt Nam Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở

Trung Quốc và Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất

hạn chế

Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong) Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa Trong họ

Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực

còn tồn tại trong hoa

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên

ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái:

- Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn[1]

- Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1]

- Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống hoa dựng đứng Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ Tuy nhiên

cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rất hiếm Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn.[1]

- Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng trong Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài[1]

Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài.[1]

Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1]

- Qủa: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp Qủa mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt Qủa thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]

- Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn,dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm Hạt không

có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1]

- Rễ: Rễ chùm, có một lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt Sau khi rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có các búi nấm xung quanh rễ [1]

2.1.3 Sinh thái

Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng Một nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 700-2200m Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit

Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn Các loài sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn Các loài lan Hài mọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m

Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ

ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài

Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam.[1]

2.1.4 Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam

Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới cũng như trong nước đang ngày càng gia tăng Vì vậy việc trồng lan đã trở thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát triển khu vực Đông Nam Á

Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới Với sự hiện hữu của hơn 20

loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn

lan Hài tự nhiên phong phú nhất Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng[2]

Lan Hài và các loài thuộc bộ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất trước tiên khi môi trường sống tự nhiên bị suy thoái Nền kinh tế phát triển nhanh chóng dẫn đến ô nhiễm môi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm

nhanh chóng do hoạt động khai thác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan Hài gây

ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện nay [1]

Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ

chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN)

Tình trạng (tiếng Latinh) Tên loài (tiếng Việt) Tên loài Đã bị tuyệt chủng

Tình trạng (tiếng Latinh) Tên loài (tiếng Việt) Tên loài

P hirsutissimum var esquirolai

P villosun var annamense

Hài Cánh Sen Hài Gia Định Hài Tiên biến dị Hài Tiên

Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lượng các loài lan Hài Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam Các loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái

Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam trong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên

ra nước ngoài Do không có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ.[1]

Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai gần Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu

Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1]

Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như:

- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà

(Lâm Đồng) bảo tồn loài P appletonianum

- Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang

bảo tồn loài P callosum

- Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo

tồn P.dalatensis

- Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà

Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P dianthum, P.micranthum

- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P emersoii, P.hangianum, P malipoense varijackii

- Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài

P.gratrixianum

- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P helanae

- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong

Nha đang bảo tồn loài P malipoense

Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp

nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài

Đầu tiên phải kế đến PGS TS Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng năm 2005 Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau, Khoa CNSH – CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bước đầu đã thành công nhân giống bằng phương pháp in vitro một số loài lan Hài như: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen

2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum)

2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) ở Việt Nam

2.2.1.1 Nguồn gôc

Lan hài Trần liên - Paphiopedilum Tranlienianum là một loài

lan hài nhỏ, là dài khoảng 8-15cm màu xanh bóng Loài này có hoa tao nhã với lá đài lưng trắng có sọc tía nâu, cánh hoa tía nâu lượn sóng rất mạnh ở mép,

môi nâu tía và nhị lép vàng tươi Hài Trần Liên là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam,

cây ưa râm mát, nở hoa khoảng tháng 9-12, độ bền của hoa khá dài 25-30 ngày Lan Hài Trần Liên được mô tả chính thống năm 1988 dựa trên một cây sống

được nhập khẩu từ Việt Nam và được đặt theo tên người Việt Nam đã xuất khẩu

nó, bà Trần Ngô Liên

2.2.1.2 Phân bố

Lan Hài Trần Liên được phân bố ở việt nam ở các tỉnh : Cao Bằng, Bắc

2.2.2 Hình Thái

- Lan Hài Trần Liên là loài lan đất, cây mọc thành khối Cây mọc trên

tầng đá vôi, lớp lá mục và trên rêu

2.2.2.1 Dạng lá

- Hình dải cỡ 18*1.7 cm, mặt trên màu lục bóng với mép nhạt hơn, mặt dưới màu lục nhạt với nhiều chấm màu tím ở gốc Lá bắc hình trứng, cỡ 1.7-2.5*1.6cm, lông ngắn ở gân giữa và mép tận cùng

2.2.2.2 Dạng hoa

Cụm hoa: có cuống dài 7-15cm, thường mang 1 hoa Hoa : Rộng 5.5-6cm

- Lá đài có lông ngắn ở mặt ngoài, lá đài gắn trục hoa màu trắng.Gân tròn cỡ 3*3-3.5cm.Lá đài kia màu lục nhạt, hình trứng, cỡ 2.5*1.1-1.8cm.Cánh hoa màu tía- nâu với chóp màu lục,hình khuôn,cỡ 3-3.4*0.7-0.9 cm, bóng Mép lượn sóng, có lông trắng,gốc có nhiều lông nâu- tía nhạt Môi màu đỏ- nâu thẫm,cỡ 3.7-3.9*1.6cm,

- Nhị lép, hình trứng ngược, 8-10*7-9 mm, có mủ bóng Bầu dài 3-4 cm, phủ đầy lông ngắn nâu nhạt Bông 5-6cm rộng,6-7cm cao

Rễ chùm, màu nâu, có lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt Sau khi rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có các búi nấm xung quanh rễ.

Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum

2.2.3 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài lan Hài Trần Liên

2.2.3.1 Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng

- Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung, những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến trung bình, ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C Các loài Hài có lá vằn thích hợp với điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban ngày là 21-25°C

- Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ Hầu hết lan Hài

ưa ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ 11.000-22.000 lux Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu lá màu xanh đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng

- Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhất là trong mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bị khô quá nhanh Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các khay sỏi nhẹ với 50% độ ẩm là lý tưởng

2.2.3.2 Nhu cầu bón phân

Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l Tưới nước đậm trước và sau khi bón phân, nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân Sang chậu khi giá thể trồng có dấu hiệu mục nát.[4]

2.2.3.3 Giá thể trồng

Trần liên có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than

củi, xỉ than tổ ong,, sơ dừa, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần trong suốt mùa sinh trưởng của cây lan

2.3.4 Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [5]

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm các thành phần chính sau:

2.3.4.1 Nguồn Cacbon

Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro khôngcón khả năng tự dưỡng do

không tiến hành quang hợp đầy đủ Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Nguồn Cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượng từ 20-30 g/l Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như

fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose, những loại đường này chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt

2.3.4.2 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng

có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu và điện thế màng

- Nguyên tố đa lượng:

Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S [11]

+ Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3 - hoặc NH4+, hầu hết các loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm hữu cơ

+ Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường

+ Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

+ Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O + Magie : Sử dụng chủ yếu là MgSO4

+ Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy

2.3.4.3 Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó Các

vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy

- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid

- Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon

2.3.4.4 Các chất hữu cơ tự nhiên

- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin

- Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid

- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B

- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh…

2.3.4.5 Các thành phần khác

- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu

cơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy

- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic

2.3.4.6 pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0 Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ

2.3.4.7 Các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật Hiệu quả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy

Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng

- Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con

trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau

đó, nhiều nhà khoa họv đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất Auxin gây

ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách) Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì – nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá

Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (các auxin tự nhiên) Hoạt tính bcuat các chất này được xếp theo thứu tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi, NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus

- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX,

chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến zeatin tách

từ nội nhũ của hạt ngô non Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô

Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá.[7]

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp

có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea [7]

- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Giberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Giberellin

có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài

lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [7]

2.4 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài trên thế giới và trong nước

2.4.1 Trên thế giới

Thông thường Paphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt

hay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ Tuy nhiên, các phương pháp này cho hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thị trường Vì vậy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để bảo vệ

lan Hài thoát khỏi nguy cơ tuyệt chủng

Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thực hiện bởi Bubeck năm 1973 Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan Hài bằng nhiều phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây Một số nghiên cứu đã thành công:

Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo, đôi khi có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, các mô sẹo rất khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ chết Vì lý do này, hầu hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô Paphiopedilum đều sử dụng nguồn vật liệu ban đầu từ hạt.[29]

Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con [24]và phương pháp này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứu năm 1983.[28]

Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài cây in vitro, sau đó cảm ứng tạo chồi từ chồi nách của cây in vitro được nuôi cấy kéo dài

Năm 2000, Lin và cs đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của hạt một loài lan Hài lai và đã thu được một vài cây con trong ống nghiệm.[23]

Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hài lai giữa P philippinese và P susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM.[20]

Năm 2002 và 2004, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm ứng tạo chồi từ thân và lá của lan Hài P philippinese khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4D 4,52mM và TDZ 4,5mM.[16][17]

Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công phương pháp nhân

nhanh giống lan Hài P delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảy mầm in vitro Từ cây con in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn

gốc từ hạt, được nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ cao, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước hình thành PLB Một phần mô sẹo có thể tái sinh được 3-7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong 3 năm mà không mất đi khả năng tái sinh [32] Ngoài ra, Dương Tấn Nhựt còn nghiên cứu thành

công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống lan P delenatii là phương pháp gây vết thương trên phần gốc thân của cây con in vitro Phần gốc

sau khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm TDZ, NAA, 2,4D sẽ hình thành mô sẹo và một số ít xuất hiện protocorm

Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống thành công lan Hài Hồng qua các chồi tái sinh từ các đoạn thân của cây non được

nuôi cấy kéo dài in vitro khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5

mg/l, BA 2 mg/l, NAA 0,5 mg/l, than hoạt tính 1 g/l, đường 30 g/l, agar 9 g/l [25]Khi nuôi cấy trong bóng tối sẽ thu được chồi dài, màu vàng, yếu, còn khi nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ có cường độ thấp sẽ thu được chồi có sự giãn cách giữa các lá dọc trên thân cây

Năm 2008, Hong và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây con giống P alma Gavaert khi nuôi cấy trên môi trường MS có Kinetin 4,65mM[18]

Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây

con hoàn chỉnh từ nụ hoa của P deperle và P armeni Tuy nhiên, cần rất nhiều

thời gian để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn các phương pháp khác.[22]

Người ta cũng tiến hành phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những dòng mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm và nuôi cấy mô sẹo từ những loại mô khác của Paphiopedilum

2.4.2 Trong nước

* Về nghiên cứu kỹ thuật trồng và nhân giống lan Hài

Lan Hài đỏ (Hài hồng - P.delenatii) của Phân Viện Sinh học Đà Lạt được nhân giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật Sau nhiều lần thử nghiệm nhân giống, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân viện sinh học Đà Lạt đã áp dụng phương pháp mới trong nhân giống hoa lan Hài đỏ Các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ sung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeotin hoặc 1,5mgTDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất Khi dùnhg phương pháp này, khả năng tạo chồi rất nhanh,,mặt khác cũng tìm được điều kiện sinh thái cho lan Hài nở hoa Qua đây, người ta cũng chứng minh rằng lan Hài đỏ cũng có thể sản xuất vô tính

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007), đã nhân giống được loài lan

Hài đỏ- một loài Lan đặc hữu của Việt Nam (Paphiopedilum delenatii) bằng

kỹ thuật gây vết thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường

MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sang trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất diều tiết sinh trưởng khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ xung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất.[25]

Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2017) đã thành công trong nhân nhanh cây lan

Hài gấm (P concolor) từ phôi trên môi trường MS cải tiến có bổ sung BA 2mg/l

và TDZ 1,0mg/l Cho hệ số nhân chồi đạt 2,9 lần

Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài giáp

P malipoense trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và NAA 0,3mg/l cho hệ số nhân chồi 3,28 lần

Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài Xuân

Cảnh Paphiopedilum Canhii) trong môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ

2mg/l + Kinetine 1mg/l + TDZ 1mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,93 lần

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Loài Hài Trần Liên (Paphiopedilum

tranlienianum) khỏe mạnh, sạch bệnh lưu giữ tại nhà lưới khoa CNSH - CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm

- Vật liệu nghiên cứu:

+ Phôi lan Hài Trần Liên 8 tháng tuổi sau khi thụ phấn tại Khoa CNSH – CNTP

+ Một số chất kích thích sinh trưởng

Hình 3.1 Quả lan Hài Trần Liên

3.1.2 Hoá chất sử dụng

- Hoá chất khử trùng: cồn 70°, Ôxy già (H2O2)

- Môi trường MS, B5, WPM, đường sacharose, agar,

- Một số chất kích thích sinh trưởng ở thực vật thuộc nhóm auxin(NAA, ), nhóm cytokinin (BA,.Kinitine, TDZ)

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Bảng 3.1 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Nồi hấp vô trùng Bình tam giác

Hệ thống giàn đèn Chun nịt

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu

+ Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu quả trong dung dịch

H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng

+ Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh phôi cây Hài Trần Liên từ quả

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ cây Hài Trần Liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Hài Trần Liên

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm

3.2.3 Thời gian nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 12/2019 – tháng 7/2020

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh phôi Hài Trần liên từ quả

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine đến khả năng nhân nhanh của lan Hài Trần liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Trần liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Trần liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA,Kinetine, TDZ đến khả năng nhân nhanh của chồi lan Hài Trần Liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính (THT) đến khả năng ra rễ của cây lan Trần Liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây lan hài

Trần Liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây lan hài Trần Liên

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát

triển của lan Hài Trần Liên giai đoạn vườn ươm

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

- Sử dụng môi trường MS, B5, WPM bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l, nước dừa 150ml/l, Inositol 100mg/l, pH: 5,6-5,8

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm

- Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1,0 atm trong 20 phút

- Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 22oC – 25oC, độ ẩm: 60 – 65% quang chu kì 14h sáng 10h tối

Tiến hành theo dõi mẫu

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên

Quả

Khử trùng (cồn 70º,xà phòng,H2O2)

Nhân nhanh chồi Tái sinh phôi

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Vườn ươm