Nghiên cứu góp phần xây dựng quy trình chiết xuất hỗn hợp saponin flavonoid sf từ khô dầu hạt camellia SP theaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU GĨP PHẦN XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT HỖN HỢP SAPONIN, FLAVONOID (S F ) TỪ KHÔ DẦU HẠT CAMELLIA SP (THEACEAE) NGUYỄN QUANG KHÁNH HÀ NỘI - 2006 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH, SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 CAMELLIA SP (THEACEAE) VÀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU 1.1.1 Một số đặc điểm Camellia sp 1.1.2 Hạt khô dầu từ hạt Camellia sp 11 1.2 1.3 KHÁI NIỆM VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID 14 HỢP CHẤT SAPONIN 16 1.3.1 Khái niệm chung saponin 16 1.3.2 Phân loại 17 1.3.2.1 1.3.2.2 1.3.3 1.4 Saponin triterpenoid 17 Saponin steroid 20 Một vài nghiên cứu gần saponin 22 CHIẾT XUẤT 25 1.4.1 1.4.1.1 1.4.1.2 1.4.1.3 1.4.2 1.4.2.1 1.4.2.2 1.4.2.3 Một số q trình biến đổi q trình chiết xuất 27 Khuếch tán 27 Quá trình thẩm thấu 28 Quá trình thẩm tích 29 Những yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 29 Về nguyên liệu 29 Dung môi chiết 30 Yếu tố kỹ thuật 30 1.4.3 Phân loại phương pháp chiết xuất 31 1.4.4 Một số lưu ý chiết xuất hợp chất saponin 31 Chương 34 THỰC NGHIỆM 34 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.2.1 Phương pháp tổng hợp tư liệu 34 2.2.2 Phương pháp hóa lý, hóa học khảo sát nguyên liệu chiết tách 35 2.2.1.1 2.2.1.2 2.2.1.3 2.2.1.4 Xác định độ ẩm nguyên liệu (theo TCVN 4801:89) 35 Xác định hàm lượng tinh bột 35 Xác định hàm lượng dầu khô Du trà (TCVN 4331:2001) 36 Định lượng saponin, flavonoid dầu thu từ khô Du trà 36 2.2.1.5 2.2.1.6 2.2.1.7 Định tính thành phần hóa học cao chiết tồn phần khơ Du trà 37 Xác định hàm lượng hỗn hợp saponin, flavonoid S f tồn phần 38 Độ hịa tan dung môi hỗn hợp saponin flavonoid 39 2.2.3 Chiết xuất, phân tách hỗn hợp saponin flavonoid S f 39 2.2.4 Thử hoạt tính sinh học hỗ hợp S f 40 2.2.5 Thiết bị thí nghiệm 41 Chương 42 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 42 3.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG CHIẾT XUẤT HỖN HỢP S F TỪ KHÔ DU TRÀ 46 3.3 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT S F TỪ KHÔ DU TRÀ 50 3.3.1 Khảo sát quy trình chiết xuất dung môi methanol nước 50 3.3.2 Quy trình chiết xuất S f dung mơi nước 57 3.3.2.1 Xử lý nguyên liệu 57 3.3.2.2 Giai đoạn chiết nước xử lý dịch chiết 59 3.3.2.3 Giai đoạn tinh chế 63 3.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM CHIẾT S F 67 3.4.1 Thử hoạt tính phá huyết 67 3.4.2 Thử hoạt tính kháng nấm 69 3.4.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm 69 KẾT LUẬN 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 75 DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1: Camellia sp (Theaceae) trồng Nghĩa Đàn, Nghệ An (2005) Bảng 1: Kích thước, trọng lượng quả, hạt Du trà Việt Nam [8] 11 Hình 2: Hạt Camellia sp (12/2005) 12 Bảng 2: Kết phân tích hạt Du trà chất lượng dầu Du trà [8] 12 Hình 3: Khô dầu hạt Camellia sp Nghĩa Đàn, Nghệ An (2005) 13 Bảng 3: So sánh hàm lượng saponin số loài thực vật 14 Hình 4: Dạng cấu trúc phổ biến hợp chất flavonoid 15 Hình 5: Sapotalen 17 Hình 6: Bốn cấu trúc aglycone chủ yếu saponin triterpenoid pentancyclic 18 Hình 7: Cấu trúc aglycone saponin triterpenoid tetracyclic 20 Hình 8: Một vài cấu trúc phổ biến Saponin steroid 21 Hình 9: Các q trình diễn chiết dung mơi 25 Hình 1: Khô dầu từ hạt Du trà Nghĩa Đàn - Nghệ An (2005) 34 Sơ đồ 1: Phân lập thu cao chiết soxhlet 38 Sơ đồ 2: Tách hỗn hợp S f từ cao chiết MeOH 39 Bảng 1: Xác định độ ẩm nguyên liệu 42 Bảng 2: Xác định hàm lượng tinh bột 42 Bảng 3: Xác định hàm lượng chất béo 43 Bảng 4: Xác định hàm lượng saponin có dầu 43 Bảng 5: Định tính thành phần cao chiết từ khô Du trà 44 Hình 1: Thử phản ứng Lieberman –Burchard 44 Bảng 6: Xác định hàm lượng saponin, flavonoid toàn phần 45 Bảng 7: Saponin, flavonoid dầu khô Du trà loại dầu 45 Bảng 8: Thời gian tan hồn tồn (phút) dung mơi điểm nhiệt độ khác (0,1g saponin/5ml dung môi) 46 Hình 2: So sánh thời gian hịa tan S f số dung môi phân cực 47 Bảng 9: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết tới hàm lượng thu hồi S f 48 Hình 3: Đồ thị mô tả hàm lượng thu hồi S f theo thời gian chiết 48 Bảng 10: Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi tới hàm lượng S f thu 49 Hình 4: Đồ thị mơ tả hàm lượng thu hồi S f theo thời gian chiết 49 Bảng 11: Ma trận kế hoạch 23 51 Sơ đồ 1: Quy trình chiết tách hỗn hợp S f methanol, quy mô 100g nguyên liệu/mẻ 52 Sơ đồ : Quy trình chiết tách hỗn hợp S f nước, quy mô 100g nguyên liệu/mẻ 53 Bảng 12 Kết tính tốn phương sai 55 Hình 5: Kết tối ưu từ phẩm mềm Nemrodw 56 Bảng 13: Thông số quy trình chiết xuất S f từ khơ Du trà 57 Bảng 14: Xử lý ngun liệu có loại dầu khơng loại dầu 58 Hình 6: Thử phá huyết mẫu dầu béo loại sau chiết nước 59 Bảng 15: So sánh việc xử lý màu than hoạt tính 60 Sơ đồ 3: Giai đoạn chiết nóng xử lý dịch chiết 62 Sơ đồ 4: Giai đoạn tinh chế cao chiết từ nước 64 Bảng 16: Tham số quy trình chiết xuất S f từ kg khơ Du trà 65 Sơ đồ 5: Quy trình hồn thiện chiết xuất S f từ khô hạt Du trà 66 Bảng 17: Chi phí dung mơi tiêu hao quy trình chiết xuất S f quy mơ 2kg/mẻ (sơ đồ 3.5) 67 Hình 7: Vịng phá huyết mẫu sản phẩm chiết theo phương pháp đục giếng, nồng độ chế phẩm 0,1g/5 ml 68 Hình 8: Vòng phá huyết theo phương pháp đặt giấy tẩm dung dịch S f chiết nước nồng độ 0,1 g/ ml 68 Hình 9: Vòng kháng nấm chủng Candida albicans ATCC 10231 nồng độ S f ức chế 1mg/ml nồng độ 3mg/ml 69 MỞ ĐẦU Từ hạt Camellia sp (tên thường gọi Du trà), qua ép người ta thu dầu Loại dầu sử dụng chủ yếu dùng sản xuất dầu thực phẩm Bã khô sau ép phần người dân dùng làm chất xử lý hồ ao có tác dụng diệt cá tạp, có nơi đưa vào bổ sung làm thức ăn chăn ni, cịn lại bỏ đi, khơng ý đến Trong đó, ngành Lâm nghiệp đưa Du trà vào thành phủ xanh đất trống, đồi trọc rừng phịng hộ nên nguồn bã khơ lớn Trong số nghiên cứu Việt Nam giới, người ta bã khô sau ép có chứa lượng dồi hợp chất có tên khoa học saponin Tuy nhiên, việc chiết xuất hợp chất saponin tinh khiết khó khăn tính chất hóa lý phức tạp chúng Người ta chứng minh số tác dụng có ý nghĩa hợp chất ví dụ tác dụng kháng nấm, tác dụng phá huyết, tác dụng làm giảm cholesterol máu Đáng ý gần với đề tài thuộc chương trình nghiên cứu Khoa học Nhà nước - Hướng khoa học tự nhiên, mã số 511402, giai đoạn 2002-2005, GS.TSKH Phạm Trương Thị Thọ cộng chiết xuất thu hỗn hợp saponin flavonoid gọi tên S f nghiên cứu dược lý học tác dụng (in vitro in vivo) S f chiết xuất từ khô Du trà Camellia Kết cho thấy hỗn hợp chất chiết thu có tính chất có giá trị lĩnh vực y học Các kết nghiên cứu khẳng định hoạt chất S f có tác dụng diệt nấm Candida albicans, loại nấm bệnh phụ khoa phổ biến Trong hoạt chất S f lại khơng tiêu diệt nấm Lactobacillus loại nấm có tác dụng ổn định độ pH phần kín phụ nữ Hoạt chất S f ức chế tinh trùng, làm cho tinh trùng không di chuyển nhanh dừng lại chỗ, không hoạt động chết Điều bảo đảm tinh trùng khơng cịn khả tiếp cận với trứng, khơng cịn khả gây thụ thai Nghiên cứu cịn sâu vào tìm quy trình bào chế tạo thuốc kháng nấm viên đặt âm đạo diệt tinh trùng người Ngoài ra, đề tài tiến hành thử nghiệm sản xuất số sản phẩm dược phẩm có sử dụng S f hoạt chất [15] Điều đặc biệt nghiên cứu xác định hỗn hợp S f có chứa ngồi saponin số flavonoid Trong nghiên cứu dược liệu để làm thuốc, chiết đơn chất thường xuyên sử dụng hỗn hợp chất nhằm tranh thủ tác dụng có lợi chúng, tác động hiệp đồng điều trị bệnh Kế thừa kết nghiên cứu với khả chiết tách từ bã khô Du trà, vấn đề nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách phù hợp để khai thác saponin, flavonoid từ bã khô Du trà có ý nghĩa vấn đề trồng rừng, xóa đói giảm nghèo vùng nơng thơn góp phần tạo nguồn nguyên liệu quý cho ngành dược phẩm Các kết nghiên cứu thực nhiều nhà khoa học cho thấy biện pháp chủ yếu để tách saponin từ bã khô dầu Du trà sử dụng dung môi nước, methanol, cồn dung dịch chúng tỷ lệ khác Tuy nhiên, nghiên cứu chưa đưa quy trình có khả áp dụng vào thực tế, quy mô chiết tách mang tính thăm dị lượng nhỏ nguyên liệu sâu vào nghiên cứu tác dụng saponin, chứng minh tính quý saponin Du trà ngành dược Đã có nghiên cứu khả tách saponin từ bã khô Du trà Song hầu hết đó, tập trung xác định hàm lượng saponin nguyên liệu đưa phác thảo quy trình chiết tách với nghèo nàn yếu tố công nghệ Và, nay, chưa có quy trình cơng nghệ áp dụng thực tế nước ta để thu saponin với tính chất q từ bã khô Du trà Như vậy, vấn đề đề tài xây dựng quy trình chiết tách saponin từ bã khơ Du trà có tính dễ thực quy mô nguyên liệu lớn, tiếp cận với thực tế sản xuất công nghiệp Để giải vấn đề nghiên cứu trên, nhiệm vụ quan trọng đề tài tìm lời giải cho câu hỏi nghiên cứu đặt đây: Khả chiết xuất hỗn hợp saponin từ khô Du trà dung mơi nước? Làm xây dựng mơ hình chiết tách có hiệu có tính ứng dụng cao? Chất lượng saponin thu được đánh giá sở nào? Tuy nhiên điều kiện hạn chế sở vật chất nghiên cứu, đề tài hướng tới mục tiêu nghiên cứu sau Mục tiêu nghiên cứu: Để giải câu hỏi nghiên cứu nêu góp phần giải vấn đề nghiên cứu đặt ra, đề tài tiến hành nhằm mục tiêu nghiên cứu góp phần xây dựng hồn thiện quy trình chiết tách S f từ khơ dầu hạt Camellia sp Nội dung nghiên cứu: o Khảo sát nguyên liệu khô Du trà o Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết tách o Xây dựng quy trình chiết xuất S f từ khô Du trà o Xây dựng tiêu chuẩn sản phẩm S f Việc nghiên cứu đề tài có ý nghĩa quan trọng khoa học thực tiễn Về mặt khoa học, đề tài góp phần chắt lọc hồn thiện quy trình cơng nghệ phù hợp với điều kiện trình độ kỹ thuật Việt Nam Về mặt thực tiễn, đề tài cung cấp sở cho nghiên cứu quy mô thử nghiệm, chuẩn bị cho quy mơ cơng nghiệp Qua gián tiếp góp phần nâng cao giá trị Du trà, cải thiện cho người chăm sóc thu hái, tạo nguồn dược liệu tốt phục vụ sản xuất thuốc phòng chữa bệnh Chương TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 CAMELLIA SP (THEACEAE) VÀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU 1.1.1 Một số đặc điểm Camellia sp Camellia sp (Theaceae) thuộc Theales (thường gọi Du trà) loại thân gỗ nhỏ, cao trung bình khoảng 3-5m, thân to khoảng 812cm, gốc thường có từ 3-5 thân khơng phân biệt thân hay phụ chỉa cành sớm, vỏ màu nâu hay xám, tán nhỏ dày phân bố tạo thành nhiều dạng khác nhau: hình ơ, hình trứng, hình nón, hình tháp, trụ Lá đơn mọc cách, cuống ngắn, mép có cưa nhỏ, hình dạng kích thước khác Qua nghiên cứu, tác giả Nguyễn Quang Khải cộng kết luận loài Du trà có khác rõ rệt hình dạng, màu sắc kích thước cá thể khác [8] Hình 1: Camellia sp (Theaceae) trồng Nghĩa Đàn, Nghệ An (2005) Hoa Du trà thuộc loại lưỡng tính, màu trắng khơng có cuống Hoa có 5-7 tràng, 35-40 nhị màu vàng, bầu hạ thường có từ 3-4 Du trà hoa từ tháng 10-12 hàng năm, hình thành mầm hoa vào mùa xuân phân hoá rõ rệt vào tháng 5-6 Quả Du trà hình trịn, đầu lõm hay thn dài, có loại phình to, hai đầu lõm Kích thước trọng lượng khác số giống Du trà vùng trồng khác Đường kính trung bình 3-6 cm, độ dầy vỏ từ 0.5-1cm Quả có nhiều hạt mầu nâu vàng nâu xám, chín có mầu nâu đen Nhân hạt có chứa dầu, theo nhiều tài liệu nghiên cứu hàm lượng khoảng 45-50% khối lượng nhân Dầu có dạng lỏng sánh, màu vàng, khơng mùi, vị dịu [8] Có phân bố rộng vùng nhiệt đới châu Á, Du trà có mặt nước Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Myanma, Ấn Độ từ 18o21 đến 34o34 độ vĩ bắc Ở nước ta, Du trà trồng đến vĩ tuyến 17o thuộc Vĩnh Linh, Cam Lộ Lồi ưa khí hậu ấm ẩm, nhiệt độ khơng khí bình qn năm từ 18 -240C, chịu rét đến 2o-3oC Nó cần có nhiệt độ tháng giêng mát giúp cho việc tích lũy dầu Tuy nhiên có khả chịu nhiệt độ cao gió Lào nóng vào tháng mùa hè Du trà ưa thích độ ẩm tương đối thời kỳ hoa 65-70%, thời kỳ nuôi 80-85% Lượng mưa năm thích hợp từ 1300-1500mm Tổng số nắng từ 1500 giờ/năm trở lên Giai đoạn năm cần che bóng nhẹ, lớn cần ánh sáng hoàn toàn hoa kết tốt Du trà sinh trưởng tốt vùng đồi có độ cao 500 mét so với mực nước biển Một đặc điểm sinh thái quan trọng Du trà khơng kén đất, sống vùng đất bạc màu, đất trống đồi trọc, đất thối hóa khơ cằn Cây sinh trưởng hoa kết tốt loại đất nâu vàng, đỏ vàng, vàng đỏ loại đá mẹ phiến thạch sét, sa phiến thạch, ryôlit Lạng Sơn, đất đỏ bazan vùng Vĩnh Linh- Quảng Trị, đất cát cố định Vĩnh Chấp- Vĩnh Linh Cây sinh trưởng nhiều đất đỏ bazan có tầng đất dày 50cm, tỷ lệ mùn đất 1% [29] Cây Du trà có rễ cọc đâm sâu tới 1,5m tùy theo loại đất trồng, có hệ rễ bàng phân nhánh phát triển mạnh thường phân bố độ sâu từ 20-40cm Chiều dài rễ bàng trung bình từ 3-3,5m Ngồi ra, cịn có rễ cám phát triển 60 Sau dừng trình chiết, treo túi bột lên giá cho chảy dịch xuống Sau ép cho chảy hết dịch khỏi khối bột Dùng lượng nhỏ nước nóng (1L) ngâm rửa khối bột rút kiệt Tiếp lấy 0,5 (L) nước nóng tráng rửa khối bột lần rút kiệt dịch Mục đích việc nhằm rút kiệt chất chiết bám khối bột Việc sử dụng túi vải lọc có tác dụng giảm bớt lượng bã bột nguyên liệu xâm nhập vào dịch chiết, nhờ đó, giảm tải việc phải xử lý tách dịch bã chiết biện pháp ly tâm hay lọc Dịch chiết thu có màu nâu xám, đục, mùi đặc trưng khô Du trà Nếu quấy mạnh tạo nhiều bọt tương đối bền Khi tiến hành xử lý dịch chiết, thấy cao chiết sau cô loại nước có màu sẫm hơn, dính bết so với cao chiết methanol Đồng thời, sản phẩm thu có màu sẫm Vì vậy, cần có giai đoạn xử lý màu loại tạp trước tinh chế sản phẩm Thơng thường, có giai đoạn xử lý tẩy màu nhằm thu sản phẩm cuối có màu sắc đặc trưng Để xử lý màu dịch chiết, chúng tơi tiến hành thí nghiệm sau Lấy hai mẫu M1 M2, mẫu 200 ml dịch chiết đem đun nóng tới khoảng 60oC cho than hoạt tính sấy trước vào mẫu M1, mẫu M2 khơng cho than hoạt tính Sau thời gian, đem lọc xốp hút chân không hai mẫu dịch tiến hành cất quay chân không thu mẫu dịch chiết Xử lý thu sản phẩm Sf Kết cho bảng sau Bảng 15: So sánh việc xử lý màu than hoạt tính Mẫu Màu sắc khối dịch sau lọc Khối lượng Sf (g) thu Màu sắc bột Sf M1 M2 Có màu vàng xám tương tự nhau, khơng rõ nét khác biệt 0,60 0,64 vàng nâu đậm vàng nâu đậm 61 Việc xử lý màu dịch chiết nước than hoạt tính gần khơng đem lại khác biệt lớn so với không xử lý Màu sắc khối dịch màu sắc sản phẩm cuối tương tự Khối lượng sản phẩm thu chí cịn giảm có khả saponin bị hấp phụ phần nhỏ vào than hoạt tính Vì vậy, việc sử dụng than hoạt tính trường hợp khơng phải lựa chọn có ý nghĩa Trong q trình chiết, nước kéo theo phần protein poplypeptide dextrin từ khô Du trà vào dịch chiết Các loại hợp chất dễ kết tủa tách khỏi dung dịch có mặt rượu etylic với nồng độ định Để loại bỏ tạp chất này, tiến hành thí nghiệm sau Lấy mẫu thí nghiệm M3, M4 M5 mẫu 200ml dịch chiết nước Cho vào mẫu M3 lượng khoảng 55 ml cồn 96o để có nồng độ cồn khối dịch 20o, mẫu M4 có 220 ml cồn 96o để có nồng độ cồn 50o, mẫu M5 khơng cho cồn Sau để lạnh qua đêm quan sát tiến hành xử lý thu sản phẩm Sf cuối Kết quan sát thấy mẫu M3, M4 có tủa xuất lắng đáy nhiều so với mẫu M5 Lọc sấy định lượng thu 0,18 (g) tủa M3 so với 0,21 (g) tủa mẫu M4 0,02 (g) tủa cho mẫu M5 Đem tủa M3, M4 hòa tan lại dung dịch cường trương thấy khơng tan hết Dịch đem thử định tính có mặt saponin phương pháp phá huyết khơng thấy có tượng xảy chứng tỏ khơng có saponin tủa Khối lượng sản phẩm Sf thu ba mẫu M3, M4, M5 tương tự Tuy nhiên, màu sắc mẫu có xử lý tủa cồn cải thiện rõ rệt (màu vàng nâu nhạt) so với mẫu xử lý cồn (màu vàng nâu đậm) Vì vậy, cần thiết có q trình xử lý tủa cồn dịch chiết trước cô đặc Nồng độ cồn lựa chọn 20o để giảm thiểu lượng cồn cần dùng Kết luận, giai đoạn chiết nước xử lý dịch chiết mô tả sơ đồ đây: 62 NL xử lý Nước khử khoáng to = 100oC τ = (h) Chiết nóng Dịch chiết Cồn Tủa cồn, làm lạnh, lắng gạn Tủa to = 5-10oC τ = 6-8 (h) Độ cồn: 20% Dịch cồn Cô CK Dd cồn to = 50-60oC τ = 4-6 (h) Cao chiết A Sơ đồ 3: Giai đoạn chiết nóng xử lý dịch chiết Khi quay chân không loại cồn giảm hàm lượng nước dịch chiết, lượng lớn dịch cồn thu đặt vấn đề xử lý tái sử dụng lượng cồn Để đạt nồng độ cồn khoảng 20% giai đoạn tủa lạnh, cần lượng cồn 96o khoảng ¼ lượng dịch chiết Nếu cồn sử dụng loại thấp độ khoảng 40o cần tới thể tích thể tích dịch chiết Điều khiến cho tiêu hao lượng làm lạnh cô cạn tăng lên nhiều Nếu cồn có độ 60o thể tích cần dùng ½ thể tích dịch chiết Chính thế, đề xuất giải pháp cho cơng đoạn cô chân không loại cồn sau: khoảng thời gian đầu trì nhiệt độ dịch chiết khoảng 50oC để kéo phần lớn lượng cồn khỏi dịch chiết, phần thu lại đo độ cồn cồn kế Kết cho thấy nồng độ cồn đạt từ 40-45o Khi tái sử dụng 63 bổ sung thêm cồn 96o để đạt tới nồng độ cần thiết Phần thu tiếp sau bỏ Q trình đặc dừng đạt tới thể tích dịch cao sệt theo tỷ lệ 1:1 so với khối lượng nguyên liệu ban đầu 3.3.2.3 Giai đoạn tinh chế Cao chiết thu từ giai đoạn chiết nóng cịn chứa nhiều tạp chất khác Do đó, cần tiến hành xử lý để thu hỗn hợp Sf tương đối Giai đoạn sử dụng tính chất tan chất số dung môi khác khác để loại bỏ dần tạp chất Quy trình tinh chế nghiên cứu mơ tả Sơ đồ 3.4 Cao chiết A trích ly hỗn hợp butanol-nước phễu chiết theo tỷ lệ 1:1 Điều đặc biệt hỗn hợp butanol bão hòa nước phân chia thành hai pha lỏng-lỏng phân cách Các phân tử saponin số hợp chất khác thu hút lên pha BuOH bão hòa nước (dịch BuOH) tạp chất khác chủ yếu nằm pha nước bão hòa butanol (dịch nước) Giữ yên thời gian để hệ cân bằng, rút dịch theo pha cần thu pha butanol bão hịa nước Tỷ lệ thể tích (dịch BuOH : dịch nước) nhiệt độ phòng theo thực nghiệm (11:9) Do ln có phân bố saponin hai pha trích ly nên phần dịch nước bão hòa butanol lượng định saponin Để tận thu lượng saponin này, lý thuyết cần tiến hành lặp lại nhiều lần q trình trích ly butanol Qua thực nghiệm thấy rằng, sau lần trích ly thứ dịch nước bão hòa butanol, pha butanol bão hịa nước có màu vàng nhạt Định lượng dịch thu hàm lượng hỗn hợp saponin flavonoid khơng đáng kể Vì vậy, đề tài lựa chọn biện pháp trích ly lần Dịch BuOH thu sau hai lần trích ly đem quay chân khơng nhiệt độ 50-55oC thu cao chiết butanol thu hồi Phần BuOH thu hồi đưa vào phễu chiết nhiệt độ phòng rút bỏ phần nước bão hòa BuOH lấy riêng phần BuOH bão hòa nước Mục đích để tận dụng lại lượng BuOH trích ly lần Ngồi ra, để tận thu triệt để nữa, dịch nước sau trích ly lần phần nước loại sau trích ly thu hồi BuOH 64 chưng cất tiếp Kết cho thấy, tổng khối lượng thu hồi để tái sử dụng dịch BuOH bão hòa nước 66-70% so với BuOH dùng Cao chiết A Dd BuOH bão hòa nước to=25-30oC τ = (h) Trích ly Dịch BuOH Dịch nước Cô chân không to = 50-55oC BuOH Cao MeOH Acetone Kết tinh Tủa vơ định hình to = 0-5oC τ = 5-6 (h) Dung dịch MeOH:Ace Sấy 50oC Sf Sơ đồ 4: Giai đoạn tinh chế cao chiết từ nước Sau cao chiết hịa nóng (50oC) lượng vừa đủ methanol cho từ từ dung môi acetone vào tới xuất tủa dừng Thực nghiệm cho thấy tỷ lệ thể tích acetone so với thể tích dịch methanol cần thiết (3:1) Để nguội khối dịch đưa vào làm lạnh thời gian 5-6 Tiếp đó, gạn bỏ pha lỏng, thu tủa Rửa tủa acetone đem sấy nhiệt độ 45-50oC thu khối bột màu vàng hỗn hợp Sf 65 Khối lượng Sf thu là: 128,5 (g), đạt 6,43 % so với khối lượng nguyên liệu ban đầu Để đánh giá tính ổn định quy trình, tiến hành chiết theo quy trình nghiên cứu đưa theo sơ đồ 3.5 Khối lượng nguyên liệu sử dụng 2kg Kết thu 130 (g) hỗn hợp Sf, chiếm 6,5% khối lượng nguyên liệu ban đầu Bảng 16: Tham số quy trình chiết xuất Sf từ kg khơ Du trà Cơng đoạn Hóa chất Lượng (L) Chiết nóng Nước khử khống 13-14 Tủa cồn Cồn 96o Trích ly BuOH tinh khiết Kết tinh Tái sử dụng (L) 12 (L) dịch chiết 3,2 1,44 (L) 1,3 (L) Methanol 0,4 Acetone 1,2 Sản phẩm (L) cao chiết 130 (g) Sf Thử nghiệm kết tinh Sf nước acetone Dùng lượng vừa đủ nước nóng 60oC hòa tan hết cao chiết Tiếp tục giữ nhiệt từ từ cho acetone vào đến thấy vẩn đục dừng Để nguội khối dịch đem để lạnh 0-5oC Kết cho thấy, xuất lớp tủa đáy bình Gạn lớp dịch để thu tủa Đem cạn sấy tủa, có bột mịn màu vàng nâu nhạt, có ánh kim Thử phá huyết (hình 3.7) cho thấy vịng phá huyết tương đương với Sf kết tinh methanol Vì vậy, hồn tồn áp dụng phương pháp kết tinh saponin acetone dung mơi nước Nhờ đó, tránh việc sử dụng dung môi độc hại (methanol) sản xuất, vừa có ý nghĩa giảm giá thành Tuy nhiên, vấn đề cần nghiên cứu sâu thông qua đánh giá chất lượng hiệu suất thu hồi Sf để ứng dụng vào thực tế 66 NL xử lý Nước khử khoáng to = 100oC τ = (h) Chiết nóng Dịch chiết Cồn Tủa cồn, làm lạnh, lắng gạn Tủa Xử lý to = 5-10oC τ = 6-8 (h) Độ cồn: 20% Dịch cồn Dd cồn to = 50-60oC τ = 4-6 (h) Cơ CK Cao chiết A Dd BuOH bão hịa nước Lần Trích ly Dịch BuOH Xử lý BuOH Cơ chân không to=25-30oC τ = (h) Dịch nước to = 50-55oC Cao MeOH Acetone Kết tinh Tủa vô định hình to = 0-5oC τ = 5-6 (h) Dung dịch MeOH:Ace Sấy 50oC Sf Sơ đồ 5: Quy trình hồn thiện chiết xuất Sf từ khơ hạt Du trà 67  Sơ tính giá thành vật liệu cho mẻ kg nguyên liệu Cơ sở để tính tốn sơ chi phí giá loại hóa chất chính, bao gồm methanol, cồn, acetone, n-butanol Định mức trình bày bảng 3.16 Bảng 17: Chi phí dung mơi tiêu hao quy trình chiết xuất Sf quy mơ 2kg/mẻ (sơ đồ 3.5) Hóa chất Đơn giá (VNĐ/lít) Số lượng (l) Thành tiền Cồn 96o (CN) 22.100 1,8 39.780 Methanol CN 57.800 0,4 23.120 n-Butanol 119.000 0,7 83.800 Acetone 61.200 1,2 73.440 Tổng tiền (đồng): 220.140 (Giá dung môi theo báo giá Cơng ty TNHH Văn Minh 55, Phùng Hưng, Hồn Kiếm, Hà Nội) 3.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM CHIẾT SF 3.4.1 Thử hoạt tính phá huyết Phá huyết tính chất đặc biệt hợp chất saponin, chưa thấy có hợp chất khác Nguyên nhân phá huyết saponin gây cịn chưa giải thích rõ ràng mà nhà khoa học cho saponin tạo phức với cholesterol ester cholesterol màng hồng cầu [17] Kết thử nghiệm tác dụng phá huyết hỗn hợp Sf chiết xuất từ khô Du trà cho thấy vòng phá huyết rõ nét Như vậy, sản phẩm chiết thu thể rõ có hàm lượng saponin định Đáng lưu ý nồng độ pha mẫu (0,1g/5mL), vòng phá huyết hỗn hợp SF chiết theo dung mơi nước lớn vịng phá huyết hỗn hợp SF chiết dung môi methanol 68 Dung dịch NaCl 9‰ Sf chiết nước, kết tinh methanol Sf chiết MeOH Sf chiết nước, kết tinh nước Hình 7: Vòng phá huyết mẫu sản phẩm chiết theo phương pháp đục giếng, nồng độ chế phẩm 0,1g/5 ml Hình 8: Vịng phá huyết theo phương pháp đặt giấy tẩm dung dịch Sf chiết nước nồng độ 0,1 g/ ml Như khẳng định hỗn hợp Sf chiết theo quy trình sử dụng dung mơi nước có tính chất hồn tồn phù hợp với nghiên cứu hoạt tính saponin Du trà Điều chứng tỏ quy trình cho phép chiết xuất sản phẩm có chứa saponin 69 3.4.2 Thử hoạt tính kháng nấm Hình 9: Vòng kháng nấm chủng Candida albicans ATCC 10231 nồng độ Sf ức chế 1mg/ml nồng độ 3mg/ml Kết thử khả kháng nấm cho thấy hỗn hợp Sf thu tạo vòng kháng nấm Candida albicans ATCC 10231 rõ rệt Nồng độ Sf ức chế tối thiểu xác định 1mg/ml Như vậy, hỗn hợp Sf chiết xuất theo quy trình nghiên cứu có khả kháng nấm phù hợp với tính chất sinh học khẳng định sản phẩm 3.4.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm Các kết nghiên cứu chứng minh hỗn hợp Sf thu có tính chất sinh học q báu Trong phần này, dựa phương pháp xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu bào chế Viện Dược liệu, đề tài đưa tiêu chất lượng cho khô Du trà nguyên liệu hỗn hợp Sf chiết xuất từ khô Du trà Chi tiết trình bày phần Phụ lục 70 KẾT LUẬN Tóm lại, nghiên cứu xây dựng quy trình cơng việc nặng nề, địi hỏi đầu tư nhiều thời gian cơng sức Trong phạm vi có hạn đề tài, tiến hành số cơng việc góp phần đưa quy trình chiết xuất hoạt chất Sf từ khô dầu hạt Camellia sp (hạt Du trà) Qua kết thu nghiên cứu, đề tài tới số kết luận sơ sau: Khảo sát nguyên liệu khô dầu hạt Camellia sp (Du trà) - Hàm lượng dầu có khơ Du trà: 6,57% - Hàm lượng tinh bột 6,56% - Ngun liệu khơ Du trà có hàm lượng Sf toàn phần là: 8.53%; - Thành phần chủ yếu dịch chiết tồn phần khơ Du trà gồm: flavonoid, tanin (hợp chất phenol) saponin (glucoside); Khảo sát quy trình chiết dung mơi methanol dung mơi nước cho phép khẳng định nước có khả thích hợp để chiết xuất Sf từ khơ dầu Du trà Từ đó, xác định số yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết nghiên cứu: - Thời gian chiết thích hợp xác định giờ; - Tỷ lệ ngun liệu/dung mơi thích hợp xác định 1/6; - Nhiệt độ chiết thích hợp nhiệt độ sơi nước (100oC) Đã xây dựng quy trình chiết xuất hoạt chất Sf quy mô 2kg/mẻ mô tả sơ đồ 3.5 với thơng số Kết thu hàm lượng Sf chiếm 6,5% khối lượng nguyên liệu, hiệu suất thu hồi so với saponin toàn phần 76,2% Chi phí dung mơi tiêu hao sơ 220.140VNĐ/mẻ Một số tính chất đặc trưng hỗn hợp sản phẩm Sf từ quy trình chiết xuất chứng minh phù hợp với mong muốn để ứng dụng vào sản xuất dược phẩm  Tác dụng phá huyết  Tác dụng kháng nấm Candida albicans ATCC 10231 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Nguyễn Văn Bách, Cao Ngọc Anh, Tăng Thị Diệu Linh (2002), Bước đầu nghiên cứu Mắc rạc Delavaya toxocarpa French, Đại học Dược Hà Nội [2] Bộ Giáo dục Đào tạo (1992), Sổ tay Quá trình thiết bị cơng nghệ hóa chất, Tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật, pp.301 [3] Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất Y học [4] Dự án Lâm Nông nghiệp Nghĩa Đàn (8/2002), Báo cáo việc tình hình sinh trưởng phát triển, biện pháp chọn giống, cung cấp giống khả mở rộng trồng câu Sở, viễn cảnh kinh tế Sở thời gian tới, Nghệ An [5] Vũ Thị Đào cộng sự, “Hồn thiện quy trình cơng nghệ khai thác chế biến số nguyên liệu dầu (Trẩu-Sở)”, Các công trình nghiên cứu ứng dụng Cơng nghệ sinh học Công nghiệp thực phẩm giai đoạn 19861995, pp 261-265, NXB Khoa học Kỹ thuật [6] Vũ Vǎn Điền, Nguyễn Thanh Phương, Nguyễn Trần Giáng Hương, Phạm Thị Vân Anh (6/2000), “Một số kết bước đầu nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học Khơi (Ardisia sylvestris Pitard)”, Tạp chí Thơng tin Y dược số 6, Hà Nội [7] Nguyễn Minh Ðức, Một số kết nghiên cứu thuốc Việt Nam suy nghĩ định hướng nghiên cứu phát triển dược liệu, www.ykhoanet.com/NCKH/duoc04.HTM [8] Nguyễn Quang Khải, Cao Quang Nghĩa, Bùi Thanh Hằng, Lương Thế Dũng, Đặng Thịnh Triều (4/2004), Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học (1998-2003) - Nghiên cứu bổ sung số biện pháp kỹ thuật lâm sinh chủ yếu tạo rừng sở Camellia sasanqua Thunb để cung cấp nguyên liệu cho sản xuất dầu thực phẩm kết hợp phòng hộ, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 72 [9] Nguyễn Bá Kiên, Nguyễn Văn Quân (2006), Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất sinh học saponin từ khô sở dầu Nghệ An Camellia drupifera (Lour) Pierre, Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2006, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội [10] PGS.TS Lê Thanh Mai (chủ biên) (2004), Các phương pháp phân tích ngành Cơng nghệ Lên men, NXB Khoa học Kỹ thuật [11] Chu Bá Nam, Nguyễn Xuân Dũng B.A Leclereq (1988), “Tách xác định terpenoit sắc ký khí”, Tạp chí dược học (số 2/1988), pp.12-15 [12] Sở Nông nghiệp Phát triển nông thôn Nghệ An (2002), Kỹ thuật gây trồng Sở (Loài sở Chè Nghệ An), Nghệ An [13] TCVN 4801:89 - Khô dầu Phương pháp xác định hàm lượng ẩm chất bay (Oilseed residues) [14] TCVN 4331:2001 - Thức ăn chăn nuôi Xác định hàm lượng chất béo [15] GS.TSKH Phạm Trương Thị Thọ (2005), Nghiên cứu chiết xuất hóa học, dược lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng kháng nấm bệnh Du trà nhằm làm thuốc hạn chế sinh sản, thuốc phụ khoa góp phần phục vụ mục đích bảo vệ sức khỏe sinh sản phụ nữ KHHGĐ, Mã số 511402, Bộ Khoa học Công nghệ, Hà Nội [16] GS.TSKH Phạm Trương Thị Thọ (2001), Giáo trình hợp chất tự nhiên, NXB Giáo dục [17] GS Ngơ Văn Thu (1990), Hố học Saponin, Trường ĐH Y Dược Tp.HCM [18] Đinh Ngọc Thức (2003), Bước đầu nghiên cứu số thành phần hóa học sở dầu Nghệ An Camellia drupifera (Lour) Pierre, Luận văn thạc sỹ khoa học hóa học, Đại học Sư phạm Hà Nội [19] Trường đại học Cần Thơ, Sinh lý, Giáo trình điện tử, Trung tâm thư viện [20] Trường Đại học Giao thông Vận tải (1996), Quy hoạch thực nghiệm, Hà Nội 73 [21] Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn (2003), Hóa học thực phẩm, pp.233-235, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [22] Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược (Giáo trình sau đại học), Bộ Giáo dục Đào tạo, Bộ Y tế, NXB KH&KT Tài liệu Tiếng Anh [23] Warinthorn Chavasiri, Wasana Prukchareon, Pattara Sawasdee and Siriporn Zungsontiporn (2005), Allelochemicals from Hydrocotyle umbellata Linn., Bangkok, Thailand [24] Chia-Pu Lee, Gow-Chin Yen, Identification of bioactive compounds in oil of tea seed (Camellia oleifera Abel), Department of Food Science, National Chung Hsing University, Taiwan [25] Coustantina Tzia, George Liadakis (2003), Extraction optimization in Food engineering, pp 52-72, 340-357, Marcel Dekker Inc., New York [26] Figen Mert Turk (2006), “Saponin versus plant fungal pathogens”, Journal of Cell and Molecular Biology, pp.13-17 [27] Haridas et al (8/2005), Triterpene compositions and methods for use thereof, United States Patent, No 6962720 [28] http://www.camellia-oil.com/Tea_Saponin.htm [29] Japan International Cooperation Agency, Forest Science Institute of Vietnam (4/2002), Use of indigenous tree species in reforestation in Vietnam, Agricultural Publishing House, Hanoi [30] John Michael Berger (2001), Isolation, characterization and synthesis of bioactive natural products from rainforest flora, Dissertation on the degree of doctor of phylosophy in chemistry, pp.64-70, Virginia Polytechnic Institute and State University, Virginia, USA [31] John M Ruter (2002), Nursery Production of Tea Oil Camellia Under Different Light Levels, Reprinted from “Trends in new crops and new 74 uses”, 2002, J Janick and A Whipkey (eds.), ASHS Press, Alexandria, VA [32] Rowland Laurence (2006), Medicinal Herbs, Australian Government, pp.20 [33] Muir et al (1999), Process for recovery and purification of saponins and sapogenins from Chenopodium Quinoa, United States Patent, No 6355249 B2 [34] Nkere, C K and Iroegbu, C U (3/2005), “Antibacterial screening of the root, seed and stembark extracts of Picralima nitida”, African Journal of Biotechnology Vol (6), June 2005, pp.522-526 [35] Nurettin Yayli et al (2004), “Cyclic Triterpenoid Saponins from Campanula lactiflora”, Turk J Chem (30), 2006, pp.21-28 [36] E Smitsaart, N Mattion, J.L Filippi, B Robiolo, O Periolo, J La Torre and R.C Bellinzoni, Enhancement of the immune response induced by the inclusion of saponin in oil adjuvanted vaccines against foot-andmouth disease, (email: esmitsaart@biogenesis.com.ar), Buenos Aires, Argentina ... tiêu nghiên cứu: Để giải câu hỏi nghiên cứu nêu góp phần giải vấn đề nghiên cứu đặt ra, đề tài tiến hành nhằm mục tiêu nghiên cứu góp phần xây dựng hồn thiện quy trình chiết tách S f từ khô dầu hạt. .. TRONG CHIẾT XUẤT HỖN HỢP S F TỪ KHÔ DU TRÀ 46 3.3 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT S F TỪ KHƠ DU TRÀ 50 3.3.1 Khảo sát quy trình chiết xuất dung mơi methanol nước 50 3.3.2 Quy trình chiết. .. điều trị bệnh Kế thừa kết nghiên cứu với khả chiết tách từ bã khô Du trà, vấn đề nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách phù hợp để khai thác saponin, flavonoid từ bã khô Du trà có ý nghĩa vấn