NGHIÊN cứu sản XUẤT vắc XIN mẫu CHUẨN sởi sử DỤNG CHO KIỂM ĐỊNH vắc XIN sởi tại VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Lê Thu Nga TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Chuyên ngành Công nghệ sinh học Lê Thu Nga NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN MẪU CHUẨN SỞI SỬ DỤNG CHO KIỂM ĐỊNH VẮC XIN SỞI TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa 2011 Hà Nội - Năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Lê Thu Nga NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN MẪU CHUẨN SỞI SỬ DỤNG CHO KIỂM ĐỊNH VẮC XIN SỞI TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ THỊ LUÂN PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM Hà Nội - Năm 2013 Luận văn thạc sĩ Lê Thu Nga - CB110170 CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit Deoxyribonucleic AIK-C Tên chủng virus sởi dùng cho sản xuất vắc xin ARN Axit Ribonucleic BS Bovin Serum (Huyết bê) GM Growth Medium (Môi trường phát triển) JICA Japanese International Cooperation Agency (Cơ quan hợp tác quốc tế Nhật Bản) LCL Giới hạn lg Logarit số 10 MEM Minimum Essential Medium (Môi trường cần thiết tối thiểu) NIBSC National Institute for Biological Standards and Control ODA Official Development Assistance (Hỗ trợ phát triển thức) PFU Placque forming unit (Đơn vị hình thành vết tan hay tạo đám hoại tử) POLYVAC Trung tâm nghiên cứu, sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế TCMR Tiêm chủng mở rộng WFI Water for Injection (Nước pha tiêm) WHO World Health Organisation (Tổ chức Y tế Thế giới) UCL Giới hạn Luận văn thạc sĩ Lê Thu Nga - CB110170 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Sởi sử dụng cho kiểm định vắc xin Sởi Việt Nam” cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu sản xuất mẫu chuẩn vắc xin Sởi thuộc Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế thực hướng dẫn PGS.TS Lê Thị Luân PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm Tôi nhận đồng ý trưởng nhóm tất thành viên nhóm nghiên cứu việc công bố nội dung thực kết thu Các nội dung nghiên cứu kết trình bày luận văn trung thực rõ ràng Học viên Lê Thu Nga Luận văn thạc sĩ Lê Thu Nga - CB110170 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Lê Thị Luân, phó giám đốc Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin sinh phểm y tế tận tình giúp đỡ em suốt thời gian nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, trưởng mơn Vi sinh hóa sinh - sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, trường ĐH Bách Khoa Hà Nội tận tình bảo cho em suốt trình làm luận văn Em xin cảm ơn thầy cô môn Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền đạt kiến thức cho em trình học tập rèn luyện Trong thời gian học tập nghiên cứu tơi nhận dạy tận tình đầy trách nhiệm tập thể cán nghiên cứu thuộc Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Cuối cùng, cho phép tơi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè quan tâm, cổ vũ cho vững bước đường học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng năm 2013 Học viên Lê Thu Nga Luận văn thạc sĩ Lê Thu Nga - CB110170 MỤC LỤC Chương TỔNG QUAN 1.1 Các nguyên tắc chung sản xuất vắc xin mẫu chuẩn 1.1.1 Mẫu chuẩn quốc tế 1.1.2 Mẫu chuẩn quốc gia 11 1.1.3 Yếu tố có liên quan đến cơng hiệu vắc xin mẫu chuẩn: 12 1.2 Vắc xin mẫu chuẩn sởi 14 1.2.1 Virus sởi vắc xin sởi 14 1.2.1.1 Virus sởi 14 1.2.1.2 Vắc xin sởi 17 1.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất sử dụng vắc xin mẫu chuẩn Sởi 18 1.2.3 Tiêu chuẩn sở cho vắc xin mẫu chuẩn Sởi 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 21 2.2.2 Phương pháp sản xuất vắc xin Sởi bán thành phẩm 22 2.2.3 Phương pháp sản xuất vắc xin thành phẩm sởi 23 2.2.2 Phương pháp kiểm tra chất lượng cho mẫu chuẩn sởi 26 2.2.2.1 Kiểm tra vô trùng 26 2.2.2.2 Kiểm tra Mycoplasma 27 2.2.2.3 Phương pháp chuẩn độ hiệu giá tạo đám hoại tử (PFU) 28 2.2.2.4 Ổn định nhiệt 33 2.2.2.5 Quan sát trạng thái vắc xin 34 2.2.2.6 Kiểm tra độ lệch trọng lượng 35 2.2.2.7 Độ ẩm tồn dư 36 2.2.2.8 Đo pH 38 2.3 Phương pháp lựa chọn vắc xin Sởi mẫu chuẩn nội 39 Chương - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40 3.2 Kết qủa lựa chọn vắc xin sởi mẫu chuẩn 41 3.2.1 Kết kiểm tra chất lượng tính ổn định loạt vắc xin thành phẩm Sởi 41 3.2 Thiết lập phạm vi quản lý hiệu giá cho vắc xin mẫu chuẩn vắc xin Sởi nội 46 3.2.2 Xác định vắc xin mẫu chuẩn dựa tiêu chuẩn nội 46 3.2.3 Ứng dụng vắc xin mẫu chuẩn nội để kiểm tra đối chứng hiệu giá vắc xin Sởi sản xuất năm 2010 đến 2013 52 3.2.3.1 Kết ứng dụng vắc xin mẫu chuẩn nội để kiểm tra đối chứng hiệu giá vắc xin Sởi sản xuất năm 2010 52 3.2.3.2 Kết ứng dụng vắc xin mẫu chuẩn nội để kiểm tra đối chứng hiệu giá vắc xin Sởi sản xuất năm 2011 54 3.2.3.2 Kết ứng dụng vắc xin mẫu chuẩn nội để kiểm tra đối chứng hiệu giá vắc xin Sởi sản xuất năm 2012 57 3.2.3.4 Kết ứng dụng vắc xin mẫu chuẩn nội để kiểm tra đối chứng hiệu giá vắc xin Sởi sản xuất năm 2013 59 KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Luận văn thạc sĩ Lê Thu Nga - CB110170 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Tiêu chuẩn chất lượng vắc xin sởi .19 Bảng 2: Chương trình đơng khơ vắc xin Sởi Polyvac .24 Bảng 3: Số lượng vắc xin bảo quản -700C 41 Bảng 4: Kết kiểm tra chất lượng loạt vắc xin thời điểm sau sản xuất .41 Bảng 5: Kết độ lệch trọng lượng loạt vắc xin ứng cử viên mẫu chuẩn (n=5) 42 Bảng 6: Kết độ ẩm tồn dư loạt vắc xin ứng cử viên mẫu chuẩn (n=5) 44 Bảng 7: Kết kiểm tra hiệu giá ổn định nhiệt (370C/7 ngày) 45 Bảng 8: Kết thiết lập giá trị quản lý mẫu chuẩn nội vắc xin Sởi 47 Bảng 9: Kết kiểm tra độ ẩm tồn dư loạt vắc xin Sởi dự tuyển mẫu chuẩn nội sau năm bảo quản -700C 51 Bảng 10: Kết chuẩn độ hiệu giá mẫu chuẩn R-M0107 năm 2010 52 Bảng 11: Kết chuẩn độ hiệu giá mẫu chuẩn R-M0107 năm 2011 55 Bảng 12: Kết chuẩn độ hiệu giá mẫu chuẩn R-M0107 năm 2012 57 Bảng 13: Kết chuẩn độ hiệu giá mẫu chuẩn R-M0107 năm 2013 59 Luận văn thạc sĩ Lê Thu Nga - CB110170 DANH MỤC HÌNH Hình Cấu tạo hạt virus sởi 15 Hình 2: Vắc xin sởi sản xuất Việt Nam 18 Hình 3: Mầu mơi trường đối chứng (-) 28 Hình 4: Mức độ thay đổi mầu môi trường tương ứng với mức độ (+) 28 Hình 5: Hình ảnh tế bào Vero .29 Hình 6: Bộ thiết bị dùng cho thử nghiệm độ ẩm tồn dư 36 Hình 7: Kết độ lệch trọng lượng loạt vắc xin (sau sản xuất) 43 Hình 8: Kết độ ẩm tồn dư loạt vắc xin (sau sản xuất) 44 Hình 9: Kết kiểm tra hiệu giá ổn định nhiệt 46 Hình 10: Kết thiết lập giá trị quản lý hiệu giá mẫu chuẩn nội vắc xin Sởi loạt M-0107 48 Hình 11: Kết thiết lập giá trị quản lý hiệu giá mẫu chuẩn nội vắc xin Sởi loạt M-0207 49 Hình 12: Kết thiết lập giá trị quản lý hiệu giá mẫu chuẩn nội vắc xin Sởi loạt M-0307 50 Hình 13: Kết độ ẩm tồn dư loạt vắc xin sau năm .51 Hình 14: Hiệu giá mẫu chuẩn R-M0107 năm 2010 .54 Hình 15: Hiệu giá mẫu chuẩn R-M0107 năm 2011 .56 Hình 16: Hiệu giá mẫu chuẩn R-M0107 năm 2012 .58 Hình 17: Hiệu giá mẫu chuẩn R-M0107 năm 2013 .61 Luận văn thạc sĩ Lê Thu Nga - CB110170 MỞ ĐẦU Bệnh sởi bệnh nhiễm trùng cấp tính virus sởi gây nên, lây nhiễm theo đường hô hấp dễ lây thành dịch, đặc biệt trẻ em Bệnh sởi nhận biết từ 2000 năm trước đây, đến năm 860 Zanes phân biệt bệnh sởi khác với bệnh đậu mùa [7] Vài thập kỷ gần đây, Y học đại có nhiều thành tựu việc phòng trừ bệnh dịch Mặc dù vậy, bệnh sởi vấn đề dịch tễ nghiêm trọng Ước tính hàng năm Thế giới có khoảng 50 triệu trường hợp nhiễm bệnh triệu trường hợp tử vong liên quan đến sởi [8,9] Năm 1954, thành công Enders Peebles việc phân lập virus sởi đánh dấu bước tiến nghiên cứu bệnh sởi Việc nghiên cứu dịch tễ học bệnh sởi thực nhiều nước kết cho thấy vắc xin sởi có vai trị then chốt việc phịng bệnh sởi Các chiến dịch tiêm chủng diện rộng phác đồ tiêm vắc xin làm giảm đáng kể tỉ lệ mắc bệnh sởi Tuy nhiên năm gần dịch sởi lại bùng nổ nhiều nước Mỹ, Anh, Canada, nước phát triển, đặc biệt vùng nhiệt đới châu Phi châu Á Việc phòng chống bệnh sởi gặp nhiều khó khăn, dịch bệnh cịn hồnh hành đáng kể Ở Việt Nam, bệnh sởi bệnh nguy hiểm trẻ em năm 2000 có 16.200 trẻ em mắc bệnh sởi [1] Vì từ năm 1982 vắc xin sởi vắc xin đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng để gây miễn dịch chủ động cho trẻ em Mục tiêu cuối chương trình tốn bệnh sởi tồn Thế giới Muốn thực có hiệu chương trình tiêm chủng việc đảm bảo chất lượng vắc xin, có hiệu lực vắc xin quan trọng Từ năm 2007, Việt Nam thức sản xuất vắc xin Sởi Hàng năm, Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế sản xuất khoảng triệu liều vắc xin Sởi để cung cấp cho Chương trình tiêm chủng mở rộng Để kiểm định chất lượng vắc xin, ngồi việc kiểm tra tính vơ khuẩn, an tồn cịn phải xác định nồng độ virus vắc xin (hiệu giá vắc xin) Việc xác định hiệu giá vắc xin thử nghiệm cần tiến hành song song với vắc xin mẫu chuẩn Do đó, vắc xin mẫu chuẩn sinh phẩm khơng thể thiếu trình xác định hiệu giá vắc xin Chuẩn độ hiệu giá Luận văn thạc sĩ Lê Thu Nga - CB110170 thử nghiệm đo hàm lượng virus sởi có vắc xin, thử nghiệm địi hỏi phải có độ xác định Mặt khác virus sởi nhạy cảm với ánh sáng nhiệt độ, q trình chuẩn độ khơng tránh khỏi tác động bên ngồi khơng mong muốn đến kết chuẩn độ hiệu giá Do việc chuẩn độ hiệu giá cần có mẫu chuẩn để làm đối chứng nhằm xác định kết chuẩn độ hiệu giá tin cậy hay không Mẫu chuẩn phải đảm bảo ổn định hiệu giá suốt thời gian bảo quản, hiệu giá phải nằm khoảng giao động cho phép theo toán thống kê Để đảm bảo vắc xin sởi dùng cho trẻ em Việt Nam đạt yêu cầu hiệu giá theo quy định Dược điển Việt Nam IV theo tiêu chuẩn WHO thiết phải sử dụng mẫu chuẩn thực thử nghiệm Để kiểm tra hiệu giá vắc xin Sởi sản xuất Việt Nam, phải sử dụng vắc xin mẫu chuẩn Sởi từ Nhật Bản với chi phí cao bị động nên gây trở ngại lớn cho việc sản xuất, kiểm định, thiết lập mẫu chuẩn điều cần thiết cho sở sản xuất vắc xin Xuất phát từ yêu cầu trên, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Sởi sử dụng cho kiểm định vắc xin Sởi Việt Nam” nhằm giải mục tiêu sau: - Nghiên cứu qui trình sản xuất mẫu chuẩn hiệu giá vắc xin sản xuất ứng cử viên mẫu chuẩn vắc xin Sởi tế bào phơi gà 03 loạt liên tiếp (3 ứng cử viên) mẫu chuẩn; Chia lọ bảo quản ứng cử viên mẫu chuẩn vắc xin nhiệt độ - 700C; - Kiểm tra chất lượng loạt vắc xin dự tuyển mẫu chuẩn nội theo qui chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới; - Thiết lập phạm vi quản lý hiệu giá cho vắc xin mẫu chuẩn vắc xin Sởi nội bộ: chuẩn độ hiệu giá ứng cử viên mẫu chuẩn đưa phạm vi quản lý giá trị hiệu giá; - Ứng dụng vắc xin Sởi mẫu chuẩn nội để đánh giá chất lượng vắc xin Sởi sản xuất Việt Nam từ năm 2010 đến 2013 KẾT QUẢ THIẾT LẬP PHẠM VI QUẢN LÝ HIỆU GIÁ M-0307 Lg PFU/0,5mL 4,8 4,6 4,4 4,2 3,8 M-0307 Thấp M16-6 10 11 Cao 12 13 14 15 Tiêu chuẩn Hình 12: Kết thiết lập giá trị quản lý hiệu giá mẫu chuẩn nội vắc xin Sởi loạt M-0307 Nhìn hình 12 bảng 8, ta thấy giá trị hiệu giá loạt vắc xin M-0307 15 lần kiểm tra thời điểm khác đạt yêu cầu lớn giá trị hiệu giá tiêu chuẩn vắc xin mẫu chuẩn (>4 lgPFU/0,5mL) có giá trị SD = 0,11 thỏa mãn điều kiện SD ≤ 0,25 Như vậy, loạt vắc xin Sởi M-0307 đủ điều kiện vắc xin mẫu chuẩn nội Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế Ngoài việc tiến hành kiểm tra hiệu giá 15 lần (sau năm bảo quản -700C) loạt vắc xin dự tuyển mẫu chuẩn nội để thiết lập phạm vi quản lý hiệu giá cho loạt, chúng tơi cịn tiến hành kiểm tra độ ẩm tồn dư chúng để khẳng định tính ổn định sản phẩm Kết kiểm tra độ ẩm tồn dư loạt vắc xin dự tuyển mẫu chuẩn nội sau năm bảo quản -700C thể bảng 50 Bảng 9: Kết kiểm tra độ ẩm tồn dư loạt vắc xin Sởi dự tuyển mẫu chuẩn nội sau năm bảo quản -700C Loạt M-0107 Lần M-0307 Kết 0,55 % 0,48 % < 2% Trung bình Đánh giá Đạt 0,57% Đạt 0,67 % Đạt 0,43 % Đạt 0,39 % 0.68 % Đạt 0,29 % Đạt 0,55 % 0,19 % M-0207 Tiêu chuẩn 0,41% 0,34% Đạt Đạt Đạt Hình 13: Kết độ ẩm tồn dư loạt vắc xin sau năm Kết bảng hình 13 cho thấy: loạt M-0107 có độ ẩm tồn dư trung bình 0,57%; loạt M-0207 có độ ẩm tồn dư trung bình 0,41%; loạt M-0307 có độ ẩm tồn dư trung bình 0,34% Như vậy, loạt vắc xin dự tuyển mẫu chuẩn đạt tiêu chuẩn độ ẩm tồn dư (