Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn kháng vi nấm gây bệnh phân lập từ vùng rễ cây trồng ở việt nam và ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN KHÁNG VI NẤM GÂY BỆNH PHÂN LẬP TỪ VÙNG RỄ CÂY TRỒNG Ở VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG LÊ THỊ HỒNG MINH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM VIỆT CƯỜNG LÊ VĂN NHƯƠNG HÀ NỘI - 2009 MỞ ĐẦU Hàng năm, bệnh gây tổn thất to lớn cho nông nghiệp, chúng phá huỷ đến 537,3 triệu loại nông sản chủ yếu,chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp Thế giới Đã có 11000 loại bệnh phát hiện, nguyên nhân khoảng 120 chi nấm, 30 loại virut chi vi khuẩn Thiệt hại nấm hại chiếm khoảng 80% tổng thiệt hại mùa màng, làm giảm suất từ 10% (ở Ấn Độ, Tây Ban Nha) đến 40% (ở Tunisia), bệnh Fusarium gây chiếm tỷ lệ tương đối lớn [22] Fusarium oxysporum tác nhân gây bệnh chết héo, tắc mạch dẫn thối rễ thối thân nhiều loại trồng như: lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, Nền nông nghiệp nước ta có vai trị quan trọng, khơng cung cấp lương thực, thực phẩm, mà tạo hàng hố có giá trị xuất cao, đặc biệt công nghiệp như: tiêu, bông, cà phê… Tuy nhiên, suất chất lượng trồng phải đối mặt với nhiều vấn đề khó khăn, đặc biệt bệnh trồng nấm gây Theo kết nghiên cứu Viện Bảo vệ thực vật, Việt Nam có khoảng 1000 lồi vi sinh vật gây bệnh, điển loại bệnh héo vàng héo xanh khoai tây, cà chua vi khuẩn, vi nấm gây ra.Trong số 24 bệnh lúa Việt nam, có tới 13 bệnh có nguồn gốc từ nấm, chủ yếu nấm đạo ôn (Magnaporthe grisea), khô vằn (Rhizoctonia solani) thối thân, thối rễ (F oxysporum) số F oxysporum loài phổ biến thường gặp gây nên bệnh thối rễ, thân héo vàng cho nhiều loài Điển hình, năm 1997 Lục Ngạn-Lục Nam (tỉnh Bắc Giang) có nhiều vải thiều bị chết đột ngột, nguyên nhân gây chết nấm gây bệnh thối cổ rễ Fusarium sp kí sinh [19] Nhờ khả hoại sinh chất hữu mà F oxysporum sống sót qua chu kì mùa vụ Chúng thường sống phát triển tốt điều kiện khí hậu ấm, úng nước, phổ biến đất cát axit, phát tán bào tử nhờ gió nước Thường khó kiểm sốt bệnh phương pháp đơn lẻ Một vài phương pháp sử dụng thay đổi pH đất, chế độ tưới tiêu, luân canh, bón phân sử dụng thuốc diệt nấm viêc sử dụng thuốc diệt nấm lâu dài có hệ thống dẫn đến nhiễm môi trường kháng thuốc tác nhân gây bệnh Đối mặt với vấn đề đó, việc sử dụng tác nhân sinh học để kiểm soát dịch bệnh nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu việc sử dụng vi sinh vật đối kháng để ức chế tác nhân gây bệnh cho từ đất tiến hành số chủng đối kháng thương mại hoá Phương pháp sử dụng vi sinh vật bảo vệ môi trường khơng mang lại hiệu cao, an tồn, sản phẩm thu hoạch không ảnh hưởng tới người sử dụng, có lợi cho cân sinh thái, mà cịn làm giảm phần lớn lượng thuốc hoá học sử dụng Việt Nam nước nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, với đặc trưng khí hậu nóng ẩm, lượng mưa hàng năm lớn, điều kiện thuân lợi cho vi sinh vật mà điển hình nấm bùng phát, gây hại cho trồng, dẫn đến tổn thất lớn cho sản xuất nông nghiệp Mỗi năm chi phí việc phịng, trừ bệnh cao mà phần lớn sử dụng thuốc hoá học Trên thực tế phương pháp có hiệu tức thời sử dụng lâu dài sễ dẫn đến tình trạng thối hố đất kháng thuốc nguồn bệnh Vì vậy, biện pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng giải pháp thiết thực để có nơng nghiệp bền vững Với ý nghĩa thực tiễn trên, tiến hành nghiên cứu đề tài” Nghiên cứu số chủng vi khuẩn kháng vi nấm gây bệnh phân lập từ vùng rễ trồng Việt Nam ứng dụng.” Mục đích nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn định loại chủng vi khuẩn mang tính kháng F oxysporum số tác nhân gây bệnh trồng Xác định thơng số lên men thích hợp: môi trường, nhiệt độ, thời gian, chế độ sục khí - Nghiên cứu tách dịng giải trình tự gen PhlD tham gia vào sinh tổng hợp chất đối kháng - Nghiên cứu thử nghiệm quy mô nhỏ để khẳng định hoạt tính kháng vi nấm gây bệnh chủng vi khuẩn có ích phân lập được, việc bảo vệ thực vật trước tác nhân gây bệnh Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi khuẩn có khả kháng F oxysporum từ đất trồng số loại cây: cà phê, bông, cà chua, lạc - Tuyển chọn xác định số hoạt tính chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao - Định loại phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen rpoB gen 16S ADN riboxom) nghiên cứu quan hệ phát sinh lồi chủng triển vọng - Tách dịng giải trình tự gen PhlD mã hố cho 2,4diacetylphloroglucinol hoạt chất có khả diệt nấm - Nghiên cứu ảnh hưởng chủng triển vọng lên qui mơ phịng thí nghiệm, thử nghiệm độ an tồn chủng nghiên cứu lên chuột nhắt trắng giống Swiss - Xác định sô thông số như: nhiệt độ, pH môi trường, thời gian lên men chế độ sục khí… ảnh hưởng đến trình lên men thu sinh khối để phục vụ cho trình sản xuất chế phẩm - Nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn vào sản xuất thử nghiệm chế phẩm đối kháng, thử nghiệm tác động chế phẩm lên chậu vại lạc cà chua qui mô nhỏ đồng ruộng Những đóng góp luận án Đã định loại chủng vi khuẩn có triển vọng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự gen 16S ADN riboxom Đặc biệt ứng dụng phương pháp giải trình tự gen rpoB mã hoá cho tiểu phần β ARN polymeraza để định loại chủng vi khuẩn phân lập, góp phần làm phong phú ngân hàng gen Việt Nam Đã tạo dịng xác định trình tự nucleotit gen PhlD mã hoá cho 2,4-diacetylphloroglucinol, hoạt chất quan trọng có khả diệt nấm tốt Từ nghiên cứu ban đầu cho thấy chủng triển vọng không gây hại cho trồng động vật Vì thế, chúng ứng dụng vào sản xuất thử nghiệm chế phẩm đối kháng qui mô nhỏ đồng ruộng Đây nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn, đặc biệt việc chống lại vi nấm gây bệnh trồng nhằm bảo vệ thực vật, hướng tới nông nghiệp bền vững CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH CÂY 1.1.1 Tác hại bệnh Ở kỷ thứ trước công nguyên Theophraste nói tới tác hại số bệnh hại Những nghiên cứu chất nguyên nhân gây bệnh biện pháp phòng trừ đơn giản tiến hành từ kỷ 18 M.Tillet (1775) B Prevost (1870) ngưởi nghiên cứu bệnh than đen lúa mì Tác phẩm khoa học bệnh cây, đặt móng ban đầu cho hình thành phát triển mơn khoa học Anton de Bary công bố vào năm 1853 Từ đó, khoa học bệnh phát triển tồn diện sâu rộng Hội nghị quốc tế bệnh lần thứ tổ chức Luân đôn (8/1968) đánh dấu thời kỳ phát triển hợp tác quốc tế nghiên cứu bệnh toàn giới [17] Dịch bệnh mốc sương khoai tây (Phytophthora infestans D B) phá hại khủng khiếp Aixơlen vào năm 1854-1847 Ở nước ta, từ năm 1957 đến trải qua nhiều đợt dịch bệnh đạo ôn hại lúa, bệnh bạc vi khuẩn, bệnh vàng virus, bệnh khô vằn,… gây tổn thất lớn sản phẩm thu hoạch, làm ổn định suất nhiều giống lúa tốt Bệnh mốc sương, bệnh xoăn lá, bệnh chết héo bênh thường xuyên gây thiệt hại có tới 60-100% suất cà chua, khoai tây số trồng khác Tóm lại, tác hại bệnh thể mặt sau đây: - Làm giảm rõ rệt suất thu hoạch trồng - Làm giảm phẩm chất nông sản thu hoạch cất trữ - Làm ảnh hưởng đến đất đai trồng trọt, cấu giống trồng, chế độ luân canh, tính chất hoạt động thành phần vi sinh vật đất, sử dụng nhiều thuốc hóa học độc hại để phòng trừ bệnh, xử lý đất trồng Một số bệnh hại nơng sản cịn sinh độc tố có ảnh hưởng xấu trực tiếp đến sức khỏe đời sống người, gia súc sử dụng Độc tố aflatoxin bệnh mốc vàng hại lạc (Aspergillus flavus) gây bệnh ung thư gan người động vật 1.1.2 Định nghĩa bệnh Một khỏe sinh trưởng phát triển bình thường theo chất di truyền vốn có điều kiện sống phù hợp thỏa mãn đầy đủ yêu cầu cần thiết Khi thể thống bị phá vỡ, trồng sinh trưởng phát triển tốt, biểu triệu chứng bên bên tượng suy giảm sinh lý, ngừng trệ sinh trưởng, cịi cọc, giảm sút suất chí gây chết lụi Tất biến đổi không phù hợp mô tế bào dẫn tới phân hủy chức sinh lý cấu tạo ảnh hưởng tác động ngoại cảnh bất lợi gọi “quá trình bệnh lý” Điều để xét tình trạng bệnh phải vào trình bệnh lý có tính chất biến đồng, liên tục diễn Có thể định nghĩa bênh sau: “Bệnh trạng thái khơng bình thường có q trình bệnh lý biến động liên tục xảy yếu tố ngoại cảnh không phù hợp ký sinh vật gây ra, dẫn đến phá hủy chức sinh lý, cấu tạo, giảm sút suất, phẩm chất trồng” 1.1.3 Khái niệm đặc tính ký sinh tính gây bệnh vi sinh vật gây bệnh 1.1.3.1 Khái niệm tính ký sinh Vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm tác động vào đường khác nhau: - Chúng sử dụng vật chất dinh dưỡng để thỏa mãn yêu cầu đời sống chúng - Có thể xâm hại rễ, hệ thống bó mạch gây phá hủy trình vận chuyển chất dinh dưỡng - Chúng sản sinh hoạt chất sinh học, thực chất độc tố enzym để tác động phân giải đầu độc tế bào trồng, phá hủy enzym trình trao đổi chất bệnh 1.1.3.2 Khả gây bệnh vi sinh vật gây bệnh Khả gây bệnh vi sinh vật trồng đặc tính: tính xâm nhiễm, tính gây bệnh tính độc định * Tính xâm nhiễm: Là khả công phá đột nhập ký sinh vật vào bên cây, vượt qua cản trở phản ứng chống đối tự vệ đến tiến hành bước đầu q trình xâm nhiễm * Tính gây bệnh: Là khả sinh trưởng dinh dưỡng, phát triển lan rộng mô thực vật làm cho nhiễm bệnh, gây tác động bệnh lý tạo triệu chứng bệnh đặc trưng * Tính độc: Là khái quát hai khái niệm tính xâm nhiễm tính gây bênh, biểu mức độ gây hại mức độ lây nhiễm loại ký chủ phân hóa giống khác lồi Thơng thường loại ký sinh có tính xâm nhiễm cao tính gây bệnh cao loại có tính độc cao Tuy nhiên có số trường hợp khơng hồn tồn Hơn nữa, loại ký sinh vật có tính độc cao giống mà khơng có tính độc giống khác lồi Sự khác tính độc thường thể chủng sinh lý nịi sinh học khác lồi ký sinh sở để xác định phát chủng, nòi khác ký sinh vật Nguyên nhân sinh vật gây bệnh chủ yếu nhất, phổ biến loại virus, vi khuẩn, nấm ký sinh vài loại khác.[17] 1.2 VI NẤM GÂY BỆNH Ở THỰC VẬT 1.2.1 Nấm mốc Nấm mốc vi sinh vật nhân thật, thể tản (thalophyte), tế bào khơng có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu chitin Nấm học (Mycology) khai sinh nhà thực vật học người Ý, Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống lạ” (Nova Plantarum Genera) Nhưng theo giáo sư Eriksson Gunnan (1978), người có cơng nghiên cứu sâu nấm mốc lại Elias Fries (1794 - 1874) Theo Elizabeth Tootyll (1984), nấm mốc có khoảng 5.100 chi 50.000 lồi mơ tả, nhiên, ước tính có 100.000 đến 250.000 lồi nấm diện trái đất [106] Nhiều lồi nấm mốc có khả ký sinh nhiều ký chủ động vật, thực vật, đặc biệt người, trồng, vật nuôi, sản phẩm sau thu hoạch chưa qua chế biến, bảo quản Một số tác nhân gây bệnh, làm hư thiết bị thủy tinh bảo quản không tốt, có nhiều lồi có ích tổng hợp acit hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, kích thích tố tăng trưởng thực vật… đưa vào sản xuất cơng nghiệp có số nấm dùng làm đối tượng nghiên cứu di truyền học 1.2.1.1 Hình thái kích thước Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành hệ sợi chằng chịt phát triển nhanh gọi khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm Nấm mốc có loại khuẩn ti: khuẩn ti khí sinh mọc bề mặt mơi trường, từ sinh quan sinh sản Khuẩn ti chất mọc sâu vào môi trường Hai loại khuẩn ty đóng vai trị nhiệm vụ khác nhau, khuẩn ty chất có nhiệm vụ rễ xanh, khuẩn ty khí sinh lại đóng vai trị sinh sản chủ yếu 1.2.1.2 Sinh sản Hình 1.1 Sinh sản bào tử nấm Nấm mốc có hình thức sinh sản chính: *Sinh sản sinh dưỡng - Sinh sản sinh dưỡng khuẩn ti: hình thức từ khuẩn ti gãy đoạn nhỏ, đoạn nhỏ xuất hay nhiều tế bào hình cầu có màng dày bao bọc, bên có nhiều chất dự trữ Khi gặp điều kiện thuận lợi tiếp tục phát triển thành hệ sợi nấm - Sinh sản sinh dưỡng hạch nấm: Hạch nấm thường có hình trịn hình bầu dục khơng đều, màu tối Bên tổ chức sợi xốp thường màu trắng, kích thước tuỳ theo lồi Hạch nấm tổ chức giúp cho nấm sống qua điều kiện ngoại cảnh bất lợi Sợi nấm tồn hạch không phát triển Khi gặp điều kiện thuận lợi hạch nảy mầm phát triển bình thường 126 101 Thompson J P., Higgins D G., Gibson T J (1994) “Clustal W: Improving the sensitivity of progessive multuple sequence alignment through sequence weighting position specific gap panaties weight matrix choice” Nucleic acid Rev., 22, pp 46734680 102 Thrane C, MN Nielsen, J Sorensen, S Olsson (2001), “Pseudomonas fluorescens DR54 reduces sclerotia formation, biomass development and disease incident of Rhizoctonia solani causing damping-off in sugar beet” Microbiol Ecol, 32(3), Pubmed, Abstract 103 Vivek K., Ling-Ling L., Serban I., Marcie R H., Audrey W., Barry N K., and James M M (1994), “Characterization by Automated DNA Sequencing of Mutations in the Gene (rpoB) Encoding the RNA Polymerase β Subunit in Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains from New York City and Texas”, Journal of Clinical Microbiology, 32(4), pp 1095-1098 104 Watson, S.W., Bock, E., Harms, H., Koops, H., and Hooper, A.B (1989), Nitrifying bacteria In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Staley J T, Bryant P.M, Pfennig N P, Holt G J (eds), Williams & Wilkins, Batimore pp 1808-1834 105 Weller D.M (1988), Biological control of soilborn plant pathogens in the rhizosphere with bacteria” Annu Rev Phytopathol., 26, pp 379-407 106 Yu T W., Shen Y., Daniel R M, Floss H G., Khosla C., Hopwood D A., Moore B.S., J Am (1998), Chem, Soc , 120, pp 7749-7759 127 107 Zadoks J.C (2001), “Plant dieas epidemiology in the twentieth century A picture by means of selected controversies” Plant disease, 85(8), pp 808-814 128 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH CÂY 1.1.1 Tác hại bệnh 1.1.2 Định nghĩa bệnh 1.1.3 Khái niệm đặc tính ký sinh tính gây bệnh vi sinh vật gây bệnh 1.1.3.1 Khái niệm tính ký sinh 1.1.3.2 Khả gây bệnh vi sinh vật gây bệnh 1.2 VI NẤM GÂY BỆNH Ở THỰC VẬT 1.2.1 Nấm mốc 1.2.1.1 Hình thái kích thước 1.2.1.2 Sinh sản 1.2.2 Khái quát nấm gây bệnh 11 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý Fusarium oxysporum .13 1.2.4 Cơ chế gây bệnh biểu .15 1.3 VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG 16 1.3.1 Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng chống nấm gây bệnh giới nước .16 1.3.2 Vi khuẩn đối kháng .19 1.3.3 Cơ chế tác động vi khuẩn đối kháng 20 1.3.4 Các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng kháng nấm 22 1.3.5 Những nghiên cứu trình tự gen PhlD 27 1.3.6 Quá trình mã hoá 2,4- DAPG hệ gen vi sinh vật 28 1.4 ĐỊNH LOẠI VI KHUẨN BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ 16S ARN RIBOXOM VÀ RPOB 31 1.4.1 Phân loại vi sinh vật 31 129 1.4.2 Phát sinh loài dựa tiêu chuẩn 16S ARN riboxom 32 1.4.3 Sử dụng gen rpoB định loại vi khuẩn 34 1.4.3.1 Giới thiệu chung ARN polymeraza 34 1.4.3.2 Cấu tạo vị trí gen rpoB 36 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38 2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 38 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 38 2.1.2 Vật liệu 38 2.1.3 Hóa chất thiết bị 39 2.2 PHƯƠNG PHÁP 40 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu vi sinh hoá sinh .40 2.2.1.1 Phân lập vi khuẩn đối kháng 40 2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 40 2.2.1.3 Nuôi cấy lưu giữ chủng vi khuẩn 41 2.2.1.4 Xác định khả lên men oxy hóa 41 2.2.1.5 Khả sử dụng loại đường 42 2.2.1.6 Nhuộm Gram 42 2.2.1.7 Xác định hoạt tính catalaza 42 2.2.1.8 Xác định khả phân giải tinh bột 42 2.2.1.9 Khả sử dụng citrat 43 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 43 2.2.2.1 Quy trình tách chiết ADN genom vi khuẩn 43 2.2.2.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại 43 2.2.2.3 Thiết kế tổng hợp đoạn mồi 44 2.2.2.4 Kỹ thuật PCR 44 2.2.2.5 Điện di ADN gel agaroza 45 2.2.2.6 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ 45 130 2.2.2.7 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.coli chủng TOP10F 46 2.2.2.8 Tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn 47 2.2.2.9 Phản ứng cắt ADN với enzym hạn chế 47 2.2.2.10 Tinh ADN plasmid 47 2.2.2.11 Xác định trình từ nucleotit gen 48 2.2.2.12 Xử lý trình tự ADN phân tích số liệu phần mềm máy tính 49 2.2.3 Phương pháp thử nghiệm .49 2.2.3.1 Phương pháp thử nghiệm chế phẩm kháng nấm gây bệnh đồng ruộng cà chua lạc 49 2.2.3.2 Phương pháp thử độ an toàn chủng lên chuột nhắt trắng 52 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÝ SINH, HOÁ SINH CỦA CÁC CHỦNG NGHIÊN CỨU 54 3.1.1 Phân lập tuyển chọn 54 3.1.2 Xác định số đặc điểm lý sinh, hoá sinh chủng nghiên cứu .59 3.2 TÁCH DỊNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 16S rARN VÀ RPOB CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU 64 3.2.1 Tách ADN genom từ vi khuẩn 64 3.2.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR 65 3.2.3 Tách dịng giải trình tự 16S ADN riboxom chủng DC53, DC29, H10 TH10 66 3.2.3.1 Nhân gen 16S ADN riboxom 66 3.2.3.2 Tạo dòng mang gen 16S ADN riboxom 66 3.2.3.3 Giải trình tự gen dựng phân loại chủng DC53, DC29, H10 TH10 68 3.2.4 Tách dòng giải trình tự gen rpoB chủng H6, H16 75 131 3.2.4.1 Nhân gen rpoB kỹ thuật PCR 75 3.2.4.2 Tạo dòng mang gen rpoB hai chủng H16 ,H6 76 3.2.4.3 Giải trình tự gen dựng phân loại chủng H16 ,H6 77 3.3 TÁCH DÒNG GEN PhlD CỦA CHỦNG DC53 80 3.3.1 Nhân gen PhlD kỹ thuật PCR 81 3.3.2 Tạo dịng giải trình tự gen PhlD 82 3.4 THỬ NGHIỆM CÁC CHỦNG NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY BÔNG VÀ CHUỘT NHẮT TRẮNG 85 3.4.1 Thử nghiệm chủng nghiên cứu lên 87 3.4.2 Thử độ an toàn chủng nghiên cứu lên chuột nhắt trắng 89 3.4.2.1 Trọng lượng thể chuột 90 3.4.2.2 Tiêu thụ thức ăn nước uống chuột 94 3.4.2.3 Quan sát dấu hiệu ngộ độc: 94 3.5 NGHIÊN CỨU CÁC THÔNG SỐ CƠ BẢN ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN 94 3.5.1 Nghiên cứu khả tồn đất chủng .94 3.5.2 Nghiên cứu thông số ảnh hưởng đến trình lên men .96 3.5.2.1 Lựa chọn môi trường lên men 96 3.5.2.2 Xác định thông số nhiệt độ lên men 98 3.5.2.3 Ảnh hưởng pH môi trường lên phát triển vi khuẩn 99 3.5.2.4 Lựa chọn chế độ sục khí 100 3.6 THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM VI SINH LÊN ĐỒNG RUỘNG 101 3.6.1 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm 101 3.6.2 Ảnh hưởng chế phẩm quy mô chậu vại 102 3.6.3 Kết thử nghiệm chế phẩm lên cà chua 103 3.6.4 Kết thử nghiệm chế phẩm lên lạc 104 KẾT LUẬN 108 132 NHỮNG CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 A Tiếng Việt 112 B Tiếng nước .114 133 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thơng tin trình tự mồi gen PhlD 28 Bảng 1.2 Các thành phần roboxom nhóm nhân sơ nhân thật 33 Bảng 2.1 Địa điểm thời gian bắt đầu phân lập 38 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 44 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng để xác định trình tự 48 Bảng 3.1 Hình thái tế bào chủng phân lập 54 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng Fusarium oxysporum số chủng phân lập 55 Bảng 3.3 Khả kháng số nguồn bệnh chủng vi khuẩn 57 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nghiên cứu 60 Bảng 3.5 Một số tính chất chủng nghiên cứu 63 Bảng 3.6 Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN(µg/ml) chủng nghiên cứu 65 Bảng 3.7 Trình tự thơng số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 65 Bảng 3.8 Các chủng ngân hàng gen quốc tế dùng để so sánh 69 Bảng 3.9 Các chủng ngân hàng gen quốc tế dùng để so sánh 71 Bảng 3.10 Các chủng Ngân hàng gen quốc tế dùng để so sánh 73 Bảng 3.11 Các chủng ngân hàng gen quốc tế dùng để so sánh 74 Bảng 3.12 Các chủng Ngân hàng gen quốc tế dùng để so sánh 77 Bảng 3.13 Các chủng Ngân hàng gen quốc tế dùng để so sánh 78 Bảng 3.14 Bố trí thí nghiệm thứ độc tính cấp mẫu 90 Bảng 3.15 Kết theo dõi trọng lượng chuột sau 10 ngày uống dịch nuôi chủng DC53 90 Bảng 3.16 Kết theo dõi trọng lượng chuột sau 10 ngày uống dịch nuôi chủng DC29 92 Bảng 3.17 Kết theo dõi trọng lượng chuột sau 10 ngày uống dịch nuôi chủng H10 93 134 Bảng 3.18 Sự biến đổi mật độ chủng vi khuẩn đất 95 Bảng 3.19 Mật độ chủng nghiên cứu môi trường NB 96 Bảng 3.20 Mật độ chủng nghiên cứu môi trường LB 96 Bảng 3.21 Mật độ chủng nghiên cứu môi trường MT1 97 Bảng 3.22 Ảnh hưởng nhiệt độ lên mật độ chủng nghiên cứu 98 Bảng 3.23 Ảnh hưởng pH lên phát triển chủng DC53, DC29 H10 99 Bảng 3.24 Mật độ ba chủng nghiên cứu MT1 theo lưu lượng khí 100 Bảng 3.25 Các thành phần cho trình lên men 101 Bảng 3.26 Ảnh hưởng chế phẩm lên phát triển rễ chiều cao sau 30 ngày nảy mầm 102 Bảng 3.27 Kết xử lý chế phẩm lên bệnh héo rũ thối thân thối rễ cà chua HTX Tiền Phong – Mê Linh – Vĩnh Phúc – Vụ Xuân 2008 103 Bảng 3.28 Hiệu lực trừ bệnh chế phẩm 104 Bảng 3.29 Kết xử lý chế phẩm lên bệnh héo rũ bệnh thối rễ HTX Cổ Đông – Sơn Tây – Hà Tây – Vụ Xuân 2008 105 135 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sinh sản bào tử nấm Hình 1.2 Hình dạng khuẩn lạc Fusarium oxysporum 13 Hình 1.3 Bào tử F oxysporum 14 Hình 1.4 Cây cà chua bị nhiễm F oxysporum 15 Hình1.5 Cấu trúc hố học kháng sinh tự nhiên nhân tố kháng nấm 23 Hình 1.6 Quá trình sinh tổng hợp số hoạt chất kháng nấm 25 Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp 2.4- DAPG 30 Hình 1.8 Mơ hình chức riboxom 34 Hình 1.9 Vị trí gen rpoB 36 Hình 3.1 Khả kháng F oxysporum chủng nghiên cứu 58 Hình 3.2 Khả đối kháng chủng nghiên cứu 59 Hình 3.3 Khả lên men glucoza có parafin lỏng chủng TH10, H16, H10, H6, DC29 DC53 60 Hình 3.4 Khả lên men glucoza khơng có parafin lỏng chủng TH10, H16, H10, H6, DC29 DC53 61 Hình 3.5 Khả phân giải gelatin chủng TH10, H16, H10, H6, DC29 DC53 61 Hình 3.6 Khả sử dụng citrat làm nguồn cacbon chủng DC53 H16 62 Hình 3.7 Điện di đồ ADN genom chủng nghiên cứu 64 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S ADN riboxom chủng 66 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt ADN plasmid tái tổ hợp 67 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại chủng TH10 70 Hình 3.11 Cây phát sinh chủng loại chủng H10 71 Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại chủng DC53 73 Hình 3.13 Cây phát sinh chủng loại chủng DC29 75 136 Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR gen rpoB chủng H16 ,H6 76 Hình 3.15 Sản phẩm plasmid – rpoB sau xử lý EcoR I 76 Hình 3.16 Cây phân loại chủng H16 78 Hình 3.17 Cây phân loại chủng H6 79 Hình 3.18 Điện di đồ sản phẩm PCR chủng ĐC53 81 Hình 3.19 Sản phẩm plasmid - PhlD sau xử lý EcoR I 82 Hình 3.20 Khả đối kháng F oxysporum H10, TH10,H6 H16 88 Hình 3.21 Khả đối kháng F oxysporum DC29 DC53 88 Hình 22 Biểu lô chuột thử nghiệm với chủng DC53 sau 10 ngày uống 91 Hình 23 Biểu lô chuột thử nghiệm với chủng DC29 sau 10 ngày uống 92 Hình 3.24 Biểu lô chuột thử nghiệm với chủng H10 sau 10 ngày uống 93 Hình 3.25 Bộ rễ bơng trồng chậu bổ sung chế phẩm chủng vi khuẩn 102 137 PHỤ LỤC I ẢNH THÍ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM ĐẾN CÂY BÔNG TRONG ĐIỀU KIỆN CHẬU VẠI 138 II CÁC MÔI TRƯỜNGDÙNG TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU + Mơi trường dùng cho q trình phân lập tuyển chọn * Môi trường King B đặc (g/l) Pepton K2 HPO4 Thạch 20 1,5 16 Glycerin 10 MgSO4.7H2O 1,5 pH 7,2 *Môi trường WA (Waksman) (g/l) Peptôn Glucose 16 Cao thịt NaCl Thạch 16 pH 6,8-7 * Môi trường SPA (g/l) Saccaroza 20 K2HPO4.3H2O 0,5 Pepton MgSO4.7H2O 0,25g Agar 16 pH *Czapek-Dox Nano3 3g K2HPO4.3H2O 1g KCl 0,5g FeSO4 0,01g MgSO4.7H2O 0,5g Saccaroza 20g pH 6,5 * LB (Lauria Betani) Cao men 5g 139 Tryptone 10g NaCl 5g pH - Mơi trường xác định hoạt tính CMC 0,2% KNO3 0,5% KH2PO4 0,35% MgSO4 0,0625% Cao men 0,025% pH * Mơi trường hóa lỏng gelatin Pepton 5g Cao thịt 5g Gelatin 4% Đun tan, điều chỉnh pH cho vào ống nghiệm 5ml mơi trường, sau khử trùng * Môi trường MS: môi trường Murashige Skoog Tên hóa chất mg/lít KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 II III I IV NaEDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 glysin 170 Inositol 100 CaCl2.2H2O 440 Nicotinic acid 0,5 H3BO3 6,2 B1 0,5 MnSO4 22,3 B6 0,5 ZnSO4 8,6 V 140 KI 0,83 NaMoO4 0,25 CuSO4 0,025 CoCl2 0,025 I, II, III, IV sau pha đươc khử trùng sạch, V lọc màng lọc khuẩn * Môi trường NB(Nutrient broth) Cao thịt 3g Tryptone 5g NaCl 5g pH * * Môi trường NB(Nutrient agar) Cao thịt 3g Tryptone 5g NaCl 5g Agar 15g pH * Môi trường MT1 Glucoza 5g Pepton 10g NaCl 5g pH ... tiến hành nghiên cứu đề tài” Nghiên cứu số chủng vi khuẩn kháng vi nấm gây bệnh phân lập từ vùng rễ trồng Vi? ??t Nam ứng dụng. ” Mục đích nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn định loại chủng vi khuẩn mang... đầu nghiên cứu áp dụng Vi? ??c bảo vệ trồng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh thu kết khả quan Nghiên cứu sử dụng chủng Streptomyces longisporus 198a để phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn. .. Tuyển chọn nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm gây bệnh thực vật [11] Định loại nghiên cứu chế kháng nấm F oxysporum gây bệnh trồng số chủng vi khuẩn Pseudomonas