Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Văn Nhân NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ) TRONG RAU XANH Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 9.44.01.18 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Nguyễn Quang Trung Người hướng dẫn khoa học 2: TS Vũ Đức Nam Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 202… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật xem giải pháp tốt nơng nghiệp để thúc đẩy nhanh q trình tăng trưởng lạm dụng hóa chất dẫn đến tồn dư thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhà khoa học giới quan tâm, nghiên cứu ứng dụng từ nhiều năm Việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật sản xuất nông nghiệp diễn phổ biến Việt Nam, nhiên, cơng trình cơng bố nghiên cứu phương pháp phân tích đánh giá dư lượng chất sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt rau xanh Mặt khác, có nhiều loại thuốc điều hịa sinh trưởng thực vật khơng có nhãn mác nguồn gốc xuất xứ nông dân truyền tai sử dụng hiệu nhanh chóng vượt trội chúng mang lại cho trồng Đây nguyên nhân tiềm ẩn gây nên tình trạng ngộ độc thực phẩm ô nhiễm môi trường liên quan đến dư lượng hóa chất sử dụng sản xuất nông nghiệp Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng phát triển phương pháp phân tích số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) rau xanh” Nghiên cứu thành công tiền đề cho việc phát triển ứng dụng phương pháp phân tích đánh giá dư lượng thực trạng sử dụng chất kích thích sinh trưởng thực vật loại rau xanh, sản phẩm nông nghiệp trái sản xuất nước ta nhập từ nước giới Đây sở giúp quan chức năng, nhà quản lý ban hành chế tài có phương thức giám sát việc sử dụng chất kích thích sinh trưởng thực vật sản xuất nơng nghiệp cách hiệu quả, đảm bảo phát triển sản xuất, an tồn cho người tiêu dùng mơi trường sinh thái Mục tiêu nghiên cứu luận án  Nghiên cứu xây dựng phát triển phương pháp phân tích đồng thời hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật rau xanh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối với detector khối phổ bẫy ion  Áp dụng phương pháp xây dựng để phân tích, đánh giá trạng sử dụng, mức độ tồn dư khả tích lũy số chất kích thích sinh trưởng thực vật sử dụng rau số quận/ huyện Hà Nội Các nội dung nghiên cứu luận án 1) Khảo sát điều kiện tối ưu phương pháp phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật rau, gồm: điều kiện vận hành thiết bị sắc ký lỏng khối phổ điều kiện phương pháp xử lý mẫu 2) Xây dựng phương pháp phân tích đánh giá thông s ố phương pháp 3) Đánh giá trạng dư lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau xanh thu thập Hà Nội 4) Đánh giá ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thực vật đến sinh trưởng phát triển số loại rau mức độ tích lũy chúng rau xanh CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật Chất kích thích sinh truởng thực vật (KTST) nhóm hợp chất hữu như: auxin, gibberellin, cytokinin, brassinosteroid, jasmonate, salicyclic acid strigolactone ; có tác dụng kích thích q trình sinh trưởng phát triển [1] Những chất tác động lên sinh trưởng trồng theo chế: (1) Kích thích tăng trưởng thể tích tế bào lá, thân, [2-4]; (2) Kích thích hình thành tế bào mới, làm tăng cường nảy chồi, đâm rễ, hoa [5-7]; (3) Bổ sung tăng cường hoạt động men trình sinh tổng hợp cách cung cấp thêm chất vi lượng Fe, Mn, Cu, Bo, Zn… [1] 1.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý chất kích thích sinh trƣởng thực vật - Auxin hoocmon thực vật có nguồn gốc từ axit amin tryptophan, xác định phân lập mặt hóa học vào năm 1930 Auxin có tất phận với nồng độ khác nhau, đó, nồng độ auxin vị trí thơng tin quan trọng phát triển, điều chỉnh chặt chẽ thông qua trình trao đổi chất vận chuyển - Gibberellin axit diterpenoid tổng hợp từ terpenoid thể hạt sau biến đổi thành dạng hoạt hóa sinh học lưới nội chất cytosol - Cytokinin tham gia vào trình phát triển biệt hóa tế bào, truyền tín hiệu chỗ vị trí khác thể với chế vận chuyển tương tự purin nucleosit; đồng thời cytokinin ảnh hưởng đến tính ưu đỉnh, phát triển chồi nách già 1.3 Vai trò chức chất kích thích sinh trƣởng thực vật - Auxin điều phối nhiều trình sinh lý cần thiết chu kỳ sống thực vật như: sinh trưởng, phát triển, hoa, hình thành củ, quả, hạt thực vật - GAs điều hòa ảnh hưởng đến trình phát triển khác thực vật như: kéo dài thân, nảy mầm, ngủ hạt, hoa, phát triển hoa già - Cytokinin tương tác trực tiếp với auxin, kích thích phân chia tế bào q trình chuyển hóa khác tế bào Cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ với ADN protein thực vật, cho phép phát triển mô khác để thực mục đích khác 1.4 Các nghiên cứu tác dụng chất kích thích sinh trƣởng thực vật - Auxin nghiên cứu sử dụng nhân giống trồng, nuôi cấy mô tế bào, thuốc diệt cỏ - Gibberellin ứng dụng nhiều kích thích nảy mầm hạt, phản ứng với điều kiện ức chế môi trường, thúc đẩy tăng trưởng quả, kéo dài thân, kích thích hoa, hình thành hạt - Cytokinin nghiên cứu ứng dụng việc gia tăng hàm lượng diệp lục, làm chậm q trình già hóa cây, gia tăng phát triển thân 1.5 Các nghiên cứu dƣ lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật Ở Việt Nam, chưa có cơng trình cơng bố dư lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật sản phẩm rau xanh trái Tuy nhiên, thị trường, thuốc kích thích sinh trưởng thực vật buôn bán sử dụng với nhiều tên thương mại khác như: siêu rễ, siêu trái, thuốc kích mầm, thần dược siêu tăng trưởng Bên cạnh đó, số loại phân bón qua cho loại trồng chứa hàm lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật định Bản chất thuốc kích thích sinh trưởng thực vật chứa chất như: auxin, gibberellin cytokinin có vai trị kích thích phân chia tế bào, thúc đẩy sinh trưởng phát triển, gia tăng sinh khối cho trồng 1.6 Các phƣơng pháp phân tích chất kích thích sinh trƣởng thực vật 1.6.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 1.6.1.1 Thu thập mẫu 1.6.1.2 Chiết tách 1.6.1.3 Làm tinh chế mẫu 1.6.2 Các phương pháp phân tích 1.6.2.1 Phương pháp phân tích hợp chất auxin 1.6.2.2 Phương pháp phân tích hợp chất gibberellin 1.6.2.3 Phương pháp phân tích hợp chất cytokinin CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất thí nghiệm 2.1.1 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm  Thiết bị sắc ký lỏng Ultimate 3000 HPLC thiết bị phân tích khối phổ LCQ Fleet MS  Các thiết bị dụng cụ phụ trợ khác 2.1.2 Hóa chất thí nghiệm 2.1.2.1 Hóa chất IAA, IBA, ICA, IP A, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR DHZR, Methanol, Acetonitrile, axit foocmic, axít Hydrochloric, Dichloromethane, 2-propanol Thuốc kích thích sinh trưởng thực vật Gibber4TB 2.1.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 1000 μg.mL-1, sau pha thành chuẩn trung gian gồm: 100 μg.mL-1; 20 μg.mL-1; μg.mL1 Từ chuẩn trung gian tiếp tục pha thành chuẩn làm việc: 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 2000 ng.mL-1 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu Các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc ba nhóm: auxin (IAA, IBA, ICA IPA ), gibberellin (GA3, GA4 GA7) cytokinin (BA, iP, iPR, K, DHZR, tZ, tZR) 2.2.2 Đối tượng phân tích - Các mẫu rau cải xanh (Brassica juncea) sử dụng để khảo sát, xây dựng đánh giá phương pháp phân tích - Các mẫu rau xanh thu thập từ mơ hình sản xuất rau quy mơ hàng hóa số quận/huyện thuộc thành phố Hà Nội - Các mẫu rau thí nghiệm ứng dụng quy trình phân tích xác định tích lũy GA3 số loại rau xanh 2.2.3 Thu thập mẫu - Mẫu phân tích thu thập theo Tiêu chuẩn ngành 10TCN 386:1999 Phương pháp lấy mẫu kiểm định chất lượng dư lượng thuốc bảo vệ thực vật [110] - Các mẫu rau thí nghiệm phục vụ xây dựng đánh giá phương pháp phân tích: thu thập ngày phát triển thứ 35 sau chuyển trồng thùng xốp, cách nhổ gốc, rửa sạch, cắt bỏ phần gốc, phần cịn lại đơng cứng nitơ lỏng xử lý phân tích 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp khảo sát điều kiện tối ưu quy trình phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật rau 2.3.1.1 Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích khối phổ - Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ μg.mL1 /chất KTST vào detector MS để xác định ion phân tử ion sản phẩm chất KTST theo chế độ ion hóa âm (-) ion hóa dương (+) Sau đó, khảo sát điều kiện nguồn ion hóa với có mặt pha động 2.3.1.2 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký lỏng a) Khảo sát cột phân tích dung môi pha động:  Các cột nghiên cứu: cột Hypersil cột Purospher  Các dung môi pha động: MeOH (+0,1% FA) + nước siêu chứa 0,1% FA hệ dung môi ACN (+0,1% FA) + nước siêu chứa 0,1% FA b) Khảo sát điều kiện phân tích khác:  Tốc độ dịng, chế độ gradient 2.3.2 Phương pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu - Dựa sở phương pháp tách chiết hoocmon thực vật loài Arabidopsis thaliana thuộc Họ Cải theo nghiên cứu Xiangqing cộng sử dụng dung môi chiết 1-propanol/H2O/HCl (2 : : 0,002, v/v/v) Dichloromethane 2.3.3 Phương pháp xây dựng xác nhận quy trình phân tích đồng thời chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau - Xây dựng quy trình phân tích đồng thời chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau xanh từ kết nghiên cứu điều kiện tách chiết mẫu điều kiện phân tích thiết bị sắc ký lỏng đầu dò khối phổ - Xác nhận thẩm định quy trình phân tích thông qua thông số:  Độ ổn định chu kỳ đông/ rã đông mẫu  Đường chuẩn  Giới hạn phát giới hạn định lượng  Ảnh hưởng mẫu  Độ thu hồi độ xác phương pháp  So sánh liên phịng thí nghiệm 2.3.4 Phương pháp đánh giá dư lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau xanh thu thập Hà Nội  Thu thập mẫu rau cải xanh quận/huyện thuộc thành phố Hà Nội gồm: Huyện Đông Anh, Huyện Gia Lâm, Huyện Mê Linh, Huyện Sóc Sơn, Quận Hồng Mai Huyện Phúc Thọ  Xử lý phân tích hàm lượng chất KTST theo quy trình xây dựng đánh giá 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng Các kết nghiên cứu cho thấy rằng, có khác hiệu phân tách chất kích thích sinh trưởng thực vật sử dụng hệ dung môi pha động khác cột sắc ký nhau; sử dụng chế độ dung môi pha động, cột sắc ký khác có khả phân tách chất kích thích sinh trưởng thực vật khác Trong đó, cột sắc ký Hypersil cho hiệu phân tách chất nghiên cứu hai chế độ ion hóa âm ion hóa dương tốt so với cột Purospher Việc sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu chứa 0,1% FA cho kết phân tách chất kích thích sinh trưởng thực vật tốt so với pha động ACN (+0,1% FA) + nước siêu chứa 0,1% FA Sự kết hợp cột sắc ký Hypersil pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu chứa 0,1% FA cho kết phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật tốt với tín hiệu chất phân tích rõ ràng, cường độ tín hiệu cao, chân píc hẹp sắc nét Do đó, cột Hypersil pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu chứa 0,1% FA lựa chọn sử dụng để khảo sát điều kiện phân tích khác phục vụ cho thí nghiệm nghiên cứu Kết khảo sát điều kiện gradient pha động phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật cho thấy: thay đổi tỷ lệ dung môi MeOH (+0,1% FA) với nước siêu chứa 0,1% FA tốc độ dịng dung mơi có ảnh hưởng rõ rệt đến tín hiệu chất phân tích, hình dạng píc sắc ký thời gian rửa giải chất kích thích sinh trưởng thực vật Trong gradient khảo sát, gradient có điều kiện phân tách tốt nhất, với tín hiệu chất phân tích rõ ràng, sắc nét, chân píc gọn, chất rửa giải hồn tồn, 12 điều kiện gradient lựa chọn sử dụng cho nghiên cứu Bảng 3.4 Điều kiện gradient tối ưu sử dụng phân tích chất PGR rau Thời gian (phút) Tốc độ dòng (mL/phút) H2O (+ 0,1% FA) MeOH (+0,1% FA) 0,1 70 30 0,1 70 30 10 0,1 10 90 13 0,1 10 90 13.5 0,1 70 30 15 0,1 70 30 3.2 Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu Kết nghiên cứu cho thấy, có khác hiệu suất chiết chất kích thích sinh trưởng thực vật khác sử dụng dung môi chiết; khác hiệu suất chiết dung môi chiết khác hợp chất phân tích; đó, việc sử dụng dung mơi chiết 2-propanol cho hiệu chiết cao so với dung môi chiết 1-propanol điều kiện nghiên cứu Quy trình xây dựng phát triển sử dụng dung môi chiết 2-propanol có hiệu suất chiết trung bình chất kích thích sinh trưởng thực vật đạt 85,93±5,28% cao quy trình sử dụng 1propanol 76,00±5,13% Các giá trị cao nhiều so với quy trình tách chiết chất kích thích sinh trưởng thực vật theo nghiên cứu Xiangqing cộng [83] sử dụng 2-propanol 1propanol 78,29±5,78% 66,93±4,84% Đặc biệt, có hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật có hiệu suất chiết cao 90% là: GA3 đạt đến 95%, IAA đạt đến 94%, ICA đạt đến 92%, tZR 13 đạt đến 92%, IBA đạt 90% GA4 đạt 90%; hợp chất có hiệu suất chiết đạt từ 80-87% gồm K, IPA, tZ, iP, GA7, iPR DHZR; có 01 hợp chất BA có hiệu suất chiết < 80% quy trình sử dụng 2propanol 100 Quy trình pt 1-propanol Quy trình pt 2-propanol Hiệu suất thu hồi (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Chất kích thích sinh trưởng thực vật Hình 3.27 Hiệu suất trình chiết mẫu theo quy trình xây dựng phát triển sử dụng dung môi 1-propanol 2-propanol Trong đó: - Quy trình pt 1-propanol: quy trình chiết mơ tả theo Hình 3.11 sử dụng dung mơi chiết 1-propanol - Quy trình pt 2-propanol: quy trình chiết mơ tả theo Hình 3.11 sử dụng dung mơi chiết 2-propanol 14 3.3 Xây dựng xác nhận giá trị sử dụng quy trình phân tích 3.3.1 Xây dựng quy trình phân tích đồng thời chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau Hình 3.18 Sơ đồ quy trình tách chiết phân tích chất KTST mẫu rau 15 (Ion âm) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 (Ion dƣơng) iP K tZ BA iPR tZR DHZR Hình 3.29 Sắc ký đồ chất KTST điều kiện gradient tối ưu 3.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng quy trình phân tích 3.3.2.1 Độ ổn định chu kỳ đơng/ rã đơng mẫu Kết nghiên cứu cho thấy có 6/14 chất kích thích sinh trưởng có độ ổn định đạt 100%, đó, cao hợp chất IAA đạt 106,28%; tiếp đến GA3 đạt 105,48% GA4 đạt 104,10%; sau tZ đạt 103,32%, K đạt 101,93% GA7 đạt 101,48% Còn hợp chất lại có độ ổn định sau chu trình đơng/rã đơng từ 91,79 đến 16 99,98%; gồm: iP đạt 99,98%; iPR đạt 98,49%; IBA đạt 98,26%; ICA đạt 96,48%; BA đạt 94,73%; IPA đạt 94,62%; DHZR đạt 94,07% tZR đạt 91,79% (Bảng 3.6) Theo nghiên cứu Frank cộng [123], độ ổn định chu kỳ đông/ rã đông xác nhận phương pháp phân tích dao động khoảng từ 90-110% Điều cho thấy, chu kỳ đơng/ rã đơng phương pháp phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau xanh thỏa mãn yêu cầu việc xác nhận phương pháp phân tích mới, đồng nghĩa với q trình đông rã đông mẫu không ảnh hưởng đến kết phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau xanh 3.3.2.2 Đường chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng Bảng 3.6 Đường chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích MDL MQL Hợp chất Đƣờng chuẩn R2 -1 (ng.g ) (ng.g-1) IAA y = 0,19x + 1,99 0,9997 32,6 108,6 IBA y = 2,46x + 20,60 0,9987 3,2 10,8 ICA y = 4,45x + 127,66 0,9985 2,1 6,9 IPA y = 0,44x – 1,39 0,9992 14,3 47,6 GA3 y = 1,46x + 14,33 0,9997 5,2 17,2 GA4 y = 4,44x + 144,25 0,9990 4,1 13,8 GA7 y = 2,12x + 95,66 0,9961 4,3 10,8 BA y = 7,59x + 11,48 0,9989 0,3 1,0 DHZR y = 49,25x + 145,59 0,9999 0,6 2,0 iP y = 49,32x – 32,74 0,9995 0,5 1,5 iPR y = 2,01x – 12,26 0,9988 4,6 15,2 K y = 30,32x + 7,68 0,9982 1,2 4,0 tZ y = 70,48x – 80,36 0,9999 0,2 0,6 tZR y = 92,742x + 176,7 0,9992 0,3 0,9 17 3.3.2.3 Ảnh hưởng mẫu Hiệu ứng mẫu (%) 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 IAA IBA ICA IPA GA3 GA4 GA7 BA K iP iPR tZ tZR DHZR Khoảng ME chấp nhận Chất kích thích sinh trưởng thực vật Hình 3.31 Ảnh hưởng mẫu đến tín hiệu chất phân tích Giá trị ME cao 118% phát hợp chất IAA thấp 82% hợp chất BA Đặc biệt, hợp chất thuộc nhóm gibberellin có giá trị ME > 100%, đó, ME GA3 115%, GA4 107% GA7 102% Nhiều hợp chất có giá trị ME nằm khoảng 90-100% như: IBA-97%, K-97%, tZ-93%, iP-92%, IPA-90% DHZR-90%; đó, có hợp chất có giá trị ME nằm khoảng 80-90 (%) iPR-87%, ICA-85% tZR-84% Điều cho thấy rằng, mẫu ảnh hưởng khơng đáng kể đến kết phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau cải xanh 3.3.2.4 Hiệu suất thu hồi độ xác phương pháp phân tích Hiệu suất thu hồi trung bình khác nồng độ khác chất kích thích sinh trưởng thực vật, khác PGR khác có nồng độ Hiệu suất thu hồi 18 dao động từ 68,42% đến 119,47% nhóm chất có nồng độ thấp, từ 76,81% đến 107,69% nhóm chất có nồng độ trung bình từ 75,20% đến 102,56% nhóm chất có nồng độ cao Do đó, hiệu suất thu hồi trung bình chất kích thích sinh trưởng thực vật cao, dao động từ 82,30% đến 104,50% Đáng ý, hiệu suất thu hồi cao đạt 104,50% ghi nhận hợp chất GA3, 103,73% IAA Hiệu suất thu hồi GA4 GA7 tương đồng với giá trị 101,6% 102,35%, chất thuộc nhóm cytokinin BA, K, iP, iPR, tZ, tZR, DHZR auxin: IBA, ICA, IPA dao động khoảng từ 82,30% đến 93,32% (Bảng 3.8) Độ lặp lại phương pháp phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật mức nồng độ khác thấp, trung bình cao tương ứng với giá trị từ 0,56-17,17%; 0,06-10,79% 0,02-7,45% (Bảng 3.8) Theo tài liệu hướng dẫn SANTE/11813/2017 [130], giá trị hiệu suất thu hồi trung bình chấp nhận dựa xác nhận ban đầu nằm phạm vi 70 đến 120%, với RSD liên quan ≤ 20%, cho chất phân tích phạm vi phương pháp định Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp chiết xuất phù hợp đảm bảo cho việc phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau cải xanh Đây sở để phát triển, mở rộng ứng dụng phương pháp việc phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật đối tượng rau xanh khác loại trái sản phẩm nông nghiệp 3.3.2.5 Kết so sánh liên phịng thí nghiệm Kết so sánh liên phịng thí nghiệm mẫu nghiên cứu mức nồng độ hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, tương ứng 10, 100 1000 ng.mL-1 cho thấy, phương pháp phân tích 19 Phịng Thí nghiệm Trọng điểm An tồn Thực phẩm Mơi trường - Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ thu giá trị tương đồng với phòng thí nghiệm đối chứng với hệ số z-score chất nghiên cứu đạt ǀzǀ ≤ Điều có nghĩa kết phân tích hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau cải xanh theo quy trình xây dựng đánh giá đảm bảo độ tin cậy, ứng dụng việc phân tích mẫu thực nhằm khảo sát trạng sử dụng chất kích thích sinh trưởng thực vật sản xuất rau xanh 3.4 Đánh giá trạng dƣ lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật mẫu rau thu thập Hà Nội Hình 3.32 Tỷ lệ phát chất KTST rau cải xanh Hình 3.33 Tỷ lệ phát chất KTST rau cải xanh huyện nghiên cứu Kết phân tích cho thấy, có 83 mẫu tương đương 74,77% số mẫu phát dư lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật cao giới hạn định lượng có 11 mẫu tương ứng với 9,91% số mẫu không phát chất kích thích sinh trưởng thực vật Có 17 mẫu chiếm 15,32%, phân tích có hàm lượng chất KTST cao MDL thấp MQL (Hình 3.18) 20 Bảng 3.11 Số lượng chất KTST phát mẫu rau cải xanh Quận/ Huyện Hợp chất Đơng Anh tZ Gia Lâm Mê Linh Sóc Sơn Hồng Mai Phúc Thọ + GA3 + IBA + + + + IAA + + + + ICA + + + + IPA + + + + GA7 + + + + GA4 + + + + + + Số lƣợng chất đƣợc phát 3.5 Đánh giá mức độ tích lũy chất KTST rau Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ xử lý thuốc kích thích sinh trưởng thực vật GA3 cao tích lũy chúng mẫu rau nhiều, nồng độ xử lý hàm lượng GA3 có tích lũy khác loại rau, giá trị cao tìm thấy rau cải xanh (0,302 mg.kg-1), tiếp đến xà lách (0,265 mg.kg-1) thấp rau mồng tơi (0,190 mg.kg-1) 21 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Luận án hoàn thành mục tiêu đề thu số kết sau: - Đã xây dựng thẩm định phương pháp phân tích đồng thời 14 hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật gồm IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR DHZR mẫu rau cải xanh thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối với đầu dị khối phổ bẫy ion HPLC-ESI-MS2 Trong đó, hệ số tương quan R2≥0,9961; giới hạn phát phương pháp đạt 0,2-32,6 (ng.g-1); giới hạn định lượng: 0,6-108,6 (ng.g-1); hiệu suất thu hồi đạt 82,30-104,50% - Ứng dụng quy trình phân tích đánh giá sơ tồn dư chất kích thích sinh trưởng thực vật 111 mẫu rau cải xanh thu thập số quận huyện thuộc thành phố Hà Nội cho thấy có 83 mẫu nghiên cứu có chứa chất KTST Các hợp chất phát gồm: tZ, GA3, GA4, GA7, IAA, IBA, ICA IPA với hàm lượng trung bình 0,04-0,65 mg.kg-1 - Sự tích lũy GA3 loại rau xanh gia tăng với nồng độ hóa chất sử dụng có khác mức độ tích lũy hợp chất loại rau xanh khác sử dụng nồng độ xử lý KIẾN NGHỊ (1) Các quan ban ngành cần cần ban hành chế tài quản lý việc sử dụng chất KTST dư lượng chúng sản phẩm rau xanh (2) Tiếp tục nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật loại rau xanh khác, loại trái sản phẩm nơng nghiệp… 22 NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1) Là nghiên cứu Việt Nam xây dựng quy trình phân tích đồng thời hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR DHZR) mẫu rau xanh sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối với đầu dò khối phổ bẫy ion (LC-ESIMS2) 2) Quy trình nghiên cứu hợp chất kích thích sinh trưởng mới, chưa có danh mục quy định Cục Bảo vệ thực vật – Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (CV-2376/BVTV-QLT, ngày 02/12/2013) như: GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR, DHZR 3) Là nghiên cứu đánh giá sơ trạng tồn dư chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu rau xanh thu thập số quận huyện thuộc thành phố Hà Nội, khảo sát mức độ tích lũy chất kích thích sinh trưởng thực vật số loại rau xanh DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Tibor Janda, Gabbriella, Tien Dat Nguyen, Truong Giang Le Foliage applied Gibberelic acid Influences growth, nutrient contents and quality of Lettuces (Lactuca sativa L.) The Journal of Animal and Plant Sciences, 2021, 31 (6) Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Tien Dat Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Tibor Janda, Gabbriella Szala, Truong Giang Le The potential health risks and environmental pollution associated with the application of plant growth regulators in vegetable 23 production in several suburban areas of Hanoi, Vietnam Biologia Futura, 2020 DOI :10.1007/s42977-020-00041-5 Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Truong Giang Le Analysis of Plant Growth Substances (Auxins, Gibberelins and Cytokinins) in Vegetables Using HighPerformance Liquid Chromatography Coupled to Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry The International Journal of Science and Technoledge, 2020, 8(7): 38-46 Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Hoàng Thị Thoa, Nguyễn Ngọc Tùng, Quách Thị Sơn Quy trình phân tích sàng lọc số chất kích thích tăng trưởng thực vật rau xanh Tạp chí phân tích: Hóa, Lý Sinh học, 2019, 24 (4B), 45-51 Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Phùng Trung Kiên Nghiên cứu ảnh hưởng GA3 lên sinh trưởng phát triển cải bẹ xanh [Brassica Juncea (L.) czern et coss] Tạp chí phân tích: Hóa, Lý Sinh học, 2019, 24 (4B), 97-102 Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam, Lê Trường Giang, Đinh Ngọc Huy Xây dựng bước nghiên cứu phân tích thuốc kích thích tăng trưởng trans-zeatin sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối khối phổ Tạp chí Phân tích: Hóa, Lý Sinh học, 2018, 23 (4), 41-49 Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Truong Giang Le, Tibor Janda, Gabbriella Szalai, Yukui Rui Simultaneous analysis of plant endogenous hormones in green mustard by liquid chromatography tandem mass spectrometry (Đã phản biện chờ đăng tạp chí Chinese Journal of Analytical Chemistry) Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam Phân tích đồng thời chất kích thích sinh trưởng Cytokinin rau xanh (Đã phản biện chờ đăng Tạp chí Hóa học) Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam Ảnh hưởng GA3 đến phát triển sinh khối số loại rau xanh (Đã phản biện chờ đăng Tạp chí Hóa học) 24 MINISTRY OF EDUCATION VIETNAM ACADEMY OF AND TRAINING SCIENCE AND TECHNOLOGY GRADUATE UNIVERSITY SCIENCE AND TECHNOLOGY -Le Van Nhan STUDY AND DEVELOPMENT THE ANALYSIS METHOD OF STIMULATORS SUCH AS AUXIN, GIBBERELLIN AND CYTOKIN IN VEGETABLES Major: Analytical Chemistry Code: 9.44.01.18 SUMMARY OF DOCTORAL THESIS The study described a simultaneous analytical method of 14 stimulators in Brassica Juncea (L.) Czern using 2propanol/water/concentrated HCl (2/1/0.002 v/v/v) and dichloromethane as extraction solution The method showed good linearity for all 14 compounds, with regression coefficients R > 0.9961 The limit of detection ranged from 0.2 to 32.6 ng g –1, the overall average of recovery ranged from 81.71% to 105.74%, and the repeatability standard deviation was less than 20% The proposed method is fast, simple, sensitive, accurate, and efficient for the analysis of stimulators in green mustards, which could be the basis to develop the method for determination of plant growth regulators in other vegetables and agricultural products Hanoi - 2021 25 26 ... chất sử dụng sản xuất nông nghiệp Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng phát triển phương pháp phân tích số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin,. .. trường sinh thái Mục tiêu nghiên cứu luận án  Nghiên cứu xây dựng phát triển phương pháp phân tích đồng thời hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật rau xanh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao... Các phương pháp phân tích 1.6.2.1 Phương pháp phân tích hợp chất auxin 1.6.2.2 Phương pháp phân tích hợp chất gibberellin 1.6.2.3 Phương pháp phân tích hợp chất cytokinin CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ