Nghiên cứu xây dựng hệ thống haccp áp dụng cho quá trình sản xuất của công ty cổ phần suất ăn hàng không nội bài

bộ giáo dục đào tạo trường đại học bách khoa hµ néi - luận văn thạc sĩ khoa học ngành : công nghệ sinh học nghiên cứU xây dựng hệ thống haccp áp dụng cho trình sản xuất công ty cổ phần suất ăn hàng không nội 3898 lª anh minh Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: PGS - Ts Hà duyên tư Hà Nội - 2008 B GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** - LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU THU NHẬN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM CHITOSANAZA TỪ CHỦNG PENICILLIUM OXALICUM CURRIE AND THOM VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ THU NHẬN CHITOSAN OLIGOSACCHARIT NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC VŨ THỊ ÁNH TUYẾT Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ THANH HÀ HÀ NỘI 2008 LỜI CAM ĐOAN Tác giả luận văn xin cam kết nội dung luận văn kết trình nghiên cứu, học hỏi trình học tập, tiếp thu kiến thức từ Cô giáo hướng dẫn TS Lê Thanh Hà Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Báck Khoa Hà Nội Tất số liệu phân tích thực nghiệm, bảng biểu đề tài kết q trình nghiên cứu, phân tích đánh giá thân tác giả tiếp thu q trình học tập, khơng phải sản phẩm chép Mọi nguồn tài liệu khác trích dẫn nguồn đầy đủ liệt kê phần Tài liệu tham khảo Trên cam kết ràng buộc trách nhiệm tác giả nội dung, ý tưởng đề xuất luận văn này MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Chitin 1.2 Chitosan 1.2.1 Cấu tạo 1.2.2 Tính chất 10 1.2.3 Ứng dụng 11 1.3 Chitosanaza 12 1.3.1 Nguồn thu 13 1.3.2 Đặc tính 14 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chitosanaza 15 1.3.3.1 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp chitosanaza 15 1.3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp chitosanaza 16 1.3.3.3 Ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng 16 1.3.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất enzym chitosanaza 17 1.4 Chitosan oligosaccharit 21 1.4.1 Đặc tính 21 1.4.2 Phương pháp thu nhận COS 21 1.4.3 Ứng dụng 24 1.4.3.1 Trong y học 24 1.4.3.2 Trong ngành thực phẩm 25 1.4.3.3 Trong nông nghiệp 25 1.4.3.4 Trong xử lý nước thải 26 1.4.3.5 Trong sản xuất mỹ phẩm 26 1.4.3.6 Chitosan oligosaccharit chất dinh dưỡng 26 1.4.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitosan oligosaccharit 27 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP …………………………… 30 2.1 Vật liệu thiết bị ………………………………………………… 30 2.1.1 Vật liệu ……………………………………………………… 30 2.1.2 Thiết bị ……………………………………………………… 31 2.1.3 Môi trường ………………………………………………… 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu …………………………………………… 33 2.2.1 Phương pháp vi sinh ………………………………………… 33 2.2.2 Phương pháp hoá sinh ……………………………………… 34 2.2.2.1 Xác định hoạt độ enzym chitosanaza 34 2.2.2.2 Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradfort 36 2.2.2.3 Tách enzym phương pháp kết tủa muối (NH4)2SO4 37 2.2.2.4 Phân đoạn enzym phương pháp lọc cut-off 38 2.2.2.5 Kiểm tra độ tinh enzym phương pháp điện di 38 2.2.2.6 Phương pháp thu nhận chitosan oligosaccharit 42 2.2.2.7 Phương pháp sắc ký mỏng 43 2.2.2.8 Phương pháp xác định độ nhớt, khối lượng phân tử trung bình 44 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………… 46 3.1 Xác định đặc tính chủng 46 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chitosanaza ………………………………………………………… 47 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nuôi cấy…………….… 47 3.2.2 Ảnh hưởng pH môi trường………………………….… 48 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon………………………… …… 49 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ………………………………… 50 3.3 Khảo sát thu nhận chitosanaza kết tủa muối (NH4)2SO4 51 3.4 Kết tủa phân đoạn enzym chitosanaza muối amoni sulphat bão hoà 53 3.5 Phân đoạn dịch enzym chitosanaza phương pháp màng lọc cut-off 55 3.6 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân thu nhận chitosan oligosaccharit 57 3.6.1 Ảnh hưởng pH 57 3.6.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 59 3.6.3 Ảnh hưởng thời gian phản ứng 60 3.6.4 Ảnh hưởng tỷ lệ E/ chất 63 3.7 Thu nhận COS …………………………………………………… 64 3.7.1 Thực phản ứng thuỷ phân …………………………… 64 3.7.2 Lọc qua màng lọc 10kDa …………………………………… 64 3.7.3 Kết tủa dịch sản phẩm cồn nguyên chất ……………… 64 3.7.4 Thu nhận sản phẩm sấy chân không………………… 65 3.7.5 Sản phẩm…………………………………………………… 65 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………… 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………… 68 PHỤ LỤC ……………………………………………………………… 75 Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt CMC : Cacboxyl methyl cenllulose Da : Dalton GlcN : N-glucosamine GlcAc : N-acetyl glucosamine TLC : Sắc ký mỏng (Thin layer chromatography) COS : Chitosan oligosaccharit SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate- poly-acrylamide gel electrophoresis MỞ ĐẦU Ngày nay, công nghệ enzym bước làm thay đổi nâng cao chất lượng số q trình cơng nghệ chế biến thực phẩm, nông nghiệp, dược phẩm, y tế … Hàng năm, lượng enzym sản xuất giới đạt khoảng 300 nghìn với trị giá 500 triệu USD Enzym chitosanaza (EC 3.2.1.132) enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết nội phân tử chitosan ứng dụng chủ yếu để tạo loại phân tử chitosan phân tử lượng thấp khác glucosamine, chitosan oligosaccharit… với đặc tính ưu việt chitosan Chitosan oligosaccharit có ứng dụng nhiều lĩnh vực y học, dược phẩm, thực phẩm… Chitosan oligosaccharit giúp kích thích tiêu hố thức ăn, tăng tính thèm ăn vật ni, tăng cường sức đề kháng, tăng khả miễn dịch, ngăn cản phát triển tế bào ung thư, giảm cholesterol huyết tương, giúp giảm cân ngăn chặn bệnh người trưởng thành, ngăn ngừa bệnh gan nhờ tạo thành kháng thể nhanh gan lách, giảm huyết áp lượng đường máu, làm giảm chất béo máu, ức chế phát triển E.coli, phòng chống hữu hiệu bệnh đường tiêu hoá… Xuất phát từ tiềm ứng dụng to lớn chitosan oligosaccharit đặc biệt y học dược phẩm, em thực đề tài: “Nghiên cứu thu nhận, tinh xác định đặc tính enzym chitosanaza từ Penicillium oxalicum Currie and Thom ứng dụng để thu nhận chitosan oligosaccharit” Mục tiêu đề tài là: • Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzym • Qui trình tinh enzym chitosanaza • Xác định đặc tính enzym chitosanaza (nhiệt độ, pH,…) • Khảo sát ảnh hưởng điều kiện thuỷ phân (nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng…) đến khả thủy phân chitosan để thu nhận chitosan oligoscacharides PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Chitin Chitin polyme tự nhiên phổ biến thứ hai sau xenluloza Chitin polysaccarit tìm thấy động vật trùng lồi giáp xác biết có chứa lượng lớn chitin lớp vỏ cứng Thơng thường vỏ tơm cua thu có chứa 30-40% protein, 30-50% canxi cacbonat canxi photphat 20-30% chitin Ngồi ra, chitin cịn thu từ tảo biển, động vật, thực vật bậc thấp biển thực vật bậc thấp cạn với lượng nhỏ [44, 49] Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo thành tế bào nấm, đóng vai trị cấu thành nên hình dạng tạo độ cứng cho tế bào nấm Chitin cấu tạo đơn vị N-axetyl-β-D-glucosamine nối với cầu nối β-1,4 glucozit [C8H13O5]n, Mchitin = (203.09)n Hình 1.1 Cấu tạo phân tử Chitin Khối lượng phân tử chitin tự nhiên lớn triệu Dalton Trong tự nhiên, chúng không tồn dạng tinh khiết mà thường kết hợp với polysacarit khác, với protein với muối khoáng Chitin không tan nước, môi trường kiềm, acid lỗng chất dung mơi hữu ether, rượu… lại hịa tan dung dịch đặc nóng muối thioxianat Liti (LiSCN) thioxianat canxi Ca(SCN)2 tạo thành dung dịch keo Chitin tương đối ổn định với chất oxy hóa khử, thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước Javen (NaClO) hay Ca(ClO)2 … lợi dụng tính chất người ta sử dụng chất oxy hóa để khử màu cho chitin [8] 1.2 Chitosan 1.2.1 Cấu tạo Chitosan dẫn xuất đề axetyl hố chitin, nhóm (–NH2) thay nhóm (-COCH3) vị trí C(2) Chitosan cấu tạo từ mắt xích D-glucozamine liên kết với liên kết β-(1-4)-glicozit, chitosan gọi poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ poly β-(1-4)-D- glucozamine (cấu trúc III) Công thức phân tử: [C6H11O4N]n, MChitosan = (161.07)n Chitosan có khối lượng phân tử khác ứng với nguồn chitin khác Khối lượng phân tử chitin tự nhiên lớn triệu Dalton sản phẩm chitosan thương mại có khối lượng phân tử từ 100.000 1.200.000 Dalton, phụ thuộc vào trình xử lý nhà sản xuất Hình 1.2 Cấu tạo phân tử chitosan Chitosan tìm thấy tự nhiên, tìm thấy thành tế bào nấm thuộc họ Zygomycetes, lồi tảo biển có diệp lục Chlorella sp lớp vỏ lồi trùng Các chitosan tự nhiên 66 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * KẾT LUẬN Xác định đặc tính chủng sinh tổng hợp chitosanaza: Penicillium axalicum currie and Thom Tìm điều kiện ni cấy tối ưu cho chủng Penicillium axalicum currie and Thom để thu nhận chitosanaza cao - Nguồn cacbon: chitosan 0,3% - Nguồn nitơ: pepton 0.5% - Tỷ lệ cấy giống: 5% - Nhiệt độ ni cấy thích hợp: 300C, pH = - Thời gian ni cấy thu enzym có hoạt độ cao nhất: 96 Kết tủa phân đoạn muối amoni sulphat bão hoà nồng độ 60% trước đưa nồng độ bão hịa muối lên 85% tăng độ tinh enzym chitosanaza từ 3,6 lên 5,5 lần Phân đoạn enzym màng lọc cut-off xác định đặc tính enzym chitosanaza phân đoạn 10-50 kDa ≥50 kDa cho thấy tồn loại enzym chitosanaza với độ bền nhiệt khác Tìm điều kiện phản ứng tối ưu thu chitosan oligosaccharit - Thời gian phản ứng: 120 phút - Nhiệt độ phản ứng: 60 0C - pH = - Tỷ lệ E/cơ chất: 1: 2.5 - Tỷ lệ kết tuả COS cồn nguyên chất: Dịch COS: cồn = 1:4 67 - Sấy chân không 400C - Hiệu suất thuỷ phân: 83% - Sản phẩm thu có màu nâu nhạt, tan nước * KIẾN NGHỊ: - Tinh enzym chitosanaza - Khảo sát ảnh hưởng độ deacetyl hoá chất chitosan đến khả thủy phân enzym chitosanaza - Tối ưu hóa điều kiện thu nhận COS 68 Tài liệu tiếng Việt TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Đông, Đỗ Trường Thiện, Nguyễn Văn Hoan (2005), Ứng dụng chitosan khối lượng phân tử thấp để kích thích sinh trưởng lúa, Tuyển tập cơng trình hội nghị khoa học cơng nghệ hố hữu toàn quốc lần thứ 3, tr 445-449 Nguyễn Thị Huệ, Bùi Thị Huyền, (2005), Nghiên cứu phản ứng thuỷ phân chitosan axit hữu cơ, Tuyển tập công trình hội nghị khoa học cơng nghệ hố hữu toàn quốc lần thứ 3, tr 210-221 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học Nhà xuất khoa học kỹ thuật Bùi Phước Phúc, Hà Thúc Huy, Nguyễn Ngọc Duy, Đặng Văn Phú, Nguyễn Quốc Hiến, (2006), Nghiên cứu giảm cấp chitosan hydroperoxit kết hợp với xạ gamma CO - 60, Hóa học ứng dụng, 4, tr 29-32 Bùi Phước Phúc, Nguyễn Triệu, Đặng Văn Phú, Nguyễn Quốc Hiến, Nguyễn Ngọc Duy, Hà Thúc Huy, (2006), Nghiên cứu chế tạo oligochitosan phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan, Hóa học ứng dụng, 9, tr 38-41 PGS, TS Đặng Thị Thu, PGS Lê Ngọc Tú, TS Tô Kim Anh, TS Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzym Nhà xuất khoa học kỹ thuật PGS, TS Đặng Thị Thu, TS.Nguyễn Thị Xn Sâm, TS.Tơ Kim Anh (2002) Thí nghiệm hố sinh cơng nghiệp Lưu Thị Lệ Thủy, Trần Thị Tuyết (2004) Nghiên cứu tận dụng chế phẩm nguyên liệu thủy sản (vỏ tôm,cua,…) để chiết rút chitin-chitosan sử 69 dụng công nghiệp Báo cáo đề tài Phân Viện công nghiệp thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh trang 11-16 Tài liệu tiếng Anh Alla V Hyina, Natalya Yu Tatarinova, Valery P Varlamov, (1990), Purification and Chazacterization of three chitosanaza Activities from Bacillus megaterium P1, Applied and environmental microbiology, pp 844-848 10 A.Pelleetier and J Sygusch (1990) Purification and characterization of three chitosanaza activities from Bacillus megaterium P1 Applied and Enviromental microbiology, pp 844-848 11 Bough, W.A (1976) Chitosan-A polymer from seafood waste, for use in treatment of food processing wastes and activated sludge.Proc Biochem 11(1), p.13 12 ChoongSoo Yun, Daiki Amakata, Yasuhiro Matsuo, Hideyuki Matsuda, and Makoto Kawamukai (2005) New Chitosan-Degrading Strains That Produce Chitosanaza Similar to ChoA of Mitsuaria chitosanitabida Applied and Enviromental microbiology, p 5138-5144 13 Chui-Liang Chiang, Chen- Tien Chang, Hsien- Yi Sung Purification and properties of chitosanaza from a mutant of Bacillus subtilisIMR-NK Enzym and Microbial Technology 32 (2003) 260-267 14 Dong-Won Lee and Ronald H Baney* (2004) Oligochitosan Derivatives Bearing Electron-Deficient Aromatic Rings for Adsorption of Amitriptyline: Implications for Drug Detoxification Biomacromolecules (4), pp 1310 -1315 15 Farooqahamed S Kittur, Achrya B Vishu Kumar, Rudrapatnam N Tharanathan, (2003), Low molecular weight chitosans – preparation by 70 depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization, Carbonhydrate Research 338, pp 183-1290 16 Fenton D M, Eveleigh D E (1981) Purification and mode of action of a chitosanaza from Penicillium islandicum J Gene Microbiol 126, pp 151–165 17 Giustian, A., and Ventura, P.(1995) Weight-reducing regimens in obese subjects: Effects of a new dietary fiber integrator Acta Toxicological Therapeutics 16, pp 199-214 18 Had wiger LA, Fristensky B, Riggleman RC (1984) Chitosan, a natural regulator in plant pathogen interaction, increase crop yield In: Zikakis JP, editor, chitin, chitosan and related enzym Orlando, FL Academic Press, pp 291-302 19 Ho-Geun Yoon, Hee-Yum Kim, Hye-Kyung Kim, Dong-Hoon Shin and Hong-Yon Choie (2000) Thermostabe chitosanaza from Bacillus sp Strain CK4 Its furification, characterization, and reaction patterns: Applied and Enviromental Microbiology 20 http://www.alibaba.com/showroom/Chitosan_Oligosaccharide.html 21 Hu Zhang, Yuguang Du, Masaru Mitsutomi, Sei-ichi Aiba, (1999), Preparation of chitooligosacharides from chitosan by a complex enzym, Carbonhydrate Research 320, pp 257-260 22 Jin Li, Yumin Do, Hongbo Liang (2007) Influence of molercular parameters on the degradation of chitosan by a commercial enzym Polymer Degradation and Stability 92, pp 515-524 23 Jing Liu, Wen Shui Xia (2006), Purification and Characterization of a bifunctional enzym with chitosanaza anh cenllulase activity from commercial cenllulase Biochemical Journal 30, pp 82-87 71 24 J.S Price and R Stock (1975), Production, Purification, and Charaterization of an Extracellular Chitosanaza from Streptomyces 25 Jone, Y.J., and Kim, S.K (2001), Effect of antimicrobial activity by chitosan oligosaccharit N- conjugated with asparagines Journal of Microbiology and biotechnology, 11, pp 281-286 26 Knorr, D (1986), Nutritional quality, food processing, and biotechnology aspects of chitosan and Chitosan oligsaccharit A review Process Biochem, 21(3), pp 90-92 27 Kurita K (1998), Polymer Degradation and Stability, 59, pp.117120 28 Luis A.Rivas1, Voctor Parro1, Mercedes.Morino-Paz1 and Rafall P.Mellado1, (2000), The Bacillus subtilis 169 cns gene encodes a chitosanaza with similar properties to Steptomyces enzym: Juornal of Microbiology 148, pp 2929-2936 29 Li, Q., Dunn, E.T., Grandmaison, E.W and Goosen, M.F.A (1992) Applications and properties of chitosan J Bioactive and Compatible Polym 7, pp 370-397 30 Macchi, G (1996) A new approach to the treatment of obesity Chitosan’s effects on body weight reduction and plasma cholesterol levels Acta Toxicological Therapeutics, 27, pp 303-320 31 Makoto shimosaka, Masahiro Nogawa, Xui-Ying wang, Masanori and Mitsuo okazaki (1995), Prodution of two chitosanaza from a chitosan-Assimilating Bacterium, Acinetobacter sp Strain CHB101 Applied and Enviromental microbiology, pp 438-442 32 Masako Kubuhisa Ochiai1, Jae Kweon Park1, Kumiko Shimono, Nubuhisa Ochiai (1999), Purification,characterization and Gene analysis 72 chitosanaza (ChoA) from Mastuebacter chitosanotabidus 3001 Juornal of Bacteriology, pp 6642-6649 33 Marcotte, E.M., Monzingo, A.F., Ernst, S.R., Brzezinski, R and Robertus, J.D (1996), X-ray structure of an anti-fungal chitosanaza from Streptomyces N174 Nat Struct Biol 3, pp 155-162 34 Mitsutomi M, Isono M, Uchiyama A, Nikaidou N, Ikegami T, WatanabeT Chitosanaza activity of the enzym previously reported as beta-1,3-1,4-glucanase from Bacillus circulans WL-12.Department of Applied Biological Sciences, Faculty of Agriculture, Saga University, Japan 35 Muzzarelli RAA, Biagini G Role and fate of exogeneous chitosans in human wound tissues Ed Chitin Enzymology, Eur Chitin Soc 1993, Ancona 36 Nishimura, K.,Nishimura, S Nishi, N., Saiki, I., Tokura,S., and Azuma, I (1984) Immunological activity of chitin and its derivatives Vaccine , 2, pp 93-99 37 No, H.K., Hur, E.Y (1998), Control of Foam Formation by Antifoam during Demineralization of Crustacean Shell in Preparation of Chitin Journal of Agricultural and Food Chemistry 46(9), pp.3844-3846 38 No, H.K., Lee, K.S., Meyers, S.P (2000), Correlation Between Physicochemical Characteristics and Binding Capacities of Chitosan Products Journal of Food Science 65(7), pp 1134-1137 39 No, H.K., Park, N.Y., Lee, S.H., Hwang, H.J., Meyers, S.P (2002), Antibacterial Activities of Chitosans and Chitosan Oligomers with Different Molecular Weights on Spoilage Bacteria Isolated from Tofu Journal of Food Science, 67(4) pp 1511-1514 73 40 Osswald W F, Shapiro J P, Doostdar H, McDonald R E, Niedz R P, Narin C J, Hearn C J, Mayer R T (1994), Identification and characterization of acidic hydrolases with chitinase and chitosanaza activities from sweet orange callus tissue Plant Cell Physiol 35, pp 811– 820 41 Park, J K., Y Matsuo, K Shimono, K Tanaka, T Nakagawa, A Yokota, H Matsuda, and M Kawamukai Matsuebacter chitosanotabidus gen nov., sp nov., an aerobic chitosanaza producing gram-negative bacterium belonging to the beta subclass of Proteobacteria Submitted for publication 42 Pelletier A, Sygusch J (1990), Purification and characterization of three chitosanaza activities from Bacillus megaterium P1 Appl Environ Microbiol 56, pp 844–848 43 Robert L.Switzer,Liam F, Garrity (1999), Experimental Biochemistry, W.H.Freeman and Company New Your, pp 79-157 44 Rout, S K (2001), Physicochemical, Functional, and Spectroscopic analysis of crawfish chitin and chitosan as affected by process modification Dissertation 45 Se-Kwon Kim, Niranjan Rajapakse (2005), Enzymatic production and biological activities of chitosanoligosaccharit (COS) : A review Cacbohydrate Polymer 62, pp 357 – 368 46 Shimosaka M, Nogawa M, Ohno Y, Okazaki M (1993), Chitosanaza from the plant pathogenic fungus, Fusarium solani f sp phaseoli: purification and some properties Biosci Biotechnol Biochem 57, pp 231–235 47 Tsai GJ, Wu ZY, Su WH Antibacterial activity of a chitosanoligosaccharide mixture prepared by cellulase digestion of shrimp 74 chitosan and its application to milk preservation J Food Prot 2000; 63: 747-52 48 Woo- jin Jung, Alfred Souleimanov, Ro- Dong Park, Donal L Smith, (2007), Enzymatic production of N-acetyl chitooligosaccharit by crude enzym derived from Paenibacillus illioisensis KJA-424, carbonhydrate Polymers 67, pp 256-259 49 Wen-Teish Chang, Ye-Chung Chen, Chia-Ling Jao Antifungal activity and enhancement of plant growth on shellfish chitin wastes Bioresource technology 98, 2007, 1224-1230 50 Xiao’e chen, wenshui Xia, Xiaobin Yu Purification and characterzation of two types chitosanaza from Aspergillus sp CJ22-326 Food Research International 38, 2005, 315-322 51 Yeon Jin Choi, Eun Jung Kim, Zhe Piao, Young Chul Yun, and Yong Chul Shin (2004), Purification and Characterization of Chitosanaza from Bacillus sp Strain KCTC 0377BP and its application for the production of chitosan oligosaccharit Applied and enviromental micobiology, pp 4522- 4531 52 You-Young JO1)3), Kyu-Jong JO1), Yu-Lan JIN1), Kil-Yong KIM1)2), Jae-Han SHIM1)2), Yong-Woong KIM1) and Ro-Dong PARK1)2) (2003), Characterization and Kinetics of 45 kDa Chitosanaza from Bacillus sp P16 Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 67( 9), pp 1875-1882 75 Danh Mục Các Bảng Biểu: PHỤ LỤC Bảng 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh tổng hợp chitosanaza nấm mốc Penicillium oxalicum Currie and Thom Thời gian (giờ) Hoạt độ enzym (U/ml) 30oC 37oC 40oC 0.020048 0.006610 0.009914 12 0.205136 0.130696 0.025128 24 0.035252 0.234646 0.084691 36 0.458276 0.373892 0.165586 48 0.546406 0.475902 0.211791 60 0.753510 0.597308 0.268650 72 0.832828 0.667584 0.237291 84 0.912144 0.618844 0.163238 96 0.934178 0.498276 0.080910 108 0.846084 0.416493 0.058314 76 Bảng 3.2: Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến sinh tổng hợp chitosanaza nấm mốc Penicillium oxalicum Currie and Thom Thời gian Hoạt độ chitosanaza pH môi trường khác (giờ) (U/ml) pH =6.0 pH=6.8 pH=7.0 pH=7.5 48 0.09914735 0.31850707 0.49573085 0.43376450 60 0.24662610 0.39662610 0.49325219 0.69774117 72 0.32346438 0.76590416 0.80556263 0.81919523 84 0.42017331 1.04103478 1.07693718 0.61470625 96 0.84893908 1.02244487 1.04847074 0.58744106 103 0.79834140 0.88487957 1.02355613 0.43376450 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh tổng hợp chitosanaza nấm mốc Penicillium oxalicum Currie and Thom Nguồn cacbon Nồng độ Hoạt độ (U/ml) Chitosanaza g/l 0.4241253 Tinh bột tan g/l 0.2093086 Glucoza g/l 0.3084548 77 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh tổng hợp chitosanaza nấm mốc Penicillium oxalicum Currie and Thom Nguồn nitơ Nồng độ Hoạt độ tổng (U/ml) NaNO3 g/l 0.4186172 Pepton g/l 0.7494044 Cao nấm men g/l 0.4714951 2,5g/l : 2,5 g/l 0.7975759 Peptone Cao nấm men, tỷ lệ 1:1 Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH đến khả thủy phân dịch enzym chitosanaza thô Mẫu Nồng độ đường (mg/ml) pH 0.363 pH 0.321 pH 0.103 pH 0.087 pH 0.122 pH 0.055 78 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt lực enzym chitosanaza Nhiệt độ Nồng độ đường (mg/ml) 30 0.1236 40 0.305 50 0.344 60 0.413 70 0.406 Bảng 3.7 Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến khả thủy phân dịch enzym chitosanaza thô Thời gian phản ứng (phút) Nồng độ đường (mg/ml) 10 0.243 30 0.276 50 0.429 60 0.502 90 0.646 120 0.883 150 0.939 180 0.937 210 0.868 79 Bảng 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ E/cơ chất đến lượng đường thu Tỷ lệ E/cơ chất Nồng độ đường (mg/ml) 1:1 0.385 1:1.5 0.246 1:2 0.442 1:2.5 0.458 1:3 0.4230 1:4 0.381 1:5 0.091 Bảng 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ dịch COS thu đến lượng kết tủa Tỷ lệ E/cồn Khối lượng kết tủa (g) 1:1 0.0043 1:2 0.0033 1:3 0.0038 1:4 0.0058 1:5 0.0044 1:6 0.00461 80 Danh mục hình vẽ: Hình 1.1.Đường chuẩn D-glucosamine – OD540nm 1.6 y = 2.4254x - 0.0747 1.4 R2 = 0.9939 OD 540 nm 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 nồng độ đường C (mg/ml) Hình 1.2 Đường chuẩn Protein đo mật độ quang bước sóng 595nm 0.6 y = 0.8491x - 0.0002 R2 = 0.9978 0.5 OD 595nm 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 nồng độ protein (mg/ml) 0.6 0.7 ... Các phương pháp sản xuất COS thuỷ phân axit hay chiếu xạ phổ biến, sử dụng phương pháp enzym hướng cho công nghệ sản xuất COS nay, ưu điểm an toàn, áp dụng quy mô sản xuất lớn, hiệu suất thu hồi... nguồn nguyên liệu sản xuất chitosan dồi dào, số hạn chế chitosan trình sản xuất sản phẩm ứng dụng đời sống sản xuất, việc nghiên cứu thu nhận enzym chitosanaza cần thiết để sản xuất chitosan oligosaccharit,... hành nghiên cứu trình sản xuất enzym chitosanaza như: Nhật, Canada, Mỹ, Hàn Quốc… Nhưng quy trình sản xuất chitosanaza chưa có quy mô công nghiệp tiến hành nghiên cứu viện trường đại học Trong trình