Phân tích và đánh giá sinh trưởng các dòng bạch đàn urô eucalyptus urophylla chuyển gen GSI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HUYỀN PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DỊNG BẠCH ĐÀN URƠ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HUYỀN PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DỊNG BẠCH ĐÀN URÔ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BÙI VĂN THẮNG Hà Nội - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: - Đây cơng trình nghiên cứu cộng tác với cộng khác; - Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; - Phần kết lại luận văn chưa công bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Huyền ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Bùi Văn Thắng, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh công nghệ chuyển gen” người thầy tận tình hướng dẫn, hỗ trợ kinh phí điều kiện cần thiết khác để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Việt, Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ tế bào tồn thể cán thuộc Bộ mơn tạo điều kiện thuận lợi để học tập, thực hoàn thành đề tài luận văn Trong q trình làm luận văn, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình tồn thể cán Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, giúp đỡ suốt q trình học tập thực thành cơng luận văn Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Huyền iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BÀNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN x MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Bạch đàn nói chung Bạch đàn Urơ nói riêng 1.2 Một số nghiên cứu chuyển gen vào Bạch đàn 1.3 Gen GS1 kết nghiên cứu chuyển gen GS1 vào trồng 10 1.4 Vector chuyển gen GS1 vào bạch đàn Urô 15 1.5 Các phương pháp phân tích đánh giá chuyển gen phịng thí nghiệm đồng ruộng 18 1.5.1 Đánh giá chọn lọc chuyển gen in vitro in vivo 18 1.5.2 Phân tích chuyển kỹ thuật sinh học phân tử 19 1.5.3 Phân tích chức sinh học gen chuyển 23 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.2.1 Phân tích, xác định dòng chuyển gen 25 2.2.2 Đánh giá sinh trưởng dòng chuyển gen giai đoạn nhà lưới 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phương pháp sàng lọc thể nhận gen GS1 in vitro 26 iv 2.3.2 Đánh tính kháng kháng sinh Kanamycin dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 trồng nhà lưới 27 2.3.3 Phương pháp tách DNA tổng số (lượng nhỏ) từ thực vật 27 2.3.4 Phương pháp tách chiết ADN tổng số (lượng lớn) từ thực vật 28 2.3.5 Phương pháp định tính định lượng DNA tổng số 29 2.3.6 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 30 2.3.7 Phương pháp tách chiết mRNA 30 2.3.8 Phương pháp tổng hợp cDNA 31 2.3.9 Phương pháp kiểm tra có mặt gen chuyển chuyển gen PCR 33 2.3.10 Phương pháp Southern blot 35 2.3.11 Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR) 36 2.3.12 Phương pháp nhân giống vơ tính dịng bạch đàn Urô 37 2.3.13 Đánh giá sinh trưởng dòng bạch đàn chuyển gen GS1 38 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1 Kết sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 môi trường kháng sinh chọn lọc in vitro 39 3.2 Kết sàng lọc dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 in vivo 42 3.3 Kết phân tích dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 kỹ thuật PCR 45 3.4 Kết phân tích dịng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 kĩ thuật lai Southern 48 3.5 Kết phân tích dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 kĩ thuật RT-PCR 49 3.6 Kết đánh giá mức độ ổn định gen chuyển dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 51 3.7 Kết đánh giá sinh trưởng dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 55 3.7.1 Sinh trưởng chiều cao dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 trồng nhà lưới 55 v 3.7.2 Đánh giá sinh khối tươi dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 đối chứng giai đoạn vườn ươm 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa đầy đủ Chữ viết tắt A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzylaminopurine cDNA Complementary DNA CS Cộng DNA Axic deoxiribonucleic E Eucalyptus Food and Agriculture Organization of the United FAO Nations GS Glutamin synthetase IBA Indol Butyric Acid Kan Kanamycin MS Murashige & Skoog NAA Napthalene Acetic Acid MT Môi trường NN&PTNT Nông nghiệp Phát triển nông thôn RNA Riboucleic acid RT-PCR Reverse transcription Polymerase Chain Reaction WT Wild type (hoang dại) vii DANH MỤC CÁC BÀNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 môi trường kháng sinh chọn lọc in vitro 26 Bảng 2.2 Cặp mồi kiểm tra gen nptII, 35S-P, NOS-T chuyển gen 33 Bảng 2.3 Cặp mồi kiểm tra gen GS1 chuyển gen 34 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra chuyển gen 34 Bảng 2.5 Cặp mồi kiểm tra gen GS1 từ mRNA chuyển gen .37 Bảng 3.1 Kết nghiên cứu chuyển gen GS1 vào bạch đàn Urô 40 Bảng 3.2: Ảnh hưởng kanamycin đến tỉ lệ cháy bạch đàn Urô không chuyển gen 43 Bảng 3.3: Kết đánh giá tính kháng kháng sinh kanamycin dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 nhà lưới 44 Bảng 3.4 Sinh trưởng chiều cao dịng Bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 đối chứng .56 Bảng 3.5 Sinh khối tươi dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 đối chứng (wt) .59 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vai trị GS q trình đồng hóa tái sử dụng nitơ (Stéphanie cs, 2009) 14 Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-GS1 17 Hình 1.3 Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA vector chuyển gen pBI121GS1 18 Hình 3.1 Chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 tái sinh môi trường chứa kanamycin 150 mg/l , 200 mg/l rễ môi trường rễ chọn lọc chứa 75 mg/l kanamycin 41 Hình 3.2 Các dịng Bạch đàn urơ chuyển gen GS1 trồng nhà lưới đánh giá tính kháng kháng sinh 45 Hình 3.3 DNA tổng số tách chiết từ dịng bạch đàn Urơ giả định chuyển gen GS1 46 Hình 3.4 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ dịng bạch đàn Urơ chuyển gen 46 Hình 3.5 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen nptII từ dòng bạch đàn Urô chuyển gen 47 Hình 3.6 Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter NOS-T từ dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 48 Hình 3.7 Kết Southern blot mẫu bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 49 Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm RT-PCR dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 mồi GS1-F/R Act-F/R 50 Hình 3.9 Các dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 chu kì nhân giống thứ 51 Hình 3.10 DNA tổng số dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 tách chiết chu kì gel agarose 0,8% 52 Hình 3.11 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 + NOS -T từ dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 53 58 bước đầu chuyển gen giai đoạn vườn ươm/nhà lưới, để đưa kết luận xác cần tiếp tục đưa trồng điều kiện tự nhiên đánh giá giai đoạn 12, 24 36 tháng tuổi Bên cạnh đó, kết đánh giá sinh trưởng chiều cao bạch đàn Urô chuyển gen GS1 so với đối chứng không chuyển gen gần tương đương với số cơng trình cơng bố chuyển gen GS1 đối tượng Dương lai số tác giả giới (Gallardo cs, 1999; Fu cs, 2003; Man cs, 2011) WT E-X7 E-X16 E-X17 E-X20 E-X29 Hình 3.15 Kiểu hình dịng chuyển gen GS1 đối chứng không chuyển gen giai đoạn tháng tuổi 3.7.2 Đánh giá sinh khối tươi dịng Bạch đàn urơ chuyển gen GS1 đối chứng giai đoạn vườn ươm Bên cạnh việc đánh giá sinh trưởng chiều cao chuyển gen đối chứng, sinh khối tươi tiêu sử dụng để so sánh Tổng sinh khối tươi dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 dịng đối chứng không chuyển gen (wt) trồng chậu đất nhà lưới tháng tuổi Các sau đo xác định chiều cao, rửa đất cân tổng sinh khối tươi toàn Kết thu trình bày bảng 3.5: 59 Bảng 3.5 Sinh khối tươi dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 đối chứng (wt) Mẫu nghiên cứu Tổng sinh khối Tỷ lệ sinh khối tươi (g) tăng (%) Đối chứng (wt) 4,50 ± 0,18f Dòng E-X7 5,56 ± 0,27e 23,56 Dòng E-X16 5,63 ± 0,10b 25,11 Dòng E-X17 5,25 ± 0,13d 16,67 Dòng E-X20 5,09 ± 0,11c 13,11 Dòng E-X29 5,28 ± 0,12a 17,33 Trung bình 5,36 ± 0,15 19,16 Ghi chú: Trong phạm vi cột, giá trị mang chữ khác sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 Kết thu cho thấy, tổng sinh khối tươi tồn dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 tăng cao so với dòng đối chứng rõ rệt Dòng E-X7 E-X16 tổng sinh khối tươi toàn 5,56 g 5,63 g vượt so với đối chứng 23,56% 25,11% dòng chuyển gen GS1 lại EX17, E-X20 E-X29 tổng sinh khối tăng vượt so với dòng đối chứng (wt) 16,67%, 13,11%, 17,33% Giá trị tăng trung bình tổng sinh khối dịng chuyển gen đối chứng khơng chuyển gen 19,16% Tuy nhiên, dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 đưa trồng giai đoạn vườn ươm tháng tuổi nên chưa đánh giá sinh trưởng, phát triển giai đoạn rừng trồng Cần tiếp tục có nghiên cứu đánh giá sinh trưởng sinh khối chuyển gen so với đối chứng giai đoạn rừng trồng để có sở lựa chọn đủ tiêu chuẩn làm giống 60 Hình 3.16 Sinh khối dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 đối chứng không chuyển gen (wt) 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1) Đã sàng lọc 41 chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 rễ môi trường rễ chọn lọc chứa kháng sinh kanamycin 75 mg/l Phân tích kĩ thuật sinh học phân tử xác định dòng chuyển gen (E-X7, E-X16, EX17, E-X20 E-X29) cho thấy mức độ ổn định gen chuyển sau chu kì nhân giống vơ tính 2) Đánh giá sinh trưởng dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 (ký hiệu: E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X29) cho thấy dịng có độ vượt chiều cao từ 17 – 28,3% độ vượt sinh khối tươi từ 13,11% - 25,11% so với dịng đối chứng khơng chuyển gen Kiến nghị 1) Tiếp tục xác định mức độ biểu protein gen GS1 dòng bạch đàn Urô chuyển gen thông qua kĩ thuật Western blot, ELISA… 2) Tiếp tục theo dõi đánh giá sinh trưởng dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 so với đối chứng không chuyển gen giai đoạn nhà lưới qua tiêu sinh trưởng đường kính thân, sinh khối khơ tồn cây, diện tích lá, điều kiện nghèo nitơ… 3) Đánh giá sinh trưởng dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 so với đối chứng không chuyển gen điều kiện đồng ruộng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Thị Hồng Gấm, Trần Thị Hương Giang, Bùi Phương Thảo, Nguyễn Văn Đoài, Nguyễn Thị Thơm, Bùi Văn Thắng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà (2016), Tạo thuốc chuyển gen GS1 tăng cường hiệu sử dụng nitrogen, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, Số 3/2016 Lê Đình Khả (2006), Lai giống rừng, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hồng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalyptus theo sinh trưởng kháng bệnh Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp Quyết định 4861/QĐ-BNN-TCLN Bộ NN PTNT ngày 17/11/2014 Thông tư số 44/2015/TT-BNNPTNT ngày 23/11/2015 Bộ trưởng Bộ NN&PTNT Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo thuốc kháng bệnh khảm kỹ thuật RNAi Luận văn Thạc sỹ sinh học Tài liệu tiếng Anh: Alwine J C., D J Kemp and G R Stark (1977), Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes, PNAS 74(12), pp 5350-5354 Anuário Estatístico Da Abraf (2013) Ano base 2011 Brasília, DF: ABRAF, 2012 136 p Disponível em: 227 | Rev Geama, Recife – (4): 216-228 Out-Dez 2017 | Online version ISSN: 2447-0740 | http://www.geama.ufrpe.br Becker T W., Caboche M., Carrayol E and Hirel B (1992), Nucleotide sequence of a tobacco cDNA encoding plastidic glutamine synthetase and light-inducibility, organ specificity and diurnalrhythmicity in the expression of the corresponding genes of tobacco and tomato, Plant Molecular Biology 19, pp 367-379 Boland DJ, Brooker MIH, Chippendale GM, Hall, NH, BP M, Johnson RD (2006), Forest trees of Australia, Melbourne, CSIRO, Australia Cantón F R., Suarez M F., Jose-Estanyol M and Cánovas F (1999), Expression analysis of a cytosolic glutamine synthetase genein cotyledons of scots pine seedlings: Developmental regulationand spatial distribution of specific transcripts, Plant Molecular Biology 40, pp 623-634 Clarke B, McLeod I, Vercoe T (2009), Trees for Farm Forestry: 22 promising species, The Rural Industries Research and Development Corporation, Barton, Kingston Clemente M T and Marquez A J (1999), Site-directed mutagenesis of Glu-297 from the [alpha] – polypeptide of Phaseolus vulgaris glutamine synthetase alters kinetic and structural propertiesand confers risistance to L-methionine sulfoximine, Plant Molecular Biology 40, pp 835-845 Cren M and Hirel B (1999), Glutamine synthetase in higher phants: Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell, Plant Cell Physiology 40, pp 1187-1193 Dubois F., Brugière N., Sangwan R S and Hirel B (1996), Localisation of tobacco cytosolic glutamine synthetase enzymes and the corresponding transcripts show organ-and cell-specific patterns of protein synthesis and gene expression, Plant Molecular Biology 31, pp 803-817 10 Eldridge K, Davidson J, HarwoodC and Van Wyk G (1993), Eucalyptus Domestication and Breeding Oxford University Press, Oxford 11 Elsbeth L Walker, N F Weeden, Crispin B Taylor, Pamela Green, Gloria M Coruzzi, (1995), Molecular evolution of duplicate copies of genes encoding cytosolic glutamine synthetase in Pisum sativum, Plant Molecular Biology 29, pp 1111-1125 12 FAO (2004), Priliminary review of biotechnology in forestry including genetic modification 13 Fu J., R Sampalo, F Gallardo, F M Cánovas and E G Kirby (2003), Assembly of a cytosolic pine glutamine synthetase holoenzyme in leaves of transgenic poplar leads to enhanced vegetative growth in young plants, Plant, Cell and Environment 26, pp 411–418 14 Fuentes S I., Allen D J., Ortiz-Lopez A and Hernández G (2001), Over expression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and grow at low nitrogen concentrations, Joural Experimental Botany 52, pp 1071-1081 15 Gallardo F., J Fu, F R Canton, A Garcia-Gutierrez, F M Cánovas and E G Kirby (1999), Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar, Planta 210, pp 19–26 16 GIT Forestry (2008), Cultivated eucalyptus global map 2008, http:// www.git-forestry.com 17 GLOBAL Eucalyptus map: a cartography information resource depicting Eucalyptus cultivated forests worldwide, (2009) 18 Grupo Sustainable Forest Management and Eucalyptus Grupo Empresarial ENCE, S.A 2009, 76 19 Hung TD, Brawner JT, Mede R, Lee DJ, Southerton S, Thinh HH, Dieters MJ (2015), Estimates of genetic parameters for growth and wood properties in Eucalyptus pellita F Muell to support tree breeding in Vietnam, Annals of Forest Science 72, pp 205‒217 20 Iglesias TG, Wilstermann D Eucalyptus universalis Global Cultivated Eucalyptus Forests Map 2008 version 1.0.1.In: GIT Forestry Consulting’s Eucalyptoligics: Information resources on Eucalyptus cultivation worldwide, (2008) 21 Ishiguri F, Diloksumpun S, Tanabe J, Iizuka K, Yokota S (2013), Stresswave velocity of tree and dynamic Youngʼs modulus of logs of 4-year-old Eucalyptus camaldulensis trees selected for pulpwood production in Thailand, Journal of Wood Science 59, pp 506‒511 22 Ireland, R J and Lea, Peter John (1999), The enzymes of glutamine, glutamate, asparagine and aspartate metabolism, Plant Amino Acids : biochemistry and biotechnology: Marcel Dekker Inc, New York, pp 49109 23 Jacek Biesiadka , Andrzej B Legocki (1997), Evolution of the glutamine synthetase gene in plants, Plant Science 128, pp 51–58 24 Jing Z P., F Gallardo, M B Pascual, R Sampalo, J Romero, A Torres, D E Navarra and F M Cánovas (2004), Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase, New Phytologiist 164, pp 137–145 25 Keadtidumrongkul Pornthep, Anongpat Suttangkakul, Phitsanu Pinmanee, Kanokwan Pattana, Chokchai Kittiwongwattana, Somsak Apisitwanich, Supachai Vuttipongchaikij (2017), Growth modulation effects of CBM2a under the control of AtEXP4 and CaMV35S promoters in Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum and Eucalyptus camaldulensis, Transgenic Res, DOI 10.1007/s11248-017-0015-4 26 Kevil Christopher G., Loren Walsh, F Stephen Laroux, Theodore Kalogeris, Mathew B Grisham, J.S Alexander (1997), An improved, rapid Northern protocol, Biochemical and Biophysical Research Communications 238(2), pp 277-279 27 Min-gang Li, Richard Villemur, Patrick J Hussey, Carolyn D Silflow, J Stephen Gantt, D Peter Snustad (1993), Differential expression of six glutamine synthetase genes in Zea mays, Plant Molecular Biology 23(2), pp 401-407 28 Man Huimin, Stephan Pollmann, Elmar W Weiler, Edward G Kirby (2011), Increased glutamine in leaves of poplar transgenic with pine GS1a caused greater anthranilate synthetase α-subunit (ASA1) transcript and protein abundances: an auxin-related mechanism for enhanced growth in GS transgenics?, Journal of Experimental Botany 62(13), pp 4423–4431 29 Matsuoka, T., et al (2001), A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize, Shokuhin Eiseigaku Zasshi 42 (1), pp 24–32 30 Miflin B J and Lea P J (1980), Ammonia assimilation In: Miflin BJ, ed The biochemistry of plants, vol San Diego, CA, USA: Academic Press, pp 169–202 31 Miflin B J and Habasd Dimah Z (2002), The role of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in nitrogen assimilation and posibilities for improvement in the nitrogen utilization of crops, Journal of Experimental Botany 53(370), pp 979-987 32 Nap Jan-Peter, Jacques Bijvoet and Willem J (1992), Biosafety of kanamycin-resistant transgenic plants, Transgenic Research 1, pp 239249 33 Norbert Brugière, Frédéric Dubois, Céline Masclaux, Rajbir S Sangwan, Bertrand Hirel (2000), Immunolocalization of glutamine synthetase in senescing tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaves suggests that ammonia assimilation is progressively shifted to the mesophyll cytosol, Planta 211, pp 519-527 34 Nozomu Sakurai, Toshihiko Hayakawa, Teiji Nakamura, Tomoyuki Yamaya (1996), Changes in the cellular localization of cytosolic glutamine synthetase protein in vascular bundles of rice leaves at various stages of development, Planta 200, pp 306-311 35 Oguchi Taichi, Yuko Kashimura, Makiko Mimura, Xiang Yu, Etsuko Matsunaga, Kazuya Nanto, Teruhisa Shimada, Akira Kikuchi, Kazuo N Watanabe (2014), A multi-year assessment of the environmental impact of transgenic Eucalyptus trees harboring a bacterial choline oxidase gene on biomass, precinct vegetation and the microbial community, Transgenic Res, DOI 10.1007/s11248-014-9809-9 36 Oliveira Igor C., Timothy Brears, Thomas J Knight, Alexandra Clark, and Gloria M Coruzzi (2002), Overexpression of Cytosolic Glutamine Synthetase Relation to Nitrogen, Light, and Photorespiration, Plant Physiol 129, pp 1170-1180 37 Ouyang L J., L M Li (2016), Effects of an inducible aiiA gene on disease resistance in Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis, Transgenic Res, DOI 10.1007/s11248-016-9940-x 38 Schlamp K., A Weinmann, M Krupp, T Maass, P.R Galle, A Teufel (2008), Blotbase: A northern blot database, Gene 427(1-2), pp 47-50 39 Shi Z, Xu D, Yang X, Jia Z, Guo H, Zhang N (2012), Ecohydrological impacts of Eucalyptus plantations: A review, Journal of Food, Agriculture and Environment 10(3&4), pp 1419-1426 40 Stéphanie M., Bernard and Dimah Z H (2009), The importance of cytosolic glutamine synthetase in nitrogen assimilation and recycling, New Phytologist 182, pp 608–620 41 Teulieres C., Grima Pettenati J., Curie C., Teissie J., Boudet A M (1991), Transient foreign gene expression in polyethylene/glycol treated or electropulsated Eucalyptus gunnii protoplast, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 25, pp 125-132 42 Tuong Van Nguyen (2008), Genetic engineering of grain sorghum (Sorghum bicolour (L.) Moench) for nutritional quality improvement Thesis submitted in requirement for Doctoral in Applied Biological Siences 43 Yu Xiang, Akira Kikuchi, Takayoshi Shimazaki, Akiyo Yamada, Yoshihiro Ozeki, Etsuko Matsunaga, Hiroyasu Ebinuma, Kazuo N Watanabe (2013), Assessment of the salt torelance and environmental biosafety of Eucalyptus camaldulensis harboring a mangrin transgene, J Plant Res 126, pp 141 – 150 44 Yu Xiang, Akira Kikuchi, Etsuko Matsunaga, Teruhisa Shimada, Kazuo N Watanabe (2013), Environmental biosafety assessment on transgenic Eucalyptus globulus harboring the choline oxidase (codA) gene in semiconfined condition, Plant Biotechnology 30, pp 73–76 45 Yu Xiang, Akira Kikuchi, Etsuko Matsunaga, Yoshihiko Morishita, Kazuya Nanto, Nozomu Sakurai, Hideyuki Suzuki, Daisuke Shibata, Teruhisa Shimada, Kazuo N Watanabe (2013), The Choline Oxidase Gene codA Confers Salt Tolerance to Transgenic Eucalyptus globulus in a SemiConfined Condition, Mol Biotechnol, DOI 10.1007/s12033-012-9575-y 46 Wessels CB, Crafford PL, Toit BD, Grahn T, Johansson M, Lundqvist SO, Säll H, Seifert T (2016), Variation in physical and mechanical properties from three drought tolerant Eucalyptus species grown on the dry west coast of Southern Africa, European Journal of Wood and Wood Products 74, pp 563‒575 47 Wroblewski Tadeusz, Urszula Piskurewicz, Anna Tomczak, Oswaldo Ochoa, Richard W Michelmore (2007), Silencing of the major family of NBS-LRR-encoding genes in lettuce results in the loss of multiple resistance specificities, The Plant Journal, DOI: 10.1111/j.1365313x.2007.03182.x 48 Wu YQ, Hayashi K, Liu Y, Cai Y, Sugimori M (2006), Relationships of anatomical characteristics versus shrinkage and collapse properties in plantation-grown Eucalyptus wood from China, Journal of Wood Science 52, pp 187‒196 49 Zhong Ping Jing, Fernando Gallardo, María Belén Pascual, Rafael Sampalo, José Romero (2004), Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar over expressing glutamine synthetase, New Phytologist 164, pp 137 – 145 PHỤ LỤC Thành phần môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) STT Thành phần Hàm lượng (mg/l) CaCl2 CaCl2.6H2O 332,02 440 KH2PO4 170 KNO3 1900,00 MgSO4 180,54 NH4NO3 1650,00 FeSO4.7H2O EDTA 27,8 37,3 Hoặc FeNaEDTA 36,70 H3BO3 6,2 KI 0,83 MnSO4.H2O 16,90 10 ZnSO4 8,60 11 CoCl2.6H2O 0,025 12 CuSO4.5H2O 0,025 13 NaMoO4.2H2O 0,25 14 MnSO4.H2O 16,90 15 Glycin 2,00 16 Thiamin HCl 0,10 17 Myo - inositol 100,00 18 Pyridoxine HCl 0,50 Thành phần môi trường MS* (giảm ½ nitơ tổng số) STT Thành phần Hàm lượng (mg/l) CaCl2 CaCl2.6H2O KH2PO4 332,02 440 170 KNO3 950 MgSO4 180,54 NH4NO3 825 FeSO4.7H2O EDTA 27,8 37,3 Hoặc FeNaEDTA 36,70 H3BO3 6,2 KI 0,83 MnSO4.H2O 16,90 10 ZnSO4 8,60 11 CoCl2.6H2O 0,025 12 CuSO4.5H2O 0,025 13 NaMoO4.2H2O 0,25 14 MnSO4.H2O 16,90 15 Glycin 2,00 16 Thiamin HCl 0,10 17 Myo - inositol 100,00 18 Pyridoxine HCl 0,50 Các công thức môi trường tái sinh bạch đàn Urô sử dụng nghiên cứu Loại môi trường Thành phần môi trường MS giảm 1/2 nitơ tổng số + mg/l BAP + 0,5 mg/l Km-EU3 NAA + 100 ml/l ND + 20 g/l sucrose + g/l phytagel + 400 mg/l cefotaxime + 150 mg/l kanamycin, pH = 5,8 MS giảm 1/2 nitơ tổng số + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l Km-EU4 NAA + 100 ml/l ND + 20 g/l sucrose + g/l phytagel + 400 mg/l cefotaxime + 150 mg/l kanamycin, pH = 5,8 MS giảm ½ nitơ tổng số + 85 mg/l NaH2PO4 + 0,3 mg/l BAP + 0,1 mg/l IBA + 0,05 mg/l NAA + 0,3 mg/l vitamin Km-EU5 B2 + 0,05 mg/l axít folic + 20 g/l sucrose + g/l phytagel + 400 mg/l cefotaxime + 200 mg/l kanamycin, pH = 5,8 ½ MS* bổ sung 0,3 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA + 20 g/l Km-EU6 sucrose + g/l agar + 300 mg/l cefotaxime + 75 mg/l kanamycin, pH = 5,8 Cơng trình cơng bố liên quan đến luận văn ... chiết DNA đánh giá sinh trưởng giai đoạn vườn ươm + Giá thể ngôi: đất đồi tầng B 2.3.13 Đánh giá sinh trưởng dòng bạch đàn chuyển gen GS1 Các dòng bạch đàn chuyển gen không chuyển gen nhân giống... sinh học phân tử - Đánh giá sinh trưởng dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 giai đoạn nhà lưới/vườn ươm Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học: Phân tích, đánh giá chọn tạo dịng bạch đàn Urô chuyển gen. .. Kết phân tích dịng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 kĩ thuật RT-PCR 49 3.6 Kết đánh giá mức độ ổn định gen chuyển dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 51 3.7 Kết đánh giá sinh trưởng