Khóa luận tốt nghiệp

Khóa luận tốt nghiệp

Mở Đầu Đặt vấn đề Cà chua là nguồn thực phẩm quan trọng trong đời sống thờng ngày của con ng-ời. Đây là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, dễ trồng, vốn chi phí ban đầu thấp, có thể mở rộng sản xuất ở hầu khắp các vùng sinh thái khác nhau. Nhu cầu tiêu thụ cà chua ở nớc ta rất lớn và nhu cầu này ngày càng tăng vì cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dỡng cao, trong cà chua có chứa nhiều loại vitamin nh A, B, C, B2, PP, K,và các chất khoáng nh Ca, Fe, P, S, Na, K, Mg và đ-ờng. Mặt khác, cà chua là loại thực phẩm dễ chế biến và sử dụng, có thể dùng ăn tơi, nấu, chế biến thành cà chua khô, cà chua bột, tơng cà chua,Bên cạnh đó, cà chua còn là mặt hàng xuất khẩu có nhiều triển vọng vì sản phẩm cà chua ở nớc ta c thu hoch vào đúng thời điểm nhiều nớc không trồng đợc trong mùa đông lạnh [15].Tuy nhiên, năng suất và chất lợng cà chua phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Bởi cà chua là loại cây rất dễ bị sâu bệnh phá hại, đặc biệt là những bệnh do nấm, vi khuẩn, virus. Chúng gây hại từ giai đoạn cây con trong vờn ơm, giai đoạn trồng ngoài sản xuất cho đến khi thu hoạch [16]. Do đó làm giảm năng suất đồng thời ngời trồng phải sử dụng rất nhiều loại thuốc phòng trừ sâu bệnh với liều lợng cao hơn khuyến cáo rất nhiều lần, vì thế chúng thờng gây độc cho ngời tiêu dùng do d lợng trong sản phẩm. Bên cạnh đó, với năng suất trung bình 14 tấn/1 ha, sản lợng hàng năm trên cả nớc là 100 ngàn tấn mới chỉ đảm bảo cho bình quân đầu ngời trên cả nớc hơn 1 kg sản phẩm một năm. Mặt khác, do vùng trồng cà chua và thời gian thu hoạch thờng tập trung nên sản phẩm có nơi có lúc thừa, giá bán quá rẻ, dập nát và h hỏng khi vận chuyển và bảo quản, . [15]. Vì vậy, việc tạo ra những giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh, nâng cao năng suất, chất lợng là rất cần thiết.Trớc đây, muốn tạo ra đợc một giống cây mới, ngời ta đã phải mất rất nhiều năm bằng cách lai tạo, chọn lọc qua nhiều thế hệ, tuy nhiên không phải lúc nào cũng tạo ra đợc giống cây mang đợc các đặc tính nh mong muốn. Nhng ngày nay, công nghệ gen đã giúp cho việc chuyển gen u việt vào việc lai tạo giống mới trong nông nghiệp đợc tiến hành một cách nhanh chóng và dễ dàng hơn [13].1 Tuy nhiên, một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu dẫn tới sự thành công của công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và chuyển gen vào thực vật nói riêng là việc xây dựng hệ thống tái sinh có hiệu quả cao [14]. Chính vì vậy chúng tôi quyết định tiến hành"Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây cà chua (Lycopersicum esculentum L.) phục vụ chuyển gen" nhằm khảo sát khả năng tái sinh in vitro cây cà chua t thân mầm để phục vụ cho việc chuyển gen sau này.2. Nội dung nghiên cứu. - Tìm hiểu ảnh hởng cuả một số chất kích thích sinh trởng lên khả năng nảy mầm của hạt. - Tìm hiểu khả năng tái sinh cây từ thân mầm. Đề tài đợc thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Sinh học - Khoa KHTN & XH - ĐHTN.Chơng 1. Tổng Quan Tài Liệu1.1. Giới thiệu chung về cây cà chua2 1.1.1. Nguồn gốc, phân loạiCà chua có nguồn gốc ở Peru, Bolivia, Ecuado. Trớc khi tìm ra châu Mỹ thì cà chua đã đợc trồng ở Peru và Mehico. Những loài cà chua hoang dại gần gũi với loài cà chua trồng ngày nay vẫn tìm thấy ở dọc theo dãy núi Andes (Peru), đảo Galapagos (Ecuado) và Bolivia. Các nhà vờn đã trồng, thuần dỡng những giống cà chua quả nhỏ và dạng hoang dại. Những giống và loài hoang dại này đợc mang t nơi xuất xứ đến Trung Mỹ, rồi đến Mehico [2].Đến đầu thế kỷ XVIII, các giống cà chua đã trở nên phong phú và đa dạng, nhiều vùng đã trồng cà chua làm thực phẩm. Vào thế kỷ XIX (1830) quả cà chua đã trở thành loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn thờng ngày. Cuối thế kỷ XIX, trên 200 dòng, giống cà chua đợc giới thiệu một cách rộng rãi trên thế giới [2].Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phân lớp bc h (Lamiidae), lớp ngọc lan (Magnoliopsida), có tên khoa học là Lycopersicum esculentum L., cà chua còn có nhiều tên gọi khác nhau nh Lycopersicum esculentum Mill, L. lycopersicum, S. lycopersicon, L. kort .[15]. Từ lâu có nhiều tác giả nghiên cứu về phân loại cà chua và lập thành hệ thống phân loại theo quan điểm riêng của mình. Theo H.J.Muller (1940) thì loài cà chua trồng hiện nay thuộc chi phụ Eulycopersion C.H.Muller. Tác giả phân loại chi phụ này thành 7 loài, loài cà chua trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum L.) thuộc loài thứ nhất [2]. Theo L.B.Lihner Nonnecke (1989) thì L.esculentum là loài cà chua trồng có 4 biến chủng sau.+ L. esculentum var. Commune là giống cà chua thông thờng. Hầu hết những giống cà chua trồng đều thuộc biến chủng này. Đặc điểm là thân, lá rậm rạp, sum suê, quả có khối lợng trung bình lớn.+ L. esculentum var. Grandifolium. Lá của biến chủng này to, giống lá khoai tây, mặt lá rộng và láng bóng, số lá trên cây ít. + L. esculentum var. Validum. Cà chua anh đào, cây đứng, mập. + L. esculentum var. Pyriforme. Cà chua hình quả lê. Tất cả các loài cà chua đều có số nhiễm sắc thể 2n = 24.3 1.1.2. Đặc điểm sinh học Cà chua là loại thân thảo, sống theo mùa, a khí hậu ấm áp và ánh sáng đầy đủ. Có ánh sáng cây mới sinh trởng và phát triển tốt. Cà chua sinh trởng và phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 22oC -26oC. Nếu nhiệt độ trên 35oC cây cà chua ngừng sinh trởng, khi nhiệt độ xuống dới 10oC cà chua không ra hoa. Mặc dù đợc xếp vào nhóm cây tơng đối chịu hạn song cà chua cũng là cây a nớc, cà chua cần một lợng nớc lớn cho suốt quá trình sinh trởng, phát triển nên cà chua cần phải đợc tới nhiều nớc, nếu để ruộng trồng cà chua lúc thừa lúc thiếu nớc sẽ làm cho quả dễ bị nứt. Vào thời gian ra hoa nếu thiếu nớc sẽ làm cho hoa đợc hình thành ít, dễ bị rụng quả [12].Cà chua có thân tròn, phân nhánh nhiều, cao 0.6 - 1m, toàn thân có lông mềm và lông tuyến, đặc tính của cây cà chua là bò lan ra xung quanh hoặc mọc thành bụi. Lá kép lông chim phân thuỳ, số lợng thuỳ không cố định. Lá chét hình trứng thuôn dài 7-12cm, rộng 2-5 cm, đầu nhọn hoặc tù, gốc lệch, mép khía, răng thô, cuống dài 2-3cm [6]. Hoa màu vàng, mọc thành chùm ở kẽ lá, mỗi chùm 5-8 hoa hoặc nhiều hơn. Khi gặp những điều kiện bất lợi nh quá lạnh, quá nóng, quá khô hạn, quá ẩm ớt hoặc thiếu dinh dỡng, sâu bệnh gây hại, .thì sẽ làm cho hoa và quả dễ bị rụng. Thờng ngời ta sử dụng chất kích thích sinh trởng 2,4D để ngăn cản hiện tợng này [3].Quả cà chua có hình tròn hoặc hơi dẹt, cũng có giống quả hình trứng, hình quả lê, . Khi quả chín, tuỳ thuộc vào đặc điểm của giống mà có màu sắc khác nhau nh màu đỏ, màu vàng, màu vàng hồng, . Chất màu chủ yếu của cà chua là carotinoit, chlorophyll, theo mức độ chín, lợng chlorophyll giảm, lợng carotinoit tăng. Trong quả cà chua có chứa thịt quả, chất dịch chua ngọt và nhiều hạt dẹt hình thận [6]. Lớp thịt càng dày, buồng đựng hạt càng bé, chất lợng quả càng cao. ở độ chín hoàn toàn, lợng vitamin C và carotinoit đạt tỷ lệ cao nhất, lợng acid giảm, lợng đờng tăng, thịt quả có vị ngọt hơn lúc còn xanh. Lợng protopectin giảm làm cho vỏ dễ tách ra và quả bị mềm. Dựa vào đặc điểm hình thái của quả mà ngời ta phân loại cà chua thành các nhóm khác nhau. ở nớc ta, các giống cà chua đang đợc trồng chủ yếu thuộc ba nhóm 4 chính là nhóm cà chua múi, nhóm cà chua hồng và nhóm cà chua bi (hay còn gọi là cà chua ta hoặc cà chua kiu) [15].- Cà chua múi: Quả to, nhiều ngăn tạo thành múi. Quả có vị chua, nhiều hạt, ăn không ngon, nhng cây mọc khoẻ, sai quả, chống chịu sâu bệnh tốt. Giống điển hình là cà chua múi Hải Phòng.- Cà chua hồng: Là loại cà chua đợc trồng phổ biến hiện nay. Quả có hình dạng nh quả hồng, không có múi hoặc múi không rõ. Chất lợng ăn tơi cũng nh lúc chế biến và nấu ăn cao do thịt quả đặc, nhiều bột, lợng đờng cao. Phần lớn trong nhóm này là các giống đợc lai tạo, chọn lọc trong nớc và một số giống nhập nội. Một số giống th-ờng đợc trồng là PT18, HT7, HT14, VT3, HP1, MV1, .- Cà chua bi: Là giống địa phong, gặp rải rác ở các vùng núi cao và ven biển miền trung, chúng có lợng acid cao, hạt nhiều, năng suất thấp do quả bé nhng khả năng chống chịu tốt nên đợc sử dụng làm vật liệu tạo giống. Gần đây, nhiều vùng trong nớc đã trồng các giống cà chua quả nhỏ nhập nội. Những giống này cho năng suất và chất lợng tốt, đợc sử dụng chủ yếu nh một loại quả sau bữa ăn. Các giống có màu sắc và hình dáng rất đa dạng [23].1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụngCà chua là cây rau có giá trị kinh tế cao, đợc trồng rộng rãi trên thế giới. Cà chua có thể cho năng suất cao, sinh trởng nhanh, bảo quản đợc tơng đối dài hơn so với các loại rau khác, quả có khả năng vận chuyển đợc thuận lợi và đi xa [3]. Vì vậy trồng cà chua đã thực sự mang lai hiệu quả kinh tế cao.Theo FAO (1999), hiện có tới 158 nớc trồng cà chua. Diện tích cà chua trên thế giới là 3 254 000 ha, năng suất là 27.77 tấn/ha, sản lợng 90.36 triệu tấn. Một số n-ớc có năng suất cà chua cao trên 100 tấn/ha nh Hà Lan (425 tấn/ha), Thụy Sĩ (383 tấn/ha), Thụy Điển (327 tấn/ha), Na Uy (291 tấn/ha), Ailen (201 tấn/ha), .[2].Cà chua là loại rau cho hiệu quả kinh tế cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nớc. ở Mỹ (1997) tổng giá trị xuất khẩu một hecta cà chua cao hơn 4 lần so với lúa nớc, 20 lần so với lúa mỳ [2]. 5 ở Việt Nam, lịch sử trồng cà chua mới chỉ hơn 100 năm nay. Trong những năm gần đây ở nớc ta diện tích trồng cà chua đang ngày một tăng. Điều kiện thiên nhiên, khí hậu và đất đai nớc ta rất thích hợp cho cà chua sinh trởng và phát triển. Vì vậy trên khắp nớc ta từ bắc tới nam hầu hết đâu cũng trồng đuợc cà chua [3]. Diện tích trồng cà chua hàng năm khoảng 10 000 ha [15]. Cà chua là cây rau quan trọng của nhiều vùng chuyên canh, là cây trồng sau lúa mùa sớm cho hiệu quả kinh tế cao.Cà chua đợc trồng chủ yếu ở vùng đồng bằng sông hồng và trung du bắc bộ. ở Miền Nam có Đà Lạt (Lâm Đồng) là nơi sản xuất cà chua cho năng suất cao. Song trong cả nớc cha có vùng sản xuất lớn, cà chua đang đợc trồng rải rác ở nhiều nơi. Đây cũng là khó khăn trong việc quy hoặch vùng sản xuất cà chua cho mục đích xuất khẩu và chế biến.Quả cà chua có giá trị dinh dỡng rất cao, thành phần dinh dỡng gồm glucid, protein, P, Ca, caroten, Fe, các vitamin B1, B2, PP, C [6]. Vitamin C trong quả cà chua khi nấu chín vẫn giữ đợc phần lớn khối lợng, chỉ bị bay hơi tơng đối ít vì trong quả cà chua có các acid xitric và acid táo là những loại acid vừa có tác dụng bảo vệ vitamin C vừa có tác dụng tiêu đợc các chất béo [3]. Cà chua chín cây có chất lợng tốt hơn so với cà chua chín trong thời gian bảo quản. Đặc biệt, qu c chua cú cha hm lng lycopen khỏ cao. Lycopen hot ng nh cht chng oxy húa cc mnh trong c th, chng li tỏc hi ca cỏc gc t do, khụi phc nhng t bo b tn hi, tiờu dit nhng phõn t thoỏi húa, kim ch quỏ trỡnh oxy húa ca DNA do ú c chua cú tỏc dng tt i vi nhiu bnh nh: ung th, tim mch, chng lóo húa,Do có thành phần dinh dỡng phong phú nên cà chua đã trở thành món ăn thông dụng của nhiều nớc trên 150 năm nay và là cây rau ăn quả đợc trồng rộng rãi khắp các châu lục [2]. Cà chua cũng là loại rau có nhiều cách sử dụng. Có thể dùng quả tơi, trộn salat, nớc giải khát, xào nấu, .hoặc đợc chế biến thành nhiều loại sản phẩm khác nhau nh: cà chua cô đặc, nớc quả, nớc sốt, tơng, cà chua đóng hộp, .[19].Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dỡng và kinh tế cao nhng ở một số vùng ở nớc ta nó còn giữ giá trị thấp trong cơ cấu cây trồng. Hiện nay, các nghiên cứu trên đối tợng này chỉ dừng lại ở việc sử dụng hệ thống cây trồng hoàn chỉnh [13]. Sử dụng những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào đã thiết lập một công cụ hữu 6 ích cho việc nghiên cứu và tạo thành công cây cà chua chuyển gen nhằm nâng cao năng sut, chất lợng của cà chua.1.2. Công nghệ tế bào thực vật trong cải tạo giống cây trồng1.2.1. Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vậtHệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật đợc hoàn thiện và phát triển mạnh từ những năm 60 của thế kỷ XX khi tìm ra môi trờng nuôi cấy chuẩn và đặc biệt sử dụng các chất hormone sinh trởng nh auxin, gibberillin, cytokinin, .để kích thích sự phân bào và tăng trởng tế bào cũng nh tạo thành các mô và tái sinh cây toàn vẹn từ tế bào đợc nuôi cấy[1].Ngày nay ngời ta có thể nuôi cấy bất kỳ cơ quan nào của cây (chồi, lá, thân, rễ, hoa, .) để tạo thành mô sẹo và từ đó điều khiển cho tế bào biệt hoá thành các mô khác nhau (rễ, thân, lá, .) và tái sinh thành cây trởng thành.Trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì môi trờng dinh dỡng để duy trì sự sống cho tế bào là rất quan trọng. Môi trờng bao gồm các thành phần đa lợng nh: NH4, NO3, SO4, Ca, Cl, K, Na, .Các chất vi lợng nh: Fe, Mg, Mn, Zn, I, Bo, Mo, Cu, . Ngoài ra còn phải bổ sung đờng vào môi trờng nuôi cấy vì cây nuôi cấy không hoàn toàn tự dỡng [27]. Đờng đợc sử dụng làm nguồn cacbon chủ yếu cung cấp năng lợng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu cho môi trờng nuôi cấy [25]. Các đờng thờng dùng trong nuôi cấy là đờng glucose, hoặc sucrose. Cho đến nay, có rất nhiều môi trờng dinh dỡng khoáng đợc tìm ra nh môi trờng MS (1962), môi trờng Knop (1974), môi trờng Linsmainer và Skoog (1963), môi trờng Gamborg (1968), môi trờng VW (Vacine Went), . Trong đó môi trờng MS là phù hợp nhất đối với đa số các loài thực vật [24]. Tuy nhiên, không phải loài nào cũng phù hợp với môi trờng MS nh cẩm chớng (Dianthus spp), hơng nhu (Ocmum gratissmum) chỉ sinh trởng đợc khi lợng khoáng giảm một nửa [26]. Ngoài chất dinh dỡng thì các hormone sinh trởng cũng đóng vai trò hết sức quan trọng trong định h-ớng cho quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [4].Bên cạnh đó phải kể đến vai trò của các yếu tố ngoại cảnh nh thời gian, độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ pH, .Chúng gây ảnh hởng lên sự sinh trởng và tái sinh của tế bào, mô sẹo và cây con [1].7 1.2.1.1. Cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vậtKỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở khoa học là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt đề xuất năm 1902: Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật [4]. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể. Chính vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi một tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Để thực hiện đợc điều này tế bào thực vật phải trải qua hai quá trình là phản biệt hoá và tái biệt hoá [11].- Phản biệt hoá là giai đoạn đa tế bào từ trạng thái đã biệt hoá trở lại trạng thái cha biệt hoá. Quá trình này biến tế bào đã biệt hoá thành những tế bào có hình thức giống nh những tế bào ở đỉnh sinh trởng (tế bào mầm phôi). Chúng có đặc điểm là tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ li ti hoặc không có, nhân to, kích thớc tế bào lớn. Những tế bào nh vậy coi nh đã đc phản biệt hoá xong và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định chúng sẽ phát triển thành cơ thể mới.- Tái biệt hoá là giai đoạn đa tế bào đã phản biệt hoá phát triển thành cây hoàn chỉnh. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào đã biệt hoá tham gia hình thành nên các tế bào phôi và hai loại tế bào khác là tế bào trung gian và tế bào khổng lồ có không bào rất lớn. Trong đó, chỉ có tế bào phôi và tế bào trung gian là phân chia còn các tế bào khổng lồ thì chết dần. Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh chỉ có ở trong các tế bào phôi, nhng nếu trong quần thể không có các tế bào khổng lồ thì các tế bào phôi không thể phát sinh thành cơ thể mới đợc mà chỉ những quần thể nuôi cấy có đủ các loại tế bào khác nhau mới có khả năng tái sinh [11].Sự tái biệt hoá và phản biệt hoá là quá trình hoạt hoá và ức chế hoạt động của các gen. Trong một giai đoạn nhất định của cây, một số gen nào đó đang ở trong trạng thái ức chế không hoạt động đợc hoạt hoá để cho ra một tính trạng biểu hiện mới. Ngợc lại, một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt động. Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chơng trình đã đợc lập sẵn trong cấu trúc hệ gen của tế bào, giúp cho sự sinh trởng, phát triển của cơ thể thực vật đợc hài hoà. Sự hoạt động hài hoà của của 8 các tế bào và mô cơ quan còn phụ thuộc vào tế bào nằm trong khối mô, cơ quan của cơ thể. Khi tách riêng từng tế bào hoặc làm giảm kích thớc khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gen của tế bào [4].1.2.1.2. Một số yếu tố ảnh hởng lên quá trình nuôi cấy mô tế bào+ ảnh hởng của các chất điều hoà sinh trởngCác chất điều hoà sinh trởng là thành phần không thể thiếu trong môi trờng nuôi cấy. Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của các chất điều hoà sinh trởng phụ thuộc vào: Nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hoà sinh trởng, loại mẫu nuôi cấy, .[20].Các chất điều hoà sinh trởng bao gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin. Tỉ lệ, hàm lợng hai nhóm chất điều hoà sinh trởng này trong môi trờng nuôi cấy khác nhau sẽ định hớng cho sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy khác nhau[5].- Nhóm auxin: Đợc đa vào môi trờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trởng và giãn nở của tế bào, tăng cờng các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính.Một số loại auxin thờng dùng trong nuôi cấy: IAA ( Indole acetic acid); IBA (Indole butyric acid); 2.4-D (2.4 - Dichlorophenoxy acetic acid) ; -NAA (-Naphthalene acetic acid). Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, phạm vi sử dụng từ 0.1 - 1mg tuỳ theo mục đích và vật liệu nuôi cấy. Auxin đợc thêm vào sẽ kết hợp với các auxin nội sinh để điều khiển chiều hớng và cờng độ các quá trình sinh trởng [18] .Tuỳ theo loại auxin, hàm lợng sử dụng và đối tợng nuôi cấy . mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trởng của mô, hoạt hoá sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo [20].- Nhóm cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trởng của chồi in vitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trởng của mô sẹo nhng có ảnh hởng dơng tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy. Vì thế, trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt auxin là cần thiết nh-9 ng trong giai đoạn sau của phôi phải đợc nuôi cấy trên môi trờng có cytokinin để biệt hoá chồi [21].Một số loại cytokinin thờng dùng trong nuôi cấy: zeatin; kinetin; BAP,Hàm lợng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0.1-2.0mg/l. ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Ngợc lại, ở nồng độ thấp hơn, cytokinin biểu hiện hiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trởng của chồi giảm.Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần cả hai. Còn đa số các trờng hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tổ hợp tỉ lệ khác nhau [20]. Theo Bhojwani(1980) ở một số loài, môi trờng nuôi cấy chỉ có một loại cytokinin cũng cho hệ số tạo chồi cực đại. Với các cây ngũ cốc sự phối hợp của hai hay nhiều loại cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng cytokinin riêng rẽ. Tuy nhiên, muốn có tơng quan sinh trởng tối u thì phải có cân bằng hormone thích hợp. Sự biệt hoá cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo thành rễ, ngợc lại sẽ đẩy mạnh sự biệt hoá chồi, còn nếu tỷ lệ đó là trung bình thì mô sẹo đợc hình thành. Đó là nguyên tắc chung, còn phản ứng của các loại mô là không giống nhau [25]. Vì thế mỗi loại mô ở từng giai đoạn sinh trởng khác nhau thì tổ hợp nồng độ giữa auxin và cytokinin là rất quan trọng.Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy ngời ta còn sử dụng thêm các chất điều hoà sinh trởng khác nh GA (thông dụng nhất là GA3), ABA, etylen,Sự có mặt của GA3 trong môi trờng nuôi cấy sẽ tăng cờng quá trình vơn thân của chồi và tạo cây hoàn chỉnh ở một số loài thực vật. Tuy nhiên đối với một số đối tợng thì việc bổ sung GA3 là không cần thiết vì nó ảnh hởng xấu đến sự hình thành chồi bất định, sự tạo rễ và phát sinh phôi. ABA chỉ đợc sử dụng trong nuôi cấy nhằm kìm hãm sự sinh trởng của chồi, tham gia bảo quản lơng thực và quỹ gen in vitro. ở một số trờng hợp ABA có tác dụng thúc đẩy sự tạo rễ nh trong nuôi cấy khoai lang, cà chua, đậu tơng,Trong nuôi cấy phôi, việc bổ sung ABA vào môi tr-ờng nuôi cấy là cần thiết vì ABA giúp phôi chống lại sự khô hoá [25].+ ảnh hởng của mẫu nuôi cấy lên khả năng tái sinh cây10 [...]... 40 20 0 R1 R2 R3 R4 mẫu tạo chồi(%) R5 tỉ lệ Biểu đồ 3.4 ảnh hởng của BAP lên khả năng tái sinh cây Hình 3.4 Các mẫu tái sinh từ môi trờng R3 27 Kết luận và đề nghị Kết luận Dựa vào số liệu thu đợc và kết quả phân tích ở trên, chúng tôi rút ra những kết luận sau: 1 Các nồng độ BAP khác nhau trong môi trờng nuôi cấy có ảnh hởng khác nhau lên tỷ lệ nảy mầm của hạt cà chua Trong đó, ở nồng độ 3mg/l BAP... trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, 1997 2 Tạ Thu Cúc, Kỹ thuật trồng cà chua, NXB Nông nghiệp, 2002 3 Đờng Hồng Dật, Sổ tay ngời trồng rau, NXB Hà Nội, 2002 4 Hồ Huỳnh Thuỳ Dơng, Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, 2005 5 Trịnh Đình Đạt, Công nghệ sinh học, tập 4, công nghệ di truyền , NXB Giáo dục 2006 6 Lê Trần Đức, Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệp, 1997 7 Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức,... đồng đều, sự chênh lệch tỉ lệ nảy mầm giữa các môi trờng không cao Tỉ lệ nảy mầm cao nhất là 64.4% ở môi trờng có bổ sung BAP 0.2 mg/l và kinetin 1 mg/l (C2-2) Từ đó rút ra kết luận: Sự phối hợp của BAP và kinetin có tác động khá tốt lên khả năng nảy mầm của hạt Có thể sử dụng môi trờng C2-2 (môi trờng có bổ sung 0.2mg/l BAP và 1mg/l kinetin) vào việc tạo nguồn nguyên liệu từ hạt cho nuôi cấy sau này... gen đợc đa vào canh tác với mục đích thơng mại trên thế giới trong năm 2006, Cơ quan dịch vụ quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp ISAAA 11 Nguyễn Trọng Lạng, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Tâm, Sinh học tế bào, NXB Nông nghiệp, 2005 12 Hoàng Minh, Kỹ thuật trồng và chăm sóc da hấu, bí ngồi, cà chua, ngô, NXB Lao động Xã hội, 2005 13 Trơng Thị Bích Phợng, Hồ Thị Kim Khánh,... quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2003, trang 820- 824 18 Phan Hữu Tôn, Giáo trình công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng, Trờng ĐH Nông nghiệp I, 2005 19 Nguyễn Văn Viên, Đỗ Tấn Dũng, Bệnh hại cà chua do nấm, vi khẩn và biện pháp phòng chống, NXB Nông nghiệp, 2004 20 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, Công nghệ sinh học, tập 2, Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục, 2006 21 Vũ Văn Vụ,... 2.2.4 Chỉ tiêu đánh giá Tổng số hạt nảy mầm Tỷ lệ nảy mầm = * 100% Tổng số hạt cấy vào môi trờng Tổng số mẫu tạo chồi Tỷ lệ tạo chồi = * 100% Tổng số mẫu cấy vào môi trờng 19 Chơng 3 Kết quả và thảo luận 3.1 ảnh hởng của một số chất kích thích sinh trởng lên khả năng nảy mầm của hạt 3.1.1 ảnh hởng của BAP Để tiến hành theo dõi ảnh hởng của BAP lên quá trình nảy mầm của hạt, chúng tôi tiến hành cấy... (C1-3) có tỉ lệ hạt nảy mầm cao nhất (77.8%) Tuy nhiên, trên môi trờng không bổ sung BAP (C1-0) mặc dù tỉ lệ nảy mầm chỉ đứng thứ hai (60%) nhng cây mọc trên môi trờng này có độ đồng đều cao và phát triển tốt nhất Chiều dài cây mầm đạt từ 5 - 6 cm, lá mầm cân đối, thân mập Trong khi ở các môi trờng khác chiều dài cây mầm chỉ khoảng 2- 4 cm, lá mầm bé, thân mảnh Nh vậy, nồng độ BAP ở mức vừa phải (3mg/l)... trồng [5] Bên cạnh đó, chất lợng của mẫu cấy phụ thuộc vào chất lợng của cây cho mẫu, thờng ngời ta lấy mẫu từ những cây có những đặc điểm u việt cần quan tâm: Sinh trởng, phát triển mạnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi (hạn, lạnh, mặn,) hoặc sâu bệnh, cho sản lợng và chất lợng ngon của quả, hạt, Tuỳ thuộc vào mục đích và khả năng nuôi cấy mà ngời ta chọn mẫu cho phù hợp: Để phục vụ cho nhân... trờng có sự sai khác đáng kể Trong đó, tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt giá trị cao nhất ở môi trờng MS có bổ sung 0.5mg/l BAP( 86.6%) và thấp nhất ở môi trờng MS có bổ sung 1mg/l BAP Từ kết quả, đó chúng tôi kết luận môi trờng thích hợp nhất để tái sinh chồi từ thân mầm là môi trờng R3 ( môi trờng có bổ sung 0.5mg/l BAP) Bảng 3.4 ảnh hởng của BAP lên khả năng tái sinh cây Kí hiệu Nồng độ BAP (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo... Bên cạnh đó, nguồn gốc, tuổi sinh lý của mẫu cấy cũng ảnh hởng đến khả năng tái sinh của mô Các mảnh nuôi cấy càng nhỏ thì tỉ lệ sống càng thấp và các mô có nguồn gốc từ chồi đỉnh có khả năng sinh trởng tốt hơn các mô có nguồn gốc từ chồi nách [25] Tuy vậy, nguyên tắc căn bản là mẫu cấy phải chứa các tế bào sống từ các mô non có các tế bào đang phân chia mạnh chiếm tỷ lệ lớn, nhất là dễ tạo mô sẹo Mẫu . gen đã giúp cho việc chuyển gen u việt vào việc lai tạo giống mới trong nông nghiệp đợc tiến hành một cách nhanh chóng và dễ dàng hơn [13].1 Tuy nhiên, một. hậu ấm áp và ánh sáng đầy đủ. Có ánh sáng cây mới sinh trởng và phát triển tốt. Cà chua sinh trởng và phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung