TINH CHẾ PROTEIN TI TỔ HỢP GNRH -TBK Coli

TINH CHẾ PROTEIN TI TỔ HỢP GNRH -TBK Coli

TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP GNRH-TBK Ở E. COLIĐặng Thành Nam & Phan Văn ChiViện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG1. ĐẶT VẤN ĐỀGnRH-TBK là một “độc tố miễn dịch” tái tổ hợp (Recombinant Immunotoxin-IT) được tạo ra nhờ sự kết hợp giữa thành phần hướng đích là hormon giải phóng kích dục tố (Gonadotropin Reseasing Hormon-GnRH) và thành phần độc tố là một protein bất hoạt ribosom lớp 1 Trichobakin[1, 2], nhằm tiêu diệt một cách chọn lọc các dòng tế bào bộc lộ GnRH receptor bề mặt đặc hiệu. TBK được tách chiết từ cây Trichosanthes sp. Bac Kan, có hoạt tính N-glycosidase, có khả năng nhận biết và phân cắt đặc hiệu gốc adenin ở vị trí 4324 của ARN ribosom 28S dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp protein và gây chết tế bào [3, 4]. GnRH là một neurodecapeptid, có ái lực cao (Kd khoảng 10-9 M) với các GnRH receptor (GnRHR) và không gây đáp ứng miễn dịch. GnRHR đã được phát hiện thấy nhiều trên bề mặt tế bào thuộc các mô ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt, tuyến tuỵ[5-9]. Hơn nữa GnRH cũng đã được sử dụng làm thành phần hướng đích trong một số độc tố miễn dịch tái tổ hợp như recombinant GnRH-PAP fusion toxin. Trong đó PAP là cũng là một protein bất hoạt ribosom được tách chiết từ cây Phytolacca americana. GnRH-PAP đã có khả năng ức chế đặc hiệu một số dòng tế bào ung thư có biểu hiện các GnRHR bề mặt[5]. Tiếp nối những nghiên cứu về thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá cho protein lai GnRH-TBK ở E.coli [1], trong bài này chúng tôi giới thiệu về các điều kiện biểu hiện và kết quả tinh chế loại protein tái tổ hợp này. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Nguyên liệuVector biểu hiện pGnRH-TBK mang gen mã hoá cho protein lai GnRH-TBK được thiết kế tại Phòng Hoá sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội [1]. Để nghiên cứu biểu hiện có sử dụng tế bào E. coli chủng BL21(DE3), môi trường Luria-Bertani(LB), isopropylthio-β-D-galactoside(IPTG), ampicillin và các hoá chất thông thường khác.2.2 Phương pháp nghiên cứu2.2.1 Điện di SDS-PAGEĐiện di biến tính protein bằng SDS-PAGE (12,5%) được tiến hành theo các phương pháp của Laemmli [12]. 2.2.2 Sắc kí trao đổi ion trên hệ FPLCSau khi biểu hiện, sinh khối tế bào được thu lại và phá bằng siêu âm trong đệm 50 mM Tris-HCL pH 7,0 có chứa 20 mM EDTA, Triton X-100 0,1%, lysozyme 100µg/ml. Huyền dich tế bào sau khi phá được ly tâm ở 12 000 vòng/phút trong 20 phút, để tách riêng phần cặn và nổi. Phần nổi được nạp thẳng vào cột CM- Sepharose(XK- 16/20). Protein mang điện tích trái dấu sẽ được giữ trên cột, còn các protein khác bị rửa trôi khỏi cột bằng đệm Tris-HCL pH 7,0. Cột được tiếp tục rửa cho đến khi A280 nm trở lại đường nền. Mẫu được thôi ra khỏi cột bằng gradien nồng độ 0,0-0,4 M NaCl nhờ chương trình phần mềm trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech).2.2.3 Western blotting và phân tích trình tự đầu N của protein tái tổ hợpCác phương pháp Western blotting và xác định trình tự các axit amin đầu N theo nguyên lý Edman được tiến hành như đã mô tả [13] 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan của GnRH-TBKTế bào E. coli chủng BL21(DE3) chứa vector biểu hiện pGnRH-TBK đã được chứng minh có biểu hiện GnRH-TBK ổn định [1], tiếp tục được sử dụng làm đối tượng trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, GnRH-TBK là protein lạ đối với tế bào chủ (E .coli), nên GnRH-TBK được biểu hiện ra chủ yếu ở dạng không tan (inclusion bodies). Do vậy để có thể thu được GnRH-TBK ở dạng tan đồng thời xây dựng quy trình tinh sạch GnRH-TBK, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo thì việc xác định điều kiện biểu hiện thích hợp là hết sức cần thiết. Trong phạm vi nghiên cứu của mình, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự biểu hiện của GnRH-TBK ở dạng tan. Sự biểu hiện của GnRH-TBK được tiến hành khảo sát ở 22oC, 30oC và 37oC. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng trong các bình tam giác giống nhau, lắc 200 vòng/phút ở 37oC, cho đến khi A600 nm đạt 0.4-0.6. Cảm ứng bằng IPTG (nồng độ cuối 0.4 mM) và tiếp tục lắc 200 vòng/phút ở 22oC, 30oC và 37 oC. Sinh khối tế bào ở các thời điểm khác nhau 1, 2, 3, 4 giờ và qua đêm(16 giờ) được thu lại bằng ly tâm ở 5000 vòng/phút và phá bằng siêu âm trong đệm như đã mô tả ở trên. Huyền dịch tế bào sau khi phá được ly tâm ở 12000 vòng/phút, trong 20 phút để tách riêng các phần cặn và nổi. Protein tổng số thu được ở phần nổi và cặn được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5%. Từ kết quả thu được cho thấy, ở 22oC và sau16 giờ được cảm ứng protein GnRH-TBK được tạo ra tập trung chủ yếu ở dạng tan. Nhưng cùng thời gian trên ở 30oC và 37oC, protein GnRH-TBK lại được biểu hiện ra chủ yếu ở dạng không tan. 3.2 Tinh chế protein GnRH-TBK tái tổ hợpĐể phục vụ cho tinh chế và những nghiên cứu tiếp theo, quá trình biểu hiện protein GnRH-TBK được tiến hành ở 22oC qua đêm (16 giờ). Sinh khối các tế bào vi khuẩn BL21(DE3) được xử lý như đã mô tả ở phần phương pháp. Phần nổi sau ly tâm được nạp thẳng vào cột CM-Sepharose (XK-16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia- Biotech). Các tạp chất được rửa bằng đệm 50 mM Tris-HCl pH 7, 0 cho đến khi A280 nm trở lại đường nền. Immunotoxin tái tổ hợp GnRH-TBK được thôi ra khỏi cột bằng gradien nồng độ 0,0-0,4 M NaCl trong đệm 50 mM Tris-HCl pH 7,0 với tốc độ dòng chảy 60 ml/giờ và kích thước mỗi phân đoạn là 1 ml. Hình 1: Tinh chế protein lai GnRH-TBK. A: Phổ sắc ký tinh chế GnRH-TBK qua cột CM-Sepharose (XK-16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech); B: Điện di SDS-PAGE các phân đoạn protein thu được; M: Thang protein chuẩn; 1 - 12: Các phân đoạn ở đỉnh phổ; WB: Western blot với huyết thanh thỏ kháng TBKTrên hình 1A là phổ sắc ký đặc hiệu cho mẫu thu được từ 500 ml dịch nuôi cấy. Trên phổ có một đỉnh hấp thụ duy nhất đặc trưng cho protein lai GnRH-TBK. Kiểm tra các phân đoạn ở đỉnh của phổ sắc ký bằng SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5%. Kết quả thu được ở hình 1B cho thấy, mỗi phân đoạn chỉ xuất hiện 1 băng protein duy nhất, có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết của GnRH-TBK là 30 kDa. Như vậy các phân đoạn protein ở đỉnh chứa hoàn toàn là GnRH-TBK và có độ tinh sạch cao. Kết quả Western blotting, các phân đoạn ở đỉnh cho phản ứng đặc hiệu với huyết thanh thỏ kháng TBK. Kết quả phân tích trình tự axit amin đầu N của GnRH-TBK tinh sạch cho thấy, ngoại trừ axit amin đầu tiên của protein tái tổ hợp là Meth, các axit amin tiếp theo là Glu, His, Trp, Ser, Tyr, Gly, Leu… Trình tự này cùng với kết quả Western blotting khẳng định protein thu được chính là protein lai GnRH-TBK. KẾT LUẬNImmunotoxin tái tổ hợp GnRH-TBK đã được biểu hiện ở mức khá cao trong E. coli chủng BL21(DE3) nhưng khác nhau ở các điều kiện thay đổi từ 22oC đến 37oC. Sau các bước sử lý đơn giản, GnRH-TBK dạng hoà tan có thể được tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion qua CM-Sepharose trên hệ FPLC. TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Đặng Thành Nam & Phan Văn Chi (2003) // Di truyền và ứng dụng (đang in)2. Phan Văn Chi (2001) //Hội thảo Sinh học Quốc tế 2001, Hà nội, tr. 66-68.3. Phan Văn Chi, Hoàng Quốc Trường, Nguyễn Thuý Hà, Phạm Công Hoạt, Lê Trần Bình (2000) // Những vấn đề cơ bản trong sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 23-28.4. Phan Van Chi, Hoang Quoc Truong, Nguyen Thuy Ha, Won-II Chung and Le Tran Binh (2001) // Biotechnol. Appl. Biochem. 34: 85-92 5. Jean-Luc Schlick, Philippe Dulieu, Bénédicte Desvoyes, Pascale Adami, Jean Radom, Michéle Jouvenot// FEBS Letters 472 (2000) 241-246. 6. Emos, G., Schrõder, B., Ortmann, O., Westphalen, S., Schultz, K.D. and Schally, A.V. (1993)//J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 1458-1464.7. Quayum, A., Gullick, W., Clayton, R.C., Sikora, K. and Waxman, J. (1990) // Br. J. Cancer 62, 96-99.8. Imai, A., Ohono, T., Lida, K., Furui, T. and Tamaya, T. (1994) // Cancer 74, 2555-2561.9. Srkalovic, G., Bokser, L., Radulovic, S., Korkut, E. and Chally, A.V (1990)// Endocrinology 127, 3052-3060.10. Imai, A., Horibe, S., Takagi, A., Tadaki, H., Ohno, T., and Tamaya, T., (1997) // Eur. J. Obstet, Gynecol. Report. Biol.74, 73-78.11. Imai, A., Takagi, A., Horibe, S., Tagaki, H., and Tamaya, T. (1997) // Int. J. Oncol. 13, 97-100.12. Laemmli, U. K. (1970) // Nature, 227:680-685.13. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.SUMMARYPurification of recombinant fusion protein GnRH-TBK in E. coliImmunotoxins constitute a new modality for the treatment of cancer, since they target cells displaying specific surface-receptors or antigens. Immunotoxins contain a ligand such as a growth factor, monoclonal antibody or fragment of an antibody which is connected to a protein toxin. Toxins reviewed here include catalytic proteins produced by plants or bacteria which kill target cells (ricin, PAP or PE, DT…). Recently, we have isolated trichobakin (TBK), a type 1 ribosome-inactivating protein (RIP) isolated from Trichosanthes sp. Bac Kan 8-98 (Cucurbitaceae family) which reveals antiviral and anticancer activity once inside the cytoplasm. TBK was proved to be a good candidate for the construction of different fusion proteins as recombinant “immunotoxins”. A bacterial expression plasmid encoding TBK as a fusion protein with gonadotropin-releasing hormone (GnRH), a neuro-decapeptide with receptor sites on several gynaecologic tumors has been constructed. The fusion cDNA were amplified by PCR using specific primers designed from the DNA sequences of gnrh, linker and tbk genes and inserted into pET-21d(+) expression vector. This paper represents the results of the expression of the recombinant fusion protein GnRH-TBK in E. coli strain BL21 (DE3). The expression of the protein was assessed by analysis of total protein by SDS-PAGE. It was shown that at 22oC, GnRH-TBK was expressed mainly in soluble form, while at 30oC or 37 oC the protein was expressed in both soluble form and inclusion bodies. The recombinant proteins was purified to homogeneity by CM-Sepharose chromatography on FPLC System. The protein has the molecular mass of about 30 kDa and the specific immunoreactivity with antibodies against TBK as it was shown by SDS-PAGE and Western blotting. The specific activity/toxicity of the purified recombinant immunotoxin is under study. Người thẩm định nội dung khoa học: Ts. Nguyễn Bích Nhihttp://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Pages1&go=page&pid=35Các phương pháp chiết rút tinh sạch và xác định protein I. Khái niệmTrong các tổ chức của cơ thể sống, protein có thể ở dưới dạng tự do trong các dịch sinh vật hoặc dưới dạng kết hợp, hoặc bị cầm trong các tế bào. Hơn nữa, trong tế bào có chứa hàng nghìn loại protein khác nhau, nếu ta cần nghiên cứu từng loại protein, trước hết phải chiết rút và tinh sạch chúng. Chính vì vậy, các kỹ thuật chiết rút, tinh sạch và nghiên cứu protein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn được cập nhật và hiện đại hóa.II. Các biện pháp cần thiết để nhận protein nguyên thểCác phương pháp chiết rút và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan . của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết.Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau.2.1. Nhiệt độĐể tách các protein khác nhau dựa trên kết tủa của chúng, người ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt. Một điều cần lưu ý là chỉ nên dùng đối với trường hợp các protein enzyme bền với nhiệt. Dịch protein enzyme được giữ ở 50 - 70<SUP>0</SUP>C trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuận nghịch phần lớn các protein tạp.Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 0<SUP>0</SUP>C tránh biến tính đặc biệt là protein enzyme. 2.2. Nồng độ proton (pH)Protein là các chất lưỡng tính, vì vậy, trong các dung dịch acid và kiềm chúng sẽ bị phân ly như sau:<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /><o:p></o:p><?xml:namespace prefix = v ns = "urn:schemas-microsoft-com:vml" /><v:shapetype id=_x0000_t75 stroked="f" filled="f" path="m@4@5l@4@11@9@11@9@5xe" o:preferrelative="t" o:spt="75" coordsize="21600,21600"><v:stroke joinstyle="miter"></v:stroke><v:formulas><v:f eqn="if lineDrawn pixelLineWidth 0"></v:f><v:f eqn="sum @0 1 0"></v:f><v:f eqn="sum 0 0 @1"></v:f><v:f eqn="prod @2 1 2"></v:f><v:f eqn="prod @3 21600 pixelWidth"></v:f><v:f eqn="prod @3 21600 pixelHeight"></v:f><v:f eqn="sum @0 0 1"></v:f><v:f eqn="prod @6 1 2"></v:f><v:f eqn="prod @7 21600 pixelWidth"></v:f><v:f eqn="sum @8 21600 0"></v:f><v:f eqn="prod @7 21600 pixelHeight"></v:f><v:f eqn="sum @10 21600 0"></v:f></v:formulas><v:path o:connecttype="rect" gradientshapeok="t" o:extrusionok="f"></v:path><o:lock aspectratio="t" v:ext="edit"></o:lock></v:shapetype><v:shape id=_x0000_i1025 style="WIDTH: 240pt; HEIGHT: 96pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=fc223c3299645a16.jpg&attid=0.3&disp=vahi&vie w=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_ image001.jpg"></v:imagedata></v:shape><o:p></o:p>Do các acid amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhóm chức tự do dưới dạng các ion hóa là nguyên nhân tạo ra tính đa điện của protein. Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptide không đáng kể, chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗi bên (R) quyết định tính chất tích điện của phân tử protein (nhóm cacboxyl của amino acid, OH của Tyrosine, t - NH<SUB>2</SUB> của lysine, guamidin của Arginine, inidazol của histidine) [...]... tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợp riêng biệt, người ta có thể ti n hành kết tinh chúng Một điều cần chú ý là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là bằng chứng về sự tinh khiết Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein enzyme khác Người ta thường ti n hành kết tinh protein enzyme trong dung dịch (NH4)2SO4... nồng độ protein Vì vậy, phương pháp đo độ hấp thụ tia cực tím thường được dùng để định lượng protein đã tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc ký tách các protein qua cột 5.2 Đánh giá tính đồng thể của protein: Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó Độ đồng thể của chế phẩm protein. .. chất mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuống cột Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch 4.2.6 Kết tinh protein Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn,... enzyme ngoại bào, mức độ tinh sạch cần thiết thường là tối thiểu, khi sản phẩm cuối cùng được dùng trong công nghiệp và không cần độ tinh sạch cao Các quá trình quy mô lớn như thế có thể cho sản lượng protein lên đến hàng tấn Nhiều loại protein khác được sản xuất trong các hỗn hợp nội bào phức tạp đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình tinh sạch chúng Những protein đòi hỏi phải tinh sạch này thường được... các ti u chuẩn tinh sạch rất cao, và để có được điều này người ta cần phải phát triển các quy trình tinh sạch phức tạp Một lần nữa, công nghệ DNA tái tổ hợp đã có đóng góp hiệu quả trong lĩnh vực này Trong trường hợp các protein trị liệu, thường có những thuận lợi nếu protein quan tâm có thể được ti t hoặc vào khoảng gian bào hoặc vào trong môi trường Điều này giúp giảm rất lớn độ nhiễm bẩn của protein. .. giảm thiểu sự mất hoạt tính của protein Trong phần này sẽ trình bày các bước thu hồi và tinh sạch truyền thống cho protein 1.1 Thu hồi các protein ngoại bào Các protein ngoại bào tương đối dễ thu hồi và tinh sạch Tế bào và nồng độ của dung dịch hoạt động được loại bỏ một cách đơn giản, và có thể cung cấp trực ti p protein thô thích hợp cho một số ứng dụng Dung dịch protein tương đối sạch có thể thu... ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh 4.2.7 Làm khô và bảo quản chế phẩm protein Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước của chúng Nếu dung dịch protein enzyme bị khô ở độ nhiệt trong phòng thì đa số protein enzyme bị biến tính Protein enzyme chỉ có thể được giữ ở dang khô trong trường hợp nếu việc sấy khô được ti n hành vô cùng... gelatin Ngoài ra, nhiều chất khác có thể làm tăng hay giảm cường độ màu phản ứng, vì vậy phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch - Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ: Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được Nếu protein. .. bào ti n hành chiết xuất các protein enzyme bằng các dụng dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối với protein enzyme nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với các protein enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùy thuộc vào tính chất của protein enzyme cần nghiên cứu IV Tinh sạch protein 4.1 Loại các tạp chất Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein. .. lượng protein - Định lượng nitrogen theo phương pháp kjeldahl: Phần lớn các phương pháp gián ti p xác định protein đều dựa trên cơ sở xác định lượng nitrogen Lượng nitrogen có trong các protein là gần giống nhau không phụ thuộc vào chất lượng và nguồn protein Đương nhiên trên cơ sở lượng nitrogen có thể xác định chỉ các protein đã được tinh sạch hoặc lượng protein của các mẫu nghiên cứu mà ngoài protein . tan. 3.2 Tinh chế protein GnRH- TBK tái tổ hợp ể phục vụ cho tinh chế và những nghiên cứu ti p theo, quá trình biểu hiện protein GnRH- TBK được ti n hành. TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP GNRH- TBK Ở E. COLI ặng Thành Nam & Phan Văn ChiViện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG1. ĐẶT VẤN Đ GnRH- TBK