Sử dụng DNA tái tổ hợp

Sử dụng DNA tái tổ hợp

1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt Vấn Đề Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc sử dụng DNA tái tổ hợp nhƣ là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất cây trồng và chất lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời vẫn thúc đẩy đƣợc một nền nông nghiệp bền vững. Tiếp theo những nhận định này là hàng loạt những đột phá trong nghiên cứu khoa học về các phƣơng pháp chuyển gen, trong việc phát hiện và bảo tồn những gen quý. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt đông của gen, sự biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ gen. Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu. Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành thực hiện 2 đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α” trong khoá luận tốt nghiệp của mình. 1.2 Mục tiêu của đề tài Thiết lập quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescipt và chuyển đƣợc plasmid tái tổ hợp này vào tế bào ký chủ Ecoly DH5α. 1.3 Nội dung thực hiện 1.3.1 Phần 1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật số tế bào vi khuẩn dựa trên sự tƣơng quan của số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tƣơng quan của giá trị OD600nm theo thời gian nuôi cấy. Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất. Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt. Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết hợp với phản ứng cắt enzym giới hạn để kiểm tra. 1.3.2 Phần 2 Chuẩn bị đoạn DNA để chèn. Cắt và tinh sạch vector. Phản ứng sửa chữa sai sót trên đoạn DNA chèn, nhằm tạo ra đoạn DNA có đầu bằng. Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào. Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG Kiểm tra lại kết quả biến nạp đoạn gen bằng phản ứng cắt, phản ứng PCR trên plasmid tách chiết từ thể biến nạp. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn 2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp Biến nạp là hiện tƣợng tiếp nhận DNA từ bên ngoài vào tế bào vi khuẩn. Hiện tƣợng biến nạp đƣợc chứng minh lần đầu tiên trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae do Fred Griffiths, năm 1928, sau đó đƣợc kiểm chứng lại bởi Avery và cộng sự năm 1944 (viện Rocketfeller). Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng có trạng thái khả nạp tự nhiên, chúng có khả năng hấp thu DNA tự nhiên có sẵn ở môi trƣờng sống. Nguồn DNA này có đƣợc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết quả thu đƣợc là vi khuẩn thể hiện một hoặc vài tính trạng mới, tính trạng này ổn định và có khả năng di truyền. Từ các nghiên cứu của Griffiths và Avery đã chỉ ra rằng tế bào vi khuẩn phải ở trạng thái sinh lý đặc biệt mới có khả năng hấp thu DNA, đó là “trạng thái khả nạp”. Trạng thái khả nạp xuất hiện tự nhiên ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất dinh dƣỡng và oxy trong môi trƣờng sống của chúng giảm xuống thấp. Trong thực tế nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào vi khuẩn để chúng có khả năng hấp thu DNA. 2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen 2.1.2.1 Vai trò Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích nghi với môi trƣờng sống. Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật. 2.1.2.2 Ứng dụng Biến nạp DNA vào vi khuẩn còn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Từ rất lâu, vi sinh vật đã đƣợc xem và sử dụng nhƣ nhà máy sinh học (lyving factories) tạo ra các sản phẩm sinh học phục vụ nhu cầu con ngƣời, ví dụ kháng sinh Penicillyn đƣợc chiết xuất từ nấm Penicillyum và Streptomycin tạo ra từ vi khuẩn Streptomyces griseus. Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi khuẩn và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết hợp với các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con 4 ngƣời. Nhiều loại vaccine dùng trong y học và thú y, nhiều giống cây trồng chứa gen kháng bệnh đã đƣợc tạo ra thay thế cho những phƣơng pháp cổ điển. Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiên những nghiên cứu khác nhƣ đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đọan gen đƣợc dễ dàng. 2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần mà DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ. Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào. Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một số protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào. ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào (Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998). ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào. Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kých hoạt sự phiên mã. ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự biểu hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998, Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự 5 ngn giu A/T, c sp xp trong mt khung c c trng v lynh ng dc theo si xon DNA. Phõn tớch footfrinting cỏc gc hydroxyl ca ComK bỏm vo addAB promoter cho phộp h kt lun rng ComK bỏm vo vựng trỡnh t giu A/T AAAAN5TTTT. ComK c iu ho õm bi s bỏm vo ca AbrB v CodY, c hot hoỏ dng bi AbrB, sinR, DegU. CodY l mt GTP-binding protein nhy cm vi nng GTP ni bo nh l mt ch th v dinh dng, nú iu ho s phiờn mó phn u phare n nh v s phiờn mó ca gen quy nh s hỡnh thnh bo t. T ú, cho phộp t bo thớch nghi vi nhng gii hn v dinh dng. DegU giỳp cho ComK bỏm cht hn vo ComK promoter, iu ny m bo s phiờn mó chớnh xỏc ngay c khi nng ComK thp. 2.3 S bin np nhõn to vo t bo E.coly 2.3.1 Khỏi nim s bin np nhõn to. Bin np nhõn to l vic a mt on DNA vo t bo ch nhm nhõn nhanh s lng bn sao, phc v cho mc ớch nghiờn cu khỏc. Trong phũng thớ nghim, nhm mc ớch tng cng kh nng bin np, ngi ta thng x lý t bo ch bng cỏc phng phỏp húa hc hay vt lý. T bo ch sau khi c x lý bng cỏc phng phỏp trờn gi l t bo kh np. T bo E.coly l mt t bo ch c s dng rng rói vỡ cu trỳc di truyn ca nú tng i n gin, thụng tin di truyn ó c bit tng tn nờn d dng phỏt hin t bo cú mang gen l. E.coly l mt vi khun Gram õm, hỡnh que, di khong 2,5àm, cú roi (flagella) v b gen gm 4639221 cp base mó hoỏ cho ớt nht 4000 gen. Ging nh tt c cỏc loi vi khun gram õm khỏc E.coly khụng cú mng nhõn v nhim sc th l mt phõn t si ụi dng vũng rt ln vi nhng v trớ gn mng v mt v trớ khi u sao chộp. Cỏc t bo E.coly cú th h tr s sao chộp cỏc plasmid DNA v chn lc cỏc DNA plasmid tỏi t hp thụng qua gen khỏng khỏng sinh hay cỏc phc hp mu vi X-gal. 2.3.2 S iu ho gen ca operon Lac E.coly Trong trng hp cú glucose, E.coly tng trng nhanh chúng. Nu thay glucose bng lactose (-galactisido-glucose), E.coly ngng tng trng v hi phc sau ú nh tng hp c 3 enzym Permerase kých thớch s thm lactose Acetylase (vai trũ cha rừ) 6 Β-galactosidase xúc tác sự thuỷ giải lactose thành galactose và glucose Ba enzym này chỉ đƣợc tổng hợp khi cần để phóng thích glucose từ lactose; chúng đƣợc cảm ứng bởi lactose. Jacobs và Monod (1961) giải thích sự cảm ứng này qua mô hình hoạt động của operon Lac (lactose operon). Operon Lac là đoạn DNA chứa: Ba gen cấu trúc lacZ (mã hoá β- galactosidase), lacY (mã hoá permerase) và lacA (mã hoá acetylase). Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P), đánh dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen. Một trình tự nucleotide gọi là operator (vùng hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzym. Operator quyết địmh RNA polymerase không lyên kết hay lyên kết với promoter và di chuyển dọc theo các gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002). Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly. Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002. Ngƣời ta gọi một nhóm gen với các chức năng lyên hệ cùng với promoter và operator là operon. Operon chỉ có ở procaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp các gen lyên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trƣờng), vì chúng đƣợc kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator). Trƣớc operon lacZ là gen điều hoà I, gen này mã hoá repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự biểu hiện gen. Hoạt động của operon Lac đƣợc chứng minh nhƣ sau: Khi có glucose (và không có lactose), gen điều hoà I hoạt động (I có promoter riêng) để tạo ra repressor; repressor nhận biết và lyên kết với operator, cản sự lyên kết gen điều hoà Gen điều hoà Vùng cấu trúc gen của lac operon cấu trúc gen của cấu trúc gen của cấu trúc gen của 7 của RNA polynerase và promoter. Khi có lactose (và không có glucose), lactose lyên kết với repressor và làm biến đổi hình thể của repressor, do đó repressor không lyên kết với operator: operon Lac mở, RNA polymerase lyên kết với promoter và trƣợt dài theo các gen của operon; mRNA (mã hoá cho cả 3 enzym) đƣợc tạo thành và đƣợc dịch mả thành các polypeptide riêng biệt. Với hỗn hợp glucose và lactose, E.coly dùng glucose trƣớc, sự dùng lactose bị đàn áp: đó là sự “kìm hãm dị hoá”. Khi glucose giảm, ngƣời ta chứng minh cAMP gia tăng và cố định trên một protein gọi là CAP (catabolyte gen activator protein) hay CRP (cAMP recepter protein). phức hợp cAMP-CAP cố định trên promoter và làm tăng khả năng lyên kết của RNA polymerase với promoter. Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông thƣờng E.coly dùng để biến nạp đƣợc cải tiến thành các chủng chủ theo các hƣớng cơ bản là loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn khi đó DNA lạ sẽ bị phân giải và thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích luỹ trong tế bào. Thông thƣờng ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA-) là gen mã hóa cho endonuclease I. Việc mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lƣợng plasmid và cải thiện chất lƣợng DNA chiết tách bằng các phƣơng pháp sinh hoá chuẩn (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002). 2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp Có hai phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp 2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý Phƣơng pháp này sử dụng xung điện tác động lên tế bào chủ từ đó gây nên sự thay đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm ở màng. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tiến hành nhanh chóng, tế bào sau xử lý có hiệu suất biến nạp cao. 2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học Là phƣơng pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết hợp với nhiệt độ). Phƣơng pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp nhƣng đơn giản và dễ thực hiện. Hiện nay để tạo tế bào E.coly khả nạp theo các phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta có thể tiến hành theo 3 cách khác nhau Thứ nhất, phƣơng pháp Hanahan cho phép tạo những tế bào E.coly khả nạp có hiệu quả biến nạp cao (5x108 khuẩn lạc/µg plasmid DNA). 8 Th hai, phng phỏp Inoue d lp li hn phng phỏp Hanahan v to ra cỏc t bo kh np cú hiu qu bin np t 1x108 n 3x108 khun lc/àg plasmid DNA. Th ba, phng phỏp Calcium chloride, phng phỏp ny c phỏt trin t hn 30 nm qua v to ra cỏc t bo kh np cú hiu qu bin np t 5x106 n 2x107 khun lc/àg plasmid DNA. Thụng thng, ngi ta x lý t bo vi khun trong dung dch mui lnh ca kim loi hoỏ tr II nh CaCl2, MgCl2, RbCl2. Vic bin np DNA plasmid vo E.coly t hiu qu cao hn khi cú s hin din ca ion Ca2+ nhit thp (0-4oC). Ion Ca2+ cú th gõy ra nhng xỏo trn trờn mng t bo lm cho DNA xõm nhp t bo E.coly d dng hn. Giai an sc nhit k tip kých thớch s chuyn ca phõn t DNA vo trong t bo, mụi trng dng cht c thờm vo sau ú cho phộp t bo phc hi v DNA tin hnh sao mó, dch mó to ra cỏc protein tng ng. 2.3.4 Phng phỏp chn lc th bin np v plasmid tỏi t hp Sau khi xõm nhp, plasmid tỏi bn v th hin gen khỏng khỏng sinh trong t bo ch. iu ny giỳp t bo ch cú kh nng sinh trng trờn mụi trng cú khỏng sinh. Do ú, khi tri E.coly bin np lờn mụi trng cha khỏng sinh, ch t bo no ó thu nhn plasmid v biu hin gen khỏng khỏng sinh mi cú th sinh trng. Cỏc t bo khụng tip nhn plasmid s khụng sinh trng c. Tuy vy, kt qu ca phn ng ni gia on DNA v vector ó c m vũng l mt t hp bao gm nhiu kt qu ni, ú l vector-vector, vector-DNA chốn. Do vy, cú nhng th bin np cú kh nng sinh trng trờn mụi trng cha khỏng sinh nhng khụng mang gen mc tiờu. Vic sng lc cỏc th bin np mang gen mc tiờu c tin hnh theo nhiu phng phỏp. Ph bin l cỏc phng phỏp sau: Xỏc nh th bin np cú mang plasmid tỏi t hp da trờn vic quan sỏt mu xanh hay trng ca khun lc bng -complementation. Xỏc nh th bin np cú mang plasmid tỏi t hp bng phng phỏp lai (lai khun lc). Xỏc nh gen ớch trờn plasmid trong th bin np bng PCR (PCR khun lc). Thụng thng, phõn tớch mt dũng ngi ta dung hai phng phỏp l kho sỏt plasmid tỏi t hp bng cỏch to bn ct gii hn v gii trỡnh t ton b on gen ớch. Nhiu plasmid vector (vớ d h pUC, pBluescript, pGem v cỏc plasmid cú ngun gc t cỏc h plasmid ny) mang mt on ngn ca DNA E.coly cha nhng trỡnh t iu hũa v mó húa cho -protein ca -galactosidase (u amin). Vic chốn vo on 9 này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-galactosidase E.coly (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal (5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt nó, bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kých hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kých hoạt của gen lacZ. Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng. 2.3.5 Chiết tách DNA plasmid Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ: Phƣơng pháp nhiệt độ cao Phƣơng pháp Lythium Phƣơng pháp SDS-kiềm 10 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzym DNA polymerase. Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau: Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94-95oC Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa Primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của Primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50oC. Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72oC Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần. Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR. 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR Taq polymerase Taq polymerase là enzym chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA. Enzym này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng thermus aquaticus. Enzym này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng 70 – 72o C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzym này quá thấp không đủ lƣợng enzym xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong muốn. 2 4 6 8 1 0 Biến tính Ủ bắt cặp Kéo dài Lặp lại n lần 94–95o C 72o C 45-56o C [...]... 3’ 3’ C TTAA G 5’ 5’ G AATT 3’ 3’ C TTAA G 5’ 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn đƣợc tổng hợp, nhờ một enzym sao chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hƣớng 5’P 3’OH Các DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA đƣợc gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để... Với DNA phage Khác với DNA plasmid, DNA không đóng vòng, nhƣng ta cũng có thể tạo các ngân hàng DNA bằng cách dùng các phage làm vector, theo cùng nguyên tắc với sự dùng plasmid Các bƣớc tạo DNA tái tổ hợp : Làm phóng thích DNA phage ra khỏi vỏ, làm cho các đầu tận cùng của đọan DNA insert có khả năng tƣơng hợp với các đầu tận cùng của DNA phage, và sau đó dùng lygase để nối lyền các đoạn DNA, tái. .. Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội 2.6.1 Với plasmid Enzym hạn chế cắt vector ở vị trí hạn chế hay MSC Các DNA sợi kép (plasmid thẳng) với các đầu dính hay bằng đƣợc tạo thành Đoạn DNA lạ đƣợc cắt ra từ một phân tử DNA lớn bởi cùng enzym cắt giới hạn (với trƣờng hợp đầu dính) hoặc thu nhận từ phản ứng PCR Sau đó, phản ứng nối giữa vector và DNA chèn đƣợc tiến hành dƣới sự xúc tác của DNA lygase, DNA lygase... kých thƣớc tới 10kb (pEMBL9, pBluescript) 2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector 2.5.1 Các enzym cắt giới hạn Khái niệm hiện tƣợng giới hạn: Các thực khuẩn thể xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn Khi số lƣợng phage tăng lên 16 đến hàng triệu... vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự pBluescript chứa MSC với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn Bên ngoài vùng MSC là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự pBluescript chứa trình tự mã hoá cho... một mồi axit nucleic DNA polymerase I(từ E.coly) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động enzym: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ exonuclease 5’ 3’, exonuclease (thủy giải) 3’ 5’ và 3’ Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’ Do đó, enzym Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase 5’... biểu hiện và sử dụng theo một cách nào đó, gọi là phasmid Các vector lai giữa plasmid và phage đƣợc hoàn thiện cho tới nay và đƣợc sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng nhƣ giải trình tự DNA và sản xuất các mẫu dò để sử dụng trong các nghiên cứu về lai axit nucleic Các vector này là những plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi đầu sao chép f1 của phage M13, và có thể tiếp nhận các đoạn DNA có kých thƣớc... dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ đƣợc phục hồi nhanh chóng DNA của bộ gen có kých thƣớc lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid Vì vậy DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA của bộ gen sẽ bị tủa xuống Nhƣ vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà không bị lẫn DNA của bộ gen DNA của plasmid đƣợc tủa dƣới tác dụng của isopropanol nên ta... lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng sự, 1973) 2.5.4 Các enzym nối DNA Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt giới hạn lyên quan đến sự hình thành lyên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi lyền kề Sự hình thành lyên kết này có thể đƣợc xúc tác bởi hai loại enzym là E.coly DNA lygase hay T4 DNA lygase 2.5.3.1... deoxyribonucleotide-5-triphosphate Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên lyệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase Primer (mồi) Primer (mồi) là những đoạn olygoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Chiều dài của mồi thƣờng . trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên. vật. 2.1.2.2 Ứng dụng Biến nạp DNA vào vi khuẩn còn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Từ rất lâu, vi sinh vật đã đƣợc xem và sử dụng nhƣ nhà máy