Có nhiều phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid nhƣ: Phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ cao, phƣơng pháp SDS – kiềm. Nhƣng chúng tôi chọn phƣơng pháp SDS – kiềm để chiết tách plasmid sử dụng cho khóa luận này.
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng. Sau khi màng tế bào bị vỡ , dƣới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh đƣợc sự phân hủy của DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm cho DNA của genome và DNA của plasmid bị biến tính. Sau đó trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ đƣợc phục hồi nhanh chóng. DNA của bộ gen có kých thƣớc lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid. Vì vậy DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA của bộ gen sẽ bị tủa xuống. Nhƣ vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà không bị lẫn DNA của bộ gen. DNA của plasmid đƣợc tủa dƣới tác dụng của isopropanol nên ta thu hồi lại dễ dàng.
Phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid sử dụng SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)
Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau
Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200
C
Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết.
Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf.
Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200
C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong1 giờ.
Bƣớc 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200c. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa.
Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40
C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm.
Bƣớc 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa.
Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách.
Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasnid đối chứng.
Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzym
EcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNA
plasmid chiết tách đƣợc có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không.
3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) Định nghĩa đơn vị enzym cắt: Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lƣợng enzym xúc Định nghĩa đơn vị enzym cắt: Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lƣợng enzym xúc tác phản ứng cắt hết một lƣợng DNA là 1µg trong buffer thích hợp trong thời gian là 1 giờ ở nhiệt độ thích hợp. Thực hiện phản ứng cắt với các thành phần nhƣ sau
Buffer 10X 2.5µl
DNA plasmid 1µg
Enzym EcoRV 1 unit (0.1 µl) Thêm nƣớc cho tới 25µl
Ủ phản ứng ở 37oC trong 1 giờ, biến tính enzym ở 65oC trong 15 phút
Điện di 8µl sản phẩm cắt trên gel agrose 0.8%, với hiệu điện thế 100V, trong 30 phút để kiểm tra.
3.3.7.3 Quy trình điện di trên gel agarose
Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lƣợc vào khuôn, cân 0.1g agarose cho vào chai chứa 12.5 ml dung dịch TAE 0.5X, nấu agarose trong lò vi sóng trong 2 phút, 650W.
Để nguội đến 40-500
C, đổ gel vào khuôn, khi gel nguội, gỡ lƣợc ra khỏi miếng gel, lấy gel ra khỏi khuôn một cách nhẹ nhàng và đặt vào bồn điện di đã có sẵn dung dịch TAE 0.5X.
Chuẩn bị một miếng parafilm (kých thƣớc tuỳ vào số mẫu chạy điện di), hút 2μl dung dịch nạp mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu cần điện di, hút mẫu cần điện di (thể tích tuỳ thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, hút toàn bộ dung dịch vừa trộn nạp vào giếng.
Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút.
Sau khi điện di xong, cẩn thận lấy gel ra và nhuộm trong Ethium bromide trong 10 phút, rửa kỹ gel và đọc kết quả điện di bằng phần mềm Quantity One (khi nhuộm với ethium bromide phải tuyệt đối cẩn thận).
3.3.8 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR
Phƣơng pháp tinh sạch đƣợc thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãng Amersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp. Kit tinh sạch GFX cho phép tinh sạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phƣơng pháp cắt gel.
Quy trình tinh sạch DNA từ gel
Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từ bản gel agarose sau khi điện di
Bƣớc 1: Gel sau khi chạy điện di, đƣợc đƣa lên hệ thống UV.
Bƣớc 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần đƣợc tinh sạch cho vào eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lƣợng trƣớc).
Bƣớc 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10 mg gel ≈ 10µl capture buffer.
Bƣớc 4: Đậy nắp lại ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút).
Bƣớc 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẩu cần tinh sạch. Bƣớc 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf.
Bƣớc 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 40 C.
Bƣớc 9: Cho thêm vào cột lƣợng wash buffer tƣơng ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/ phút trong 30 giây ở 40C.
Bƣớc 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới. Bƣớc 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX. Bƣớc 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40
C, lấy cột ra, đậy nắp lại.
Bƣớc 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch.
Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX
Bƣớc 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch. Bƣớc 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer và sản
phẩm PCR là 5:1.
Bƣớc 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buffer đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 4: Đem ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C.
Bƣớc 5: Cho thêm vào cột một lƣợng wash buffer bằng với lƣợng capture buffer cho vào ở trên, ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C
Bƣớc 6: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới.
Bƣớc 7: Hút elution buffer nhỏ vào cột GFX, tùy vào mục đích sử dụng sản phẩm tinh sạch mà lƣợng elution buffer có thể thay đổi.
Bƣớc 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 9: Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1 phút ở 40c, lấy cột ra, đậy nắp eppendorf lại. Bƣớc 10: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose
0.8% để kiểm tra kết quả tinh sạch
3.3.9 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR
Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu đƣợc sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính.Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi
tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA polymerase I large fragment (Klenow).
Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA.
Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau:
NEbuffer 10X 2µl
DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg)
dNTPs (33µmol) 1µl
DNA fragment Klenow 1 unit (1µl) Thêm nƣớc cho tới 20µl
Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750
C trong 20phút.
3.3.10 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) blunt-end)
T4 DNA lygase không giống nhƣ E.coly DNA lygase, nó có thể xúc tác phản ứng nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và Ehrlych 1978). Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có đƣợc hiệu suất cao và cần phải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981), nồng độ enzym lygase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol của vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10.
Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lƣợng cao nhƣ PEG hay Hexamminecobalt chloride. Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng lygation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lƣợng DNA và nồng độ lygase giảm xuống và không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó
Phản ứng tạo đầu bằng
chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra.
Cơ sở để tính tỉ lệ về lƣợng vector và DNA insert theo số mol
Đổi từ số mol ra lượng (ng) của phân tử DNA
μg DNA = fmole DNA x x
Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn
(ng)DNA chèn =
Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ra lƣợng DNA cần sử dụng
Thực hiện phản ứng nối với các thành phần nhƣ sau T4 reaction buffer 1µl
DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng)
DNA plasmid 1µl (50ng)
T4 lygase 1 unit
Thêm nƣớc cho tới 10µl
Ủ phản ứng ở 220c trong 4 giờ, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer.
3.3.11 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa)
Thực hiện biến nạp theo quy trình sau
Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút.
Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. 1 μg 3000 fmol Kích thƣớc DNA (bp) 1000 bp Vector (ng) x DNA chèn (kb) Vector (kb) X Tỉ lệ DNA chèn (bp) Vector
Hút 200µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370 C (khoảng 14 - 16 giờ).
3.3.12 Kiểm tra kết quả chiết tách plasmid sử dụng enzym BamHI và Hind III,
thực hiện phản ứng PCR plasmid với cặp primers (T3, T7) và (ITS4, ITS5)
Chiết tách theo quy trình 3.3.7.1, thực hiện phản ứng cắt theo quy trình 3.3.7.2 Phản ứng PCR trên plasmid:
Primer T3 và primer T7 đƣợc thiết kế dựa trên trình tự T3, T7 RNA polymerase promoter có trình tự là
T7 primer 5’- TAATACGACTCACTATAGGG – 3’ T3 Primer 5’ – ATTAACCCTCACTAAAGGGA – 3’
(Dựa theo Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan)
Primer ITS4 và primer ITS5 đƣợc thiết kế dựa trên vùng bảo tồn ITS của loài nấm
Beauveria bassiana.
Thực hiện phản ứng PCR (theo Samuel S.M.Sun, 1994 có chỉnh sửa) với thành phần và quy trình nhƣ sau: H2O 15.3μl PCR buffer 10X 2.5μl dNTPs (25mM) 2.5μl 5’ primer (20μM) 1.25μl 3’ primer (20μM) 1.25μl DNA plasmid (10ng/μl) 2μl
Thực hiện biến tính ở 950C trong 7 phút, thêm vào 1U Taq polymerase. Quy trình: 950C/1’, 550C/1’, 720C/1’, 30 chu kì , 720/7’.
PHẦN 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính
Sau khi nuôi cấy lắc 4 giờ bắt đầu đo giá trị OD600 nm và kết hợp với đếm spot cuonting, chỉ chọn những nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc từ 25 – 300 để đếm. Nếu các khuẩn lạc mọc dày quá thì có thể đếm ½ hoặc ¼ giọt rồi nhân lên tƣơng ứng.
Hình 4.1 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 5, 6 giờ nuôi cấy.
(a) kết quả cấy vi khuẩn sau 5 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 100, 10-1, 10-2 mỗi nồng độ lập lại 3 lần ; (b) kết quả cấy vi khuẩn sau 6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-1
, 10-2, 10-3 mỗi nồng độ lập lại 3 lần.
Hình 4.2 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 7, 8 giờ nuôi cấy.
(a) sau 7 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần ; (b) sau 6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3
, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần.
Sau 4 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.06, giá trị này tƣơng đối thấp nên chúng tôi chỉ pha loãng và đếm số khuẩn lạc không ghi lại hình ảnh.
b a
Sau 5 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.14, với giá trị OD này chúng tôi pha loãng từ 100 – 10-6. Nhƣng chỉ chọn nồng độ pha loãng 10-1 để đếm, kết quả 3 lần lập lại nhƣ sau : 283, 298,252. Ở nồng độ này các khuẩn lạc mọc rất dày phải chia ra ½ giọt đếm. Tuy nhiên ở nồng độ pha loãng kế tiếp thì số khuẩn lạc mọc ít không đủ từ 25 – 300 khuẩn lạc.
Sau 6 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.36, chúng tôi pha loãng từ 10-1 đến 10-6 và chọn đếm ở độ pha loãng 10-2
, kết quả đếm của 3 lần lặp lại là : 109, 138, 143.
Sau 7 giờ nuôi cấy giá trị OD đạt đƣợc là 0.6, ở lần đếm này chúng tôi chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-7 để cấy lên đĩa và chọn ở nồng độ 10-3 để đếm, số khuẩn lạc đếm đƣợc nhƣ sau : 43, 52, 59.
Sau 8 giờ nuôi cấy giá trị OD đo đƣợc là 1.3, chúng tôi chọn độ pha loãng từ 10-3 đến 10-8
để cấy lên đĩa và chọn đếm ở độ pha loãng 10-5 kết quả là : 20,38, 47.
Khi giá trị OD đạt 1.3 thì dừng lại không theo dõi nữa vì thực tế chúng tôi chỉ cần biết trong điều kiện làm thí nghiệm này, để đạt đƣợc mật số tế bào 108 tế bào/ml thì giá trị OD tƣơng ứng sẽ là bao nhiêu.
Bảng 4.1 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 1 Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA
4 gờ 5 giờ 6 giờ 7 giờ 8 giờ 0.12 0.3 0.54 0.96 1.81 5 x 104 1.6 x 105 1.3 x 106 107 1.3 x 108 4.7 5.2 6.1 7 8.1
Bảng 4.2 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 2 Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA
4 giờ 5 giờ 6 giờ