CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN (DI TRUYỀN học) (chữ biến dạng do slide dùng font VNI times, tải về xem bình thường)

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN ADN gì? • ADN phân tử chứa TẤT CẢ vật liệu di truyền thể chịu trách nhiệm cho DI TRUYỀN • Một sợi ADN chứa nhiều GEN, tất gen mã hóa cho PROTEIN • Mỗi protein có chức khác tế bào ADN có đâu? I CHIẾT TÁCH ADN øm chiết ADN từ tế bào? PHÁ màng tế bào KẾT TỦA ADN khỏi dung dịch Ethanol CHIẾT TÁCH ADN Bước 1: Phá màng tế bào màng nhân (tế bào nhân thật), giải phóng ADN môi trường Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu (protein, mảnh vỡ tế bào…) Bước 3: Kết tủa acid nucleic TINH CHẾ ACID NUCLEIC - Siêu ly tâm gradient liên tục CsCl độ phân giải 1% đơn vị tỉ trọng - Siêu ly tâm đệm CsCl (gradient không liên tục): để tinh chế lượng lớn acid nucleic - Siêu ly tâm gradient saccharose: để phân tách hỗn hợp acid nucleic có kích thước chênh lệch nhiều kb TINH CHẾ ACID NUCLEIC - Sắc ký lực: pha tónh USepharose / oligodT- cellulose - Sắc ký lọc gel: tách nucleotid tự sau tạo mẫu dò đánh dấu - Sắc ký trao đổi ion vi cột: thu hồi lượng ADN nhỏ - Sắc ký lỏng hiệu cao: tinh chế oligonucletid tổng hợp (độ phân giải nt) plasmid phân tách đoạn ADN II CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯNG SƠ BỘ ACID NUCLEIC 10 PCR khuếch đại ARN Rất cần xác định HCV, virus cúm, virus Picorna, rRNA vi khuẩn, hiệu kháng sinh điều trị Trước ARN > cADN >ADN RT/ retrovirus Không bền với nhiệt độ, dễ phân hủy Dùng nhiệt độ thấp > lai không đặc hiệu Ngày Thermus thermophilus Tth pol / Mn2+ polymerase chịu nhiệt, có hoạt tính reverse transcriptase 58 PCR khuếch đại ARN NHẠY:  100 RNA Hỗn hợp phản ứng Tth pol loại mồi (1 cho tổng hợp cADN cho PCR) MnCl2 tất thành phần khác cần cho RT PCR Chu kỳ nhiệt 70oC động) 95oC 95oC 60oC 90oC 60oC 15 phút (reverse transcriptase hoạt (biến tính phức hợp ARN-ADN) 15 phút chu kỳ 20 giây 38 chu kỳ 15 giây khoảng 20 giây } } 59 Real time PCR định lượng Phản ứng PCR cho phép theo dõi khuếch đại ADN xảy Cho phép định lượng xác nồng độ khuôn ban đầu 60 Nguyên tắc Không ảnh hưởng hiệu suất tính đặc hiệu nhuộmPCR ADN (EtBr) Bổ sung chất vào PCR - Khuếch đại đoạn ADN đặc hiệu Tiến hành - Phát sản phẩm đồng thời khuếch đại theo dõi bên máy soi Định lượng dựa vào: số lượng đích ban đầu cao số chu kỳ để phát sớm 61 62 63 64 Các lónh vực ứng dụng kỹ thuật PCR Trong nghiên cứu khoa học: xác định trình tự nucleotid đoạn ADN nhân, tách dòng đoạn ADN đặc hiệu, phát đột biến, nghiên cứu ARNm tạo đột biến gien, phân tích liên kết gien từ tế bào riêng lẻ; nghiên cứu trình tiến hóa mức phân tử Phục hồi gien cổ vật tồn 65 Các lónh vực ứng dụng kỹ thuật PCR Trong chọn giống vật nuôi trồng khó khăn, cần nhiều năm >< vài ngày, vài giờ, hiệu cao Trong y học chẩn đoán xác bệnh nhiễm trùng từ virut đến vi khuẩn bệnh nấm, kể HIV-AIDS chẩn đoán sớm theo dõi điều trị ung thư … Trong tư vấn di truyền y học chẩn đoán nhanh, xác bệnh di truyền 66 Các lónh vực ứng dụng kỹ thuật PCR Trong khoa học hình chẩn đoán nhanh, xác thủ phạm từ vết máu khô, sợi tóc sinh phẩm mà thủ phạm để lại trường cho phép xác định xác quan hệ huyết thống cha-con, ông-cháu v.v… vài Trong bảo vệ môi trường 67 xác định hiệu nhanh chóng mức độ PCR chẩn đoán tác nhân ngoại lai Thuận lợi so với phương pháp cổ điển, là: - Tiết kiệm thời gian - Là biện pháp tác nhân gây bệnh hay khó nuôi cấy: trực khuẩn Koch, Brucella, Chlamydia, virut viêm gan siêu vi B HBV (Hepatitis B Virus) - Độ nhạy cao (chỉ cần có vi sinh vật để ly trích ADN) - Không đòi hỏi nhiều kỹ thuật - Phổ áp dụng rộng: phát vi khuẩn , virus, nấm… 68 PCR chẩn đoán tác nhân ngoại lai Vi sinh vật gây bệnh định danh Vi khuẩnbởi PCR Actinobacillus pleuropneumoniae Enterohemorrhagic E coli Mycoplasma sp Aeromonas hydrophila Neisseria gonorrhoeae Enterotoxigienic E coli Bacillary angiomatosis agient Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis Bacillus anthracis Rickettsia sp Helicobacter pylori Bacterial menigitis pathogiensLegionella pneumophila S.aureus toxins Bordetella pertussis Leptospira sp Salmonella typhimurium Campylobacter sp Listeria monocytogiens Shigella sp Clamydia pneumoniae M aviumintracellulare Staphylococcus aureus, Clamydia trachomatis M leprae Treponema pallidum Clostridium difficile M tuberculosis Ureaplasma urealyticum Coliform bacteria Mycobacterium sp Vibrio cholerae Comamonas sp Mycoplasma fermantans Corynebacterium diphteriae Mycoplasma gienitalium Whipple's vi khuaån Yersinia pestis, Y.enterocolitic Ehrlichia sp Mycoplasma pneumoniae 69 PCR chẩn đoán tác nhân ngoại lai Vi sinh vật gây bệnh định danh PCR Virus Cytomegalovirus Human papillomavirus Enterovirus Human parvovirus B19 Epstein-Barr virus Influenza virus Herpes simplex virus types I vaø Rhinovirus II Rubella virus HIV-I II Sốt xuất huyết (Dengue) HTLV-I II, HBLV Varicella-zoster virus, Human adenovirus Vieâm gan A (HAV) Human herpes virus Viêm gan B virus (HBV) Human JC virus Vieâm gan C virus (HCV) 70 PCR chẩn đoán tác nhân ngoại lai Vi sinh vật gây bệnh định danh PCR Nấm gây bệnh Blastomyces dermatitidis Candida albicans Coccidioides immitis Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum Pneumocystis carnii Trichosporon beigelii 71 PCR chẩn đoán tác nhân ngoại lai Vi sinh vật gây bệnh định danh PCR Nguyên sinh động vật Babesia bigemina, B bovis, B.microti Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania sp Naegleria fowleri Plasmodium falciparum Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Trypanosoma sp 72 ... đổi ion vi cột: thu hồi lượng ADN nhỏ - Sắc ký lỏng hiệu cao: tinh chế oligonucletid tổng hợp (độ phân giải nt) plasmid phân tách đoạn ADN II CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯNG SƠ... trình tự đặc biệt ADN gen, ADN plasmid, phage, - lập đồ giới hạn gen - phát đa dạng trình tự: đột biến đoạn, đột biến điểm, tái tổ hợp 21 Phương pháp Southern blot Thang chuẩnADN ADN cắt Giấy thấm... TRÌNH TỰ ADN Pp Maxam & Gilbert – phương pháp hóa học Pp Sanger cs – phương pháp enzyme học giải trình tự nhờ vào kết thúc chuỗi 29 Pp Maxam & Gilbert – pp hóa học Các bước - Đánh dấu phân tử ADN