Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase thu nhận từ nấm mốc aspergillus aculeatus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG 0o0 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME AMYLASE THU NHẬN TỪ NẤM MỐC Aspergillus aculeatus Giảng viên hướng dẫn :PGS TS NGUYỄN VĂN DUY TS PHẠM THU THỦY Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ KIM THI Mã số sinh viên : 56130474 Khánh Hòa, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG 0o0 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME AMYLASE THU NHẬN TỪ NẤM MỐC Aspergillus aculeatus Giảng viên hướng dẫn :PGS TS NGUYỄN VĂN DUY TS PHẠM THU THỦY Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ KIM THI Mã số sinh viên : 56130474 Khánh Hòa, tháng 07/2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme amylase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus aculeatus” trình bày luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan Kết phần đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du vùng ven biển Khánh Hòa dựa cách tiếp cận phụ thuộc độc lập nuôi cấy” (mã số 106-NN.02-2016.70) TS Phạm Thu Thủy chủ nhiệm đề tài Quỹ NAFOSTED tài trợ kinh phí Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn xác rõ nguồn gốc Khánh Hòa, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kim Thi i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực luận văn, nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp này, xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp đại học Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Duy TS Phạm Thu Thủy, Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm quý báu suốt q trình thực luận văn Tơi gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể Quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học Bộ mơn Sinh học tận tình giúp đỡ Đặc biệt cảm ơn chị Trần Thị Châu Loan chị Huỳnh Thị Bích Mai bạn nhóm đồng hành giúp đỡ trong trình thực luận văn Tơi ln biết ơn gia đình, bạn bè đóng góp cơng sức, động viên tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kim Thi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG .vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nấm mốc .3 1.1.1 Vị trí phân loại nấm mốc 1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo tế bào nấm mốc 1.1.3 Dinh dưỡng sinh sản nấm mốc .5 1.2 Tổng quan enzyme amylase 1.2.1 Giới thiệu chung amylase .7 1.2.2 Phân loại amylase 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme amylase .11 1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme amylase .15 1.2.5 Các ứng dụng enzyme amyalse 17 1.3 Tình hình nghiên cứu enzyme amylase từ vi nấm biển 18 1.3.1 Tình hình nghiên cứu amylase từ vi nấm biển giới .18 1.3.2 Tình hình nghiên cứu amylase từ vi nấm biển Việt Nam 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu .21 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu .21 2.2 Hóa chất 21 2.2.1 Môi trường 21 2.2.2 Hóa chất 23 iii 2.3 Dụng cụ thiết bị chuyên dụng .25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Nuôi cấy nấm mốc 27 2.4.2 Bảo quản nấm mốc 28 2.4.3 Nhuộm đơn quan sát hính thái tế bào nấm mốc 28 2.4.4 Xác định hoạt độ enzyme amylase phương pháp sử dụng thuốc thử DNS (axit dinitrosalicylic) 28 2.4.5 Xử lí số liệu Excel 32 2.5 Bố trí thí nghiệm .32 2.5.1 Thí nghiệm khảo sát pH thích hợp cho hoạt động enzyme amylase 32 2.5.2 Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzyme 33 2.5.3 Thí nghiệm khảo sát độ bền pH 35 2.5.4 Thí nghiệm khảo sát độ bền nhiệt enzyme 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 DM12M 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng Aspergillus aculeatus 40 Khả sản sinh enzyme amylase ngoại bào chủng Aspergillus aculeatus DM12M 41 3.3 Khảo sát pH thích hợp cho hoạt động enzyme amylase thu từ Aspergillus aculeatus DM12M 42 3.4 Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho hoạt động enzyme amylase thu từ Aspergillus aculeatus DM12M 44 3.5 DM12M 3.6 Kết khảo sát độ bền pH enzyme amylase thu từ A aculeatus 46 Kết khảo sát độ bền nhiệt enzyme amylase thu từ chủng A aculeatus DM12M 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào nấm mốc Hình 1.2 Cấu trúc α-amylase nước bọt người Hình 1.3 Enzyme β-amylase từ lúa mạch 10 Hình1.4 Chủng Aspergillus oryzae thường dùng cho sản xuất amylase quy mô công nghiệp 16 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu trí nghiệm đề tài 26 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát pH thích hợp .33 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thích hợp .34 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng A aculeatus DM12M sau nuôi môi trường PDA ngày (A): mặt đĩa, (B): mặt dưới đĩa 40 Hình 3.2 Hình thái tế bào chủng DM12M quan sát kính hiển vi vật kính 100X .41 Hình 3.3 Vịng phân giải tinh bột enzyme amylase thu từ chủng A aculeatus DM12M 41 Hình 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt động enzyme amylase thu từ A aculeatus DM12M 44 Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động enzyme amylase từ chủng DM12M 46 Hình 3.6 Đồ thị khảo sát độ bền pH enzyme amylase 4ºC 24 thu từ A aculeatus DM12M 48 Hình 3.7 Độ bền nhiệt enzyme amylase thu từ A aculeatus DM12M 50 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Viết đầy đủ Ghi PDA Potato Dextrose agar Môi trường nuôi cấy nấm mốc DNS Axit dinitrosalicylic Thuốc thử dùng cho xác định hoạt độ enzyme amylase w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích Units/mililiter Đơn vị hoạt độ enzyme mililit U/ml vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng xây dựng đường chuẩn Maltose 0,2% (w/v) 30 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng xác định hoạt độ enzyme amylase theo phương pháp DNS 31 Bảng 3.1 Hoạt độ thu enzyme amylase ban đầu thu từ chủng DM12M 42 Bảng 3.2 Kết khảo sát pH thích hợp cho hoạt động enzyme amylase 43 Bảng 3.3 Kết khảo sát nhiệt độ thích hợp cho hoạt động enzyme amylase thu từ Aspergillus aculeatus DM12M 44 Bảng 3.4 Kết đo quang để khảo sát độ bền pH enzyme amylase thu từ A aculeatus DM12M 47 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ bền nhiệt enzyme amylase thu từ A aculeatus DM12M 49 vii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hệ enzyme amylase số enzyme sử dụng rộng rãi Amylases chiếm khoảng 30% sản lượng enzyme giới (Chimata cộng sự, 2010) Enzyme amylase ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Trong thực phẩm, amylases đóng vai trò quan trọng sản phẩm bánh, giúp tăng mùi vị cho bánh Amylase sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp để sản xuất glucose dextrin tan nước (, Shetty Crab, 1990; Akiba cộng sự, 1998) Enzyme sử dụng ngành công nghiệp khác công nghiệp giấy, sản xuất chất tẩy rửa (John, 2017) Amylse thường chia làm loại α-amylase, β-amylase, γ-amylase Trong α- amylase, β-amylase nghiên cứu ứng dụng rộng rãi Enzyme α-amylases có mặt rộng rãi thực vật (malt), mô động vật (nước bọt, tuyến tụy) vi sinh vật; βamylase có nhiều hạt nảy mầm, sản sinh vi sinh vật Trong vài thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu amylase ngoại bào sản xuất nhiều loại vi sinh vật tiến hành Những lợi việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất amylase khả sản xuất hàng loạt thao tác dễ dàng để thu enzyme có đặc tính mong muốn Trong amylase có nguồn gốc từ nấm ổn định so với enzyme vi khuẩn quy mô thương mại (Abu cộng 2005) Nhu cầu amylase cho công nghiệp ngày cao, đặc biệt enzyme có đặc tính phù hợp cho sản xuất quy mô lớn Người ta mong muốn amylase phải hoạt động nhiệt độ cao trình keo hóa (100-110ºC) hóa lỏng (80-90ºC), cần phải có thêm amylases bền nhiệt ổn định (Sindhu cộng sự, 1997) Chính việc nghiên cứu tìm kiếm nguồn sản xuất enzyme amylase mới với đặc tính tốt đáp ứng nhu cầu cơng nghiệp vô quan trọng Chúng ta biết vi sinh vật biển tạo loạt chất chuyển hóa cơng nghiệp quan trọng (Faulkner, 1994) Nhiều nghiên cứu thực tập trung chủ yếu vào khả sản xuất hợp chất hoạt tính sinh học nấm khả phân hủy loạt hợp chất polymer chưa khai thác tốt Hơn nữa, công nghiệp điều kiện muối cao ức chế q trình chuyển hóa enzyme (Kondepudi cộng 2008), việc nghiên cứu sản sinh enzyme từ vi nấm biển mở hướng mới giải vấn đề Nhiều enzyme từ vi nấm biển thể đặc tính ưu việt khả 25 Erdal S., 2010 Production of α-amylase by Penicillium expansum MT-1 in solid-state fermentation using waste Loquat (Eriobotrya japonica Lindley) kernels as substrate Romanian Biotechnological Letters, 15, 5342-5349 26 Eriksen S.H., Jensen B., Olsen J., 1998 Effect of N-Linked Glycosylation on Secretion, Activity, and Stability of a-Amylase from Aspergillus oryzae Current Microbiology, 37, 117-122 27 Fogarty W.M., Kelly C.T., 1979 Developments in microbial extracellular enzymes In: Wiseman A, editor Topics in enzyme and fermentation biotechnology 3, 45-108 28 Gautam S.P., Gupta A.K., Gupta A, 1992 Production of raw starch digestive amylases by Pichia anomala and Pichia holestii Biomedical Letters, 47, 61– 66 29 Goto C.E., Barbosa E.P, Kistner L.C.L, Gandra R.F, Arrias V.L., Peralta R.M., 1998 Production of amylase by Aspergillus fumigatus Revista de Microbiologia, 29, 99-103 30 Gupta G., Gigras P., Goswami V.K and Chauhan B., 2003 Microbial amylase: a biotechnological perspective Process Biochemistry, 38: 1599-1616 31 Hamilton L.M., Kelly C.T., Fogarty W.M., 1999 Purification and properties of the raw starch degrading α-amylase of Bacillus sp.IMD434 Biotechol Lett,21, 111-5 32 Haq I., Ali S., Javed M.M., Hameed u., Saleem A., Adnan F and Qadeer M.A., 2010 Production Of Alpha Amylase From A Randomly Induced Mutant Strain Of Bacillus Amyloliquefaciens And Its Application As A Desizer In Textile Industry Pakistan Journal of Botany, 42, 473-484 33 John J., 2017 Amylases- Bioprocess and Potential Applications: A Review Intl J Bioinformatics and Biological Sci, 5, 41-50 34 Kathiresan K and Manivannan S., 2006 Α-amylase production by Penicillium fellutanum iisolated from mangrove rhizosphere soil African Journal of Biotechnology, 5, 829-832 35 Khoo S.L., Amirul A.A., Kamaruzaman M., Nazalan N., Azizan M.N., 1994 Purification and characterization of α-amylase from Aspergillus flavus Folia Microbiol, 39, 392- 398 54 36 Kondepudi K.K and Chandra T.S 2008 Production of surfactant and detergent-stable, halophilic, and alkalitolerant alpha-amylase by a moderately halophilic Bacillus sp Strain TSCVKK Applied Microbiology and Biotechnology, 77, 1023– 1031 37 Konsoula Z and Kyriakides M.L., 2007 Co-production of α-amylase and β-galactosidase by Bacillus subtilis in complex organic substrates Journal of Biores Technol, 98, 150-157 38 Li H.F., Chi Z.M., Wang X.H., Duan X.H., Ma L.Y., Gao L.M., 2007 Purification and characterization of extracellular amylase from the marine yeast Aureobasidium pullulans N13d and its raw potato starch digestion Enzyme and Microbial Technology, 40, 1006-1012 39 Li X., 2007 A new species and a newly recorded species of tardigrade (Eutardigrada: Hypsibiidae) from China (Asia) Proceedings of the Biological Society of Washington 120, 189-196 40 Mahapatra S., Banerjee D., 2012 Production and Characterization of Thermal Axit Amylase from Aspergillus aculeatus DBF9 Dynamic Biochemistry, Process Biotechnology and Molecular Biology, 6, 109-112 41 Michelin M., Silva T.M., Benassi V.M., Peixoto-Nogueira S.C., Moraes L.A., Leão J.M., Jorge J.A., Terenzi H.F., Polizeli M.L., 2010 Purification and characteri- zation of a thermostable a-amylase produced by the fungus Paecilomyces variotii Carbohydrate Research 345, 2348-2353 42 Miller G.L., 1959 Use of dinitrosalicylic axit reagent for determination of reducing sugar Analytical Chemistry 31, 426-428 43 Mohammed S., Ziaee A.A and Mohammed A.A., 2010 Purification and biochemical characterization of a novel SDS and surfactant stable, raw starch digesting, and halophilic α-amylase from a moderately halophilic bacterium, Nesterenkonia sp Strain F Process Biochemistry, 45, 694–699 44 Mohapatra R., Banerjee U.C., Bapuji M., 1997 Characterization of a fungal amylase from Mucor sp Associated with the marine sponge Spirastrella sp Journal of Biotechnology, 60, 113–117 45 Monem N M.A., Azeem A M.A, Ashry E.S.H.E., Ghareeb D.A.E, and Adam A.N., 2013 Pretreatment hepatoprotective effect of the marine fungus derived 55 from sponge on hepatic toxicity induced by heavy metals in rats BioMed Research International, 510879 46 Moore D., 2011 21st Century Guidebook to Fungi, Cambridge University, United Kingdom 47 Moreira F.G., Lenartovicz V., Peralta R.M., 2004 A thermostable maltose- toler- ant alpha-amylase from Aspergillus tamarii Journal of Basic Microbiology 44, 29-35 48 Niziolek S., 1998 Production of extracellular amylolytic enzymes by some species of the genus Bacillus Acta microbiologica Polonica, 47, 19-29 49 Oboh G., 2005, Isolation and characterization of amylase from fermented cassava (Manihot esculenta Crantz) wastewater African Journal of Biotechnology, , 1117-1123 50 Prakash B., Vidyasagar M., Madhukumar M.S., Muralikrishna G and Sreeramulu K., 2009 Production, purification, and characterization of two extremely halotolerant, thermostable and alkali-stable α amylases from Chromohalobacter sp TVSP 101 Process Biochem, 44, 210–215 51 Ray R.R., 2002 β-amylases from various fungal strains Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 51, 85–95 52 Ray R.R., Chakraverty R., 1998 Extracellular β-amylase from by Syncephalastrum racemosum Mycological Research, 102, 1563–1567 53 Ray R.R., Jana S.C., Nanda G., 1994 β-amylase from Bacillus megaterium Folia Microbiologica, 39, 567–570 54 Reddy N.S., Nimmagadda A and Sambasiva Rao K.R.S., 2003 An overview of the microbial α-amylase family African Journal of Biotechnology, 2, 645648 55 Robyt J., Ackerman R.J., 1971 Isolation, purification and characterization of a maltotetraose producing amylase from Pseudomonas stutzeri Arch Biochem Biophys, 145, 105-14 56 Saranraj P and Stella D., 2013 Fungal Amylase - A Review International Journal of Microbiological Research, 4, 203-211 56 57 Schokker E.P and Van Boekel A.J.S., 1999 Kinetic of thermal inactivation of extracellular proteinase from Pseudomonas flurescens 22F, Influence of pH, Calcium and protein Journal of Agriculture and Food Chemistry, 47, 1681-1686 58 Sivaramakrishnan S., Gangadharan D., Nampoothiri K.M., Soccol C.R and Pandey A., 2006 α-Amylases from Microbial Sources – An Overview on Recent Developments Food Technol Biotechnol, 2, 173–184 59 Sivaramakrishnan S., Gangadharan S., Nampoothiri K.M., Soccol2 C.R and Pandey A., 2006 α-Amylases from Microbial Sources – An Overview on Recent Developments Food Technol Biotechnol, 44, 173–184 60 Varalakshmi K.N., Kumudini B.S., Nandini B.N.,Solomon J.,Suhas R., Mahesh B and Kavitha A.P., 2008 Production and Characterization of a-Amylase from Aspergillus niger JGI 24 Isolated in Bangalore Polish Journal of Microbiology, 58, 29−36 61 Vihinen M., Mantsala P., 1989 Microbial amylolytic enzymes Crit Rev Biochem Mol Biol, 24, 329- 418 62 Zhao X., Zhang L and Liu D., 2007 Comparative study on chemical pretreatment methods for improving enzymatic digestibility of crofton weed stem Bioresource Technology, 99, 3729-3736 57 PHỤ LỤC Phụ lục Đường chuẩn maltose 0,2% ( w/v) Ống Ống nghiệm Ống OD1 Ống OD2 Ống Ống Ống Ống Ống ĐC OD trung  Hàm lượng bình OD maltose (mg) ĐC 0,002 0,002 0,002 0 0,009 0,009 0,009 0.007 0,1 0,087 0,087 0,087 0,085 0,4 0,203 0,203 0,203 0,201 0,8 0,299 0,297 0,298 0,296 1,2 0,407 0,403 0,405 0,403 1,6 0,529 0,527 0,528 0,526 1,21 1,21 1,21 1,21 1.4 y = 0.3024x - 0.0406 R² = 0.9932 1.2 OD 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Hàm lượng Maltose (mg) Phụ lục 2: Kết đo quang khảo sát pH thích hợp cho phản ứng Kết đo lần pH OD1 OD2 ODĐC ODtb ΔOD maltose (mg) Hoạt độ (U/ml) 0,880 0,898 0,530 0,889 0,359 1,3 31,7 0,950 0,963 0,508 0,957 0,449 1,6 38,8 0,822 0,827 0,427 0,825 0,398 1,5 34,8 0,959 0,951 0,594 0,955 0,361 1,3 31,9 0,653 0,777 0,434 0,715 0,281 1,1 25,5 Pha loãng enzyme lần Hàm lượng Kết đo lần pH OD1 OD2 ODđc ODtb ΔOD lượng Hoạt độ Maltose U/ml) (mg) 0,875 0,885 0,494 0,880 0,386 1,4 33,9 0,915 0,922 0,456 0,919 0,463 1,7 39,9 0,868 0,488 0,879 0,391 1,4 34,3 0,919 0,902 0,599 0,911 0,312 1,2 27,9 0,89 0,886 0,281 1,1 25,5 0,89 0,881 0,605 pha loãng enzyme lần Hàm Kết lần đc odtb ΔOD Hàm lượng maltose( mg) Hoạt độ U/ml) 0,688 0,686 0,388 0,687 0,299 1,1 31,4 0,719 0,698 0,319 0,709 0,390 1,4 39,8 0,591 0,587 0,306 0,589 0,283 1,1 30,0 0,55 0,9 25,6 0,538 0,531 0,8 23,6 0,548 0,313 0,549 0,236 0,32 0,535 0,215 Pha loãng enzyme lần pH Phụ lục 3: Kết đo quang khảo sát nhiệt độ thích hợp cho phản ứng Nhiệt độ (ºC) 20 30 37 40 50 60 OD1 OD2 ODđc ODtb ΔOD 0,648 0,68 0,765 0,739 0,751 0,685 0,642 0,673 0,761 0,737 0,747 0,689 0,397 0,391 0,364 0,331 0,352 0,356 0,645 0,677 0,763 0,738 0,749 0,687 0,248 0,286 0,399 0,407 0,397 0,331 Hàm lượng maltose (mg) 1,0 1,1 1,5 1,5 1,4 1,2 Hoạt độ enzyme (U/ml) 26,7 30,2 40,7 41,4 40,5 34,4 Pha loãng enzyme lần Kết lần Nhiệt độ OD1 (ºC) OD2 ODđc ODtb ΔOD Hàm lượng maltose (mg) Hoạt độ enzyme (U/ml) 20 0,621 0,622 0,356 0,622 0,266 1,0 28,3 30 0,669 0,663 0,393 0,666 0,273 1,0 29,0 37 0,731 0,756 0,349 0,744 0,395 1,4 40,3 40 0,701 0,699 0,299 0,700 0,401 1,5 40,9 50 0,696 0,698 0,359 0,697 0,338 1,3 35,1 60 0,651 0,659 0,346 0,655 0,309 1,2 32,4 Hàm lượng maltose (mg) Hoạt độ enzyme (U/ml) Pha loãng enzyme lần Kết lần Nhiệt độ OD1 (ºC) OD2 ODđc ODtb ΔOD 20 0,516 0,544 0,265 0,530 0,265 1,0 28,3 30 0,567 0,573 0,570 0,270 1,0 28,8 37 0,696 0,719 0,308 0,708 0,400 1,5 40,8 40 0,653 0,645 0,242 0,649 0,407 1,5 41,4 50 0,674 0,677 0,331 0,676 0,345 1,3 35,7 60 0,623 0,619 0,337 0,621 0,284 1,1 30,1 0,3 Pha loãng enzyme lần Kết lần Phụ lục 4: Kết đo quang khảo sát độ bền pH enzyme Kết lần pH OD1 OD2 OD ĐC ODTB ΔOD Hàm lượng Hoạt độ maltose (mg) enzyme (U/ml) 0,749 0,768 0,521 0,759 0,238 0,9 22,1 0,773 0,781 0,518 0,777 0,259 1,0 23,8 0,822 0,806 0,528 0,814 0,286 1,1 25,9 0,685 0,673 0,378 0,679 0,301 1,1 27,1 0,759 0,719 0,374 0,739 0,365 1,3 32,2 0,764 0,778 0,771 0,251 1,0 23,1 Hàm lượng maltose (mg) Hoạt độ enzyme (U/ml) 0,52 Kết lần pH OD1 OD2 0,69 0,673 0,765 OD ĐC 0,698 0,451 ODTB ΔOD 0,694 0,243 0,9 22,5 0,45 0,719 0,269 1,0 24,6 0,765 0,709 0,444 0,737 0,293 1,1 26,5 0,867 0,855 0,561 0,861 0,300 1,1 27,0 0,831 0,898 0,496 0,865 0,369 1,4 32,5 0,595 0,739 0,419 0,667 0,248 1,0 22,9 Hàm lượng maltose (mg) Hoạt độ enzyme (U/ml) Kết lần pH OD1 OD2 OD ĐC ODTB ΔOD 0,713 0,683 0,458 0,698 0,240 0,9 22,3 0,787 0,797 0,498 0,792 0,294 1,1 26,6 0,679 0,622 0,361 0,651 0,290 1,1 26,2 0,581 0,536 0,247 0,559 0,312 1,2 27,9 0,612 0,535 0,203 0,574 0,371 1,4 32,6 0,605 0,595 0,308 0,600 0,292 1,1 26,4 Phụ lục 5: Kết đo quang khảo sát độ bền nhiệt enzyme Thời gian (phút) 15 OD1 OD2 OD ĐC 0,789 0,78 0,547 0,785 0,238 0,920 Hoạt độ enzyme (U/ml) 18,393 30 0,756 0,761 0,561 0,759 0,198 0,787 15,747 45 0,643 0,665 0,566 0,654 0,088 0,425 8,505 60 0,615 0,631 0,587 0,623 0,036 0,253 5,066 75 0,602 0,603 0,581 0,603 0,022 0,205 4,107 90 0,591 0,594 0,589 0,593 0,004 0,146 2,917 Hàm lượng maltose (mg) Hoạt độ enzyme (U/ml) ODTB ΔOD Hàm lượng maltose (mg) Pha loãng lần Nhiệt độ 80ºC lần Thời gian (phút) OD1 OD2 OD ĐC 15 0,769 0,76 0,518 0,765 0,247 0,949 18,988 30 0,741 0,759 0,532 0,750 0,218 0,855 17,103 45 0,656 0,649 0,549 0,653 0,104 0,477 9,530 60 0,635 0,557 0,638 0,080 0,400 8,009 75 0,609 0,599 0,581 0,604 0,023 0,210 4,206 90 0,581 0,582 0,582 0,001 0,139 2,784 0,64 0,58 ODTB ΔOD Pha loãng lần Nhiệt độ 80ºC lần2 Nhiệt độ 70ºC lần gian OD1 OD OD2 ĐC (phút) Hàm lượng Hoạt độ ODTB ΔOD maltose enzyme (mg) (U/ml) 15 0,849 0,851 0,463 0,850 0,387 1,414 28,3 30 0,831 0,471 0,821 0,350 1,290 25,8 45 0,792 0,803 0,472 0,798 0,326 1,211 24,2 60 0,789 0,699 0,512 0,744 0,232 0,901 18,0 75 0,751 0,744 0,531 0,748 0,217 0,850 17,0 90 0,751 0,761 0,533 0,756 0,223 0,872 17,4 Hoạt độ enzyme (U/ml) 27,487 0,81 Pha loãng lần Thời Thời gian OD1 OD2 (phút) 0,878 0,892 15 0,51 Hàm lượng ODTB ΔOD maltose (mg) 0,885 0,375 1,374 30 0,821 0,486 0,811 0,325 1,207 24,147 45 0,797 0,799 0,501 0,798 0,297 1,116 22,328 60 0,776 0,781 0,484 0,779 0,295 1,108 22,163 75 0,771 0,527 0,776 0,249 0,956 19,12 90 0,701 0,699 0,513 0,700 0,187 0,753 15,053 0,8 0,78 OD ĐC Pha loãng lần Nhiệt độ 70ºC lần2 Nhiệt độ 60º lần 15 Hàm OD lượng OD1 OD2 ODTB ΔOD ĐC maltose (mg) 0,917 0,871 0,413 0,894 0,481 1,725 30 0,871 0,869 0,421 0,870 0,449 1,619 32,381 45 0,752 0,739 0,422 0,746 0,324 1,204 24,081 60 0,749 0,752 0,437 0,751 0,314 1,171 23,419 75 0,81 0,801 0,301 1,128 22,560 90 0,737 0,739 0,448 0,738 0,290 1,093 21,865 0,791 0,5 Hoạt độ enzyme (U/ml) 34,497 Pha loãng lần Thời gian (phút) Nhiệt độ 60ºC lần OD2 OD ĐC Hàm lượng ODTB ΔOD maltose (mg) 15 0,879 0,925 0,4 0,902 0,502 1,794 35,886 30 0,877 0,411 0,874 0,463 1,664 33,274 45 0,815 0,763 0,429 0,789 0,360 1,325 26,495 60 0,799 0,792 0,457 0,796 0,339 1,254 25,073 75 0,792 0,785 0,477 0,789 0,312 1,164 23,287 90 0,781 0,777 0,479 0,779 0,300 1,126 22,526 OD1 0,87 Hoạt độ enzyme (U/ml) Pha loãng lần Thời gian (phút) Nhiệt độ 50ºC lần gian OD1 OD2 (phút) OD ĐC ODTB ΔOD lượng maltose (mg) 15 0,923 0,899 30 enzyme (U/ml) 0,911 0,511 1,824 36,481 0,897 0,895 0,399 0,896 0,497 1,778 35,556 45 0,893 0,798 0,401 0,846 0,445 1,604 32,083 60 0,801 0,785 0,413 0,793 0,380 1,391 27,817 75 0,796 0,791 0,417 0,794 0,377 1,379 27,586 0,794 0,369 1,354 27,090 90 0,8 0,4 Hoạt độ 0,788 0,425 Pha loãng lần Hàm Thời Thời gian OD1 OD2 (phút) OD ĐC ODTB ΔOD Hàm Hoạt lượng độ maltose enzyme (mg) (U/ml) 15 0,938 0,924 0,389 0,931 0,542 1,927 38,532 30 0,915 0,929 0,402 0,922 0,520 1,854 37,077 45 0,913 0,896 0,419 0,905 0,486 1,740 34,795 60 0,825 0,799 0,408 0,812 0,404 1,470 29,405 75 0,789 0,794 0,399 0,792 0,393 1,432 28,644 90 0,777 0,789 0,419 0,783 0,364 1,338 26,759 Pha loãng lần Nhiệt độ 50ºC lần Nhiệt độ 40ºC lần gian OD1 OD2 (phút) OD ĐC ODTB ΔOD Hàm Hoạt lượng độ maltose enzyme (mg) (U/ml) 15 0,965 0,969 0,391 0,967 0,576 2,039 40,780 30 0,967 0,962 0,419 0,965 0,546 1,938 38,763 45 0,909 0,923 0,398 0,916 0,518 1,847 36,944 60 0,9 0,899 0,413 0,900 0,487 1,743 34,861 75 0,869 0,859 0,421 0,864 0,443 1,599 31,984 90 0,863 0,857 0,425 0,860 0,435 1,573 31,455 Pha loãng lần Thời 0,579 Hàm lượng maltose (mg) 2,047 Hoạt độ enzyme (U/ml) 40,946 0,967 0,565 2,001 40,02 0,398 0,884 0,486 1,741 34,828 0,876 0,421 0,872 0,451 1,624 32,48 0,853 0,847 0,412 0,850 0,438 1,583 31,653 0,869 0,87 0,433 0,870 0,437 1,578 31,554 Thời gian (phút) OD1 OD2 OD ĐC 15 0,988 0,971 0,401 0,980 30 0,97 0,963 0,402 45 0,889 0,879 60 0,867 75 90 ODTB ΔOD Pha loãng lần Nhiệt độ 40ºC lần Thời gian (phút) OD1 OD2 OD ĐC ODTB Hàm Hoạt độ lượng ΔOD enzyme maltose (U/ml) (mg) 15 0,989 0,983 0,405 0,986 0,581 2,0556 41,111 30 0,979 0,981 0,41 0,980 0,570 2,0192 40,384 45 0,952 0,951 0,413 0,952 0,539 1,915 38,300 60 0,95 0,944 0,411 0,947 0,536 1,9067 38,135 75 0,951 0,945 0,423 0,948 0,525 1,8704 37,407 90 0,951 0,949 0,43 0,950 0,520 1,8538 37,077 Pha loãng lần Nhiệt độ 30ºC lần Nhiệt độ 30ºC lần OD1 15 0,979 Hàm OD lượng OD2 ODTB ΔOD ĐC maltose (mg) 0,987 0,399 0,983 0,584 2,065 30 0,97 0,969 45 0,964 60 0,4 Hoạt độ enzyme (U/ml) 41,31 0,970 0,570 2,018 40,351 0,955 0,417 0,960 0,543 1,928 38,565 0,917 0,924 0,398 0,921 0,523 1,862 37,242 75 0,948 0,952 0,434 0,950 0,516 1,841 36,812 90 0,945 0,932 0,427 0,939 0,512 1,826 36,515 Pha loãng lần Thời gian (phút) ... ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME AMYLASE THU NHẬN TỪ NẤM MỐC Aspergillus aculeatus Giảng viên hướng dẫn :PGS TS NGUYỄN VĂN DUY TS PHẠM THU THỦY Sinh... enzyme amylase phương pháp đo vòng phân giải chất phương pháp sử dụng thu? ??c thử DNS Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme amylase Nội Dung 4: Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzyme. .. amylase thu từ Aspergillus aculeatus DM12M 44 3.5 DM12M 3.6 Kết khảo sát độ bền pH enzyme amylase thu từ A aculeatus 46 Kết khảo sát độ bền nhiệt enzyme amylase thu từ chủng A aculeatus