Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase thu nhận từ nấm mốc aspergillus aculeatus

Nhiều nghiên cứu đã thực hiện tập trung chủ yếu vào khả năng sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học của nấm trong khi khả năng phân hủy một loạt các hợp chất polymer chưa được khai thá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Giảng viên hướng dẫn :PGS TS NGUYỄN VĂN DUY

TS PHẠM THU THỦY

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ KIM THI

Mã số sinh viên : 56130474

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến

hoạt động của enzyme amylase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus aculeatus” được

trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan

Kết quả này là một phần của đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du ở vùng ven biển Khánh Hòa dựa trên cách tiếp cận phụ thuộc và độc lập nuôi cấy” (mã số 106-NN.02-2016.70) do TS Phạm Thu Thủy là chủ nhiệm đề tài và Quỹ NAFOSTED tài trợ kinh phí

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều chính xác và được chỉ rõ nguồn gốc

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kim Thi

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều

tổ chức và cá nhân Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp đại học

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn là PGS.TS Nguyễn Văn Duy và TS Phạm Thu Thủy, Viện Công nghệ sinh học & Môi trường,

Trường Đại học Nha Trang đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể Quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học và Bộ môn Sinh học đã tận tình giúp đỡ Đặc biệt cảm ơn chị Trần Thị Châu Loan và chị Huỳnh Thị Bích Mai cũng như các bạn cùng nhóm đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong quá trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè đã đóng góp công sức, động viên tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2018

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kim Thi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về nấm mốc 3

1.1.1 Vị trí phân loại của nấm mốc 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái và cấu tạo tế bào nấm mốc 3

1.1.3 Dinh dưỡng và sinh sản của nấm mốc 5

1.2 Tổng quan về enzyme amylase 7

1.2.1 Giới thiệu chung về amylase 7

1.2.2 Phân loại amylase 8

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme amylase 11

1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme amylase 15

1.2.5 Các ứng dụng của enzyme amyalse 17

1.3 Tình hình nghiên cứu enzyme amylase từ vi nấm biển 18

1.3.1 Tình hình nghiên cứu amylase từ vi nấm biển trên thế giới 18

1.3.2 Tình hình nghiên cứu amylase từ vi nấm biển ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 21

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Hóa chất 21

2.2.1 Môi trường 21

2.2.2 Hóa chất 23

2.3 Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 25

2.4.1 Nuôi cấy nấm mốc 27

2.4.2 Bảo quản nấm mốc 28

2.4.3 Nhuộm đơn và quan sát hính thái tế bào nấm mốc 28

2.4.4 Xác định hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp sử dụng thuốc thử DNS (axit dinitrosalicylic) 28

2.4.5 Xử lí số liệu bằng Excel 32

2.5 Bố trí thí nghiệm 32

2.5.1 Thí nghiệm khảo sát pH thích hợp cho hoạt động của enzyme amylase 32 2.5.2 Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme 33

2.5.3 Thí nghiệm khảo sát độ bền pH 35

2.5.4 Thí nghiệm khảo sát độ bền nhiệt của enzyme 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng Aspergillus aculeatus DM12M 40 3.2 Khả năng sản sinh enzyme amylase ngoại bào của chủng Aspergillus aculeatus DM12M 41

3.3 Khảo sát pH thích hợp cho hoạt động của enzyme amylase thu được từ Aspergillus aculeatus DM12M 42

3.4 Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme amylase thu được từ Aspergillus aculeatus DM12M 44

3.5 Kết quả khảo sát độ bền pH của enzyme amylase thu được từ A aculeatus DM12M 46 3.6 Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của enzyme amylase thu được từ chủng A aculeatus DM12M 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào nấm mốc 4

Hình 1.2 Cấu trúc α-amylase trong nước bọt người 9

Hình 1.3 Enzyme β-amylase từ lúa mạch 10

Hình1.4 Chủng Aspergillus oryzae thường được dùng cho sản xuất amylase quy

mô công nghiệp 16 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu và bộ trí nghiệm của đề tài 26 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát pH thích hợp 33 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thích hợp 34

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng A aculeatus DM12M sau khi nuôi trên môi

trường PDA trong 3 ngày (A): mặt trên đĩa, (B): mặt dưới đĩa 40 Hình 3.2 Hình thái tế bào chủng DM12M quan sát trên kính hiển vi vật kính 100X 41

Hình 3.3 Vòng phân giải tinh bột của enzyme amylase thu được từ chủng A

được từ A aculeatus DM12M 48 Hình 3.7 Độ bền nhiệt của enzyme amylase thu được từ A aculeatus DM12M 50

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

độ enzyme amylase

3 w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích

Đơn vị hoạt độ enzyme trong một mililit

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát pH thích hợp cho hoạt động của enzyme amylase 43

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme

amylase thu được từ Aspergillus aculeatus DM12M 44

Bảng 3.4 Kết quả đo quang để khảo sát độ bền pH của enzyme amylase thu

được từ A aculeatus DM12M 47 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của enzyme amylase thu được từ A

aculeatus DM12M 49

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hệ enzyme amylase là một trong số các enzyme sử dụng rộng rãi nhất hiện nay Amylases chiếm khoảng 30% sản lượng enzyme của thế giới (Chimata và cộng sự, 2010) Enzyme amylase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Trong thực phẩm, amylases đóng vai trò quan trọng trong các sản phẩm bánh, giúp tăng mùi vị cho bánh Amylase được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp để sản xuất glucose và dextrin tan trong nước (, Shetty và Crab, 1990; Akiba và cộng sự, 1998) Enzyme này cũng được sử dụng trong các ngành công nghiệp khác như công nghiệp giấy, sản xuất

chất tẩy rửa (John, 2017)

Amylse thường được chia làm 3 loại α-amylase, β-amylase, γ-amylase Trong đó α- amylase, β-amylase được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi Enzyme α-amylases có mặt rộng rãi trong thực vật (malt), mô động vật (nước bọt, tuyến tụy) và vi sinh vật; β-amylase có nhiều trong hạt nảy mầm, và cũng được sản sinh bởi vi sinh vật

Trong vài thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu về amylase ngoại bào được sản xuất bởi nhiều loại vi sinh vật được tiến hành Những lợi thế chính của việc sử dụng vi sinh vật

để sản xuất amylase là khả năng sản xuất hàng loạt và thao tác dễ dàng hơn để thu được các enzyme có đặc tính mong muốn Trong đó amylase có nguồn gốc từ nấm ổn định hơn so với các enzyme vi khuẩn trên quy mô thương mại (Abu và cộng sự 2005)

Nhu cầu amylase cho công nghiệp ngày càng cao, đặc biệt là các enzyme có đặc tính phù hợp cho sản xuất ở quy mô lớn Người ta mong muốn rằng amylase phải hoạt động được ở nhiệt độ cao trong quá trình keo hóa (100-110ºC) và hóa lỏng (80-90ºC),

do đó cần phải có thêm amylases bền nhiệt và ổn định (Sindhu và cộng sự, 1997) Chính

vì thế việc nghiên cứu tìm kiếm các nguồn sản xuất enzyme amylase mới với các đặc tính tốt đáp ứng nhu cầu công nghiệp là vô cùng quan trọng

Chúng ta đã biết rằng các vi sinh vật biển tạo ra một loạt các chất chuyển hóa công nghiệp quan trọng (Faulkner, 1994) Nhiều nghiên cứu đã thực hiện tập trung chủ yếu vào khả năng sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học của nấm trong khi khả năng phân hủy một loạt các hợp chất polymer chưa được khai thác tốt Hơn nữa, trong công nghiệp điều kiện muối cao sẽ ức chế quá trình chuyển hóa của enzyme (Kondepudi và cộng sự 2008), việc nghiên cứu sản sinh enzyme từ vi nấm biển sẽ mở ra hướng đi mới giải quyết vấn đề trên Nhiều enzyme từ vi nấm biển thể hiện các đặc tính ưu việt như khả năng

chịu nhiệt, chịu lạnh, chịu mặn, chịu kiềm Vì vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Tối

ưu hóa điều kiện hoạt động và khảo sát độ bền của enzyme amylase thu được từ

Aspergillus aculeatus” Nhằm góp phần tìm ra nguồn sản xuất enzyme amylase với các

đặc tính mới có tiềm năng trong công nghiệp

2 Mục tiêu đề tài

‐ Khảo sát nhiệt độ và pH thích hợp hoạt động của enzyme amylase thu được từ

nấm mốc Aspergillus aculeatus DM12M

‐ Khảo sát độ bền nhiệt độ và độ bền pH của enzyme amylase thu được

3 Nội dung chính của đề tài

‐ Khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng Aspergillus aculeatus

DM12M

‐ Khảo sát khả năng sản sinh enzyme amylase ngoại bào của chủng Aspergillus

aculeatusDM12M

‐ Khảo sát nhiệt độ phản ứng tối ưu cho enzyme amylase thu được từ nấm mốc

Aspergillus aculeatus ở các khoảng nhiệt độ 20, 30, 37, 40, 50, 60ºC

‐ Khảo pH phản ứng tối ưu của enzyme amylase thu được từ nấm mốc Aspergillus

aculeatus ở các giá trị pH 4, 5, 6, 7, 8

‐ Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme amylase thu được từ nấm mốc Aspergillus

aculeatus ở các nhiệt độ 30, 40, 50, 60, 70, 80ºC trong vòng 15, 30, 45, 60, 75, 90 phút

‐ Khảo sát độ bền pH của enzyme amylase thu được từ nấm mốc Aspergillus

aculeatus ở các pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, trong vòng 24 giờ ở 4ºC

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

‐ Kết quả nghiên cứu góp phần tìm ra chủng vi nấm sản sinh ezyme amylase mạnh

có độ bền cao và chịu được các điều kiện của sản xuất công nghiệp nhất là về pH và nhiệt độ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về nấm mốc

1.1.1 Vị trí phân loại của nấm mốc

Giới nấm bao gồm các sinh vật dị dưỡng, vì cơ thể của chúng không có diệp lục

tố, dinh dưỡng theo kiểu hấp thụ - dị dưỡng (hoại sinh hay kí sinh) Moore và cộng sự (2011) phân loại giới nấm làm 7 ngành, dựa trên cấu trúc của cơ quan sinh sản hữu tính của chúng:

 Chytridiomycota (706 loài thuộc 105 chi)

 Blastocladiomycota (179 loài thuộc 14 chi)

 Neocallimastigomycota (20 loài thuộc 6 chi)

 Microsporidia (1.300 loài thuộc 170 chi)

 Glomeromycota (169 loài thuộc 12 chi)

 Ascomycota (64.163 loài thuộc 6355 chi)

 Basidiomycota (31.515 loài thuộc 1589 chi)

1.1.2 Đặc điểm hình thái và cấu tạo tế bào nấm mốc

 Đặc điểm hình thái

Tế bào nấm mốc có dạng hình sợi, phân nhánh, có hoặc không có vách ngăn Sợi nấm sinh trưởng ở đỉnh và phát triển rất nhanh, tạo thành một đám chằng chịt gọi là hệ sợi, từng sợi được gọi là khuẩn ty (hypha) Khuẩn ty nấm có rất nhiều hình dạng khá nhau như hình lo xo, hình xoắn ốc, hình cái vợt, hình sừng hươu, hình cái lược, hình lá dừa (Nguyễn Xuân Thành, 2005; Nguyễn Văn Bá, 2005)

Sợi nấm là những ống nhỏ, thành ống bao lấy một lớp nguyên sinh chất có nhiều nhân, đầu các nhánh sợi nấm luôn luôn phát triển, hai bên sợi cũng phân nhánh rất nhiều, khiến cho cơ thể nấm mau chóng trở thành một lớp như sợi bông hoặc có cấu trúc len

dạ Khi nấm trưởng thành, một số sợi nấm phân hóa ít hoặc nhiều để trở thành cơ quan sinh sản, mang những cấu trúc làm nhiệm vụ duy trì nòi giống Ở nấm mốc, sợi nấm thường có đường kính 5 – 10 µm nhưng có khi nhỏ 1 – 2 µm hoặc lớn đến 25 µm (Đặng

Vũ Hồng Miên, 2015)

 Cấu tạo tế bào

Nấm mốc là sinh vật nhân thực, có cấu tạo đa bào Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có cellulose Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzyme chitin synthase (Nguyễn Văn Bá, 2005)

Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào nấm mốc

(Nguyễn Thị Thanh Bình, 2010)

Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng lưới nội chất (endoplasmic reticulum), không bào (vacuole), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid) Đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribosome và những thể khảm chưa rõ chức năng Tế bào nấm không có diệp lục, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng, ví dụ như có

màu tím đỏ ở nấm Cercosporina kikuchi gọi là neocercosporin (C29H26O10) (Nguyễn Văn Bá, 2005)

Tế bào nấm thường có nhiều nhân Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein dầy 0,02 μm, bên trong màng nhân chứa RNA và DNA (Nguyễn Văn Bá, 2005) Các loài nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách

ngăn Ngược lại, các loài nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách ngăn Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều nhân nhưng vẫn có thể gọi là đơn bào Ở các nấm không vách ngăn thì vẫn có thể bình hình thành khi cơ thể sinh sản hoặc tại các bộ phận sợi nấm bị tổn thương Đó là loại vách ngăn liền, không có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ cơ thể (Võ Thị Bích Vân, 2010) Mỗi tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân Tuy nhiên, sợi nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều tế bào Vách ngăn ngang được hình thành từ thành tế bào Lúc đầu là một

gờ nhỏ hình khuyên sau đó tiến dần vào trong và lấp kín lại Vách ngăn thường có một hay nhiều lỗ thủng Các lỗ có kích thước bằng nhau hay có lỗ lớn nhất ở giữa và nhiều

lỗ nhỏ xung quanh (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)

Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào môi trường hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên

bề mặt sợi nấm Các đặc điểm hình thái khác có tính đặc trưng cho loài như bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hòa tan

1.1.3 Dinh dưỡng và sinh sản của nấm mốc

 Dinh dưỡng

Phần lớn các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng Nhiệt

độ tối thiểu cần cho sự phát triển là 2oC đến 5oC, tối ưu từ 22 – 27oC và nhiệt độ tối đa

mà chúng có thể chịu đựng được là 35 – 40oC, cá biệt có một số loài có thể sống sót ở

0oC và 60oC Bên cạnh đó, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường axit (pH = 6) nhưng pH tối ưu là 5–6,5 (Nguyễn Văn Bá, 2005)

Nấm mốc không có diệp lục nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong

cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ, cũng như có nhóm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định Theo Alexopoulos và Mims (1979), nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự như sau: C, O, H, N,

P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn đơn giản như glucose, muối ammonium… sẽ được nấm hấp thu dễ dàng Nếu

từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sinh sản và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp để phân cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ dàng hấp thu vào trong tế bào (Nguyễn Văn Bá, 2005)

 Sinh sản

Nấm mốc sinh sản chủ yếu bằng bào từ, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất Trong sinh sản hữu tính, nấm sợi có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp

Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học như: enzyme, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích kinh tế cao Bên cạnh đó, chúng còn sinh các enzyme

có khả năng phân giải nguồn hydrocacbon ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất (Khưu Phương Yến Anh, 2007)

 Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Nấm mốc đã trở thành một trong những nguồn vi sinh vật chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzyme Hiện nay, từ nấm mốc người ta đã sản xuất được trên 80 loại enzyme khác nhau, trong đó có 10 enzyme được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật Một số enzyme ngoại bào từ nấm mốc được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như cellulase, protease, amylase, pectinase và chitinase (Nguyễn Đức Lượng, 2004, Lương Đức Phẩm, 2004)

Cellulase là enzyme xúc tác phân giải các hợp chất lingo –cellulose thành glucose Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemicellulose và lignin (15-30%) Các chủng nấm mốc thuộc các chi

Trichoderma, Penicillium, Aspergillus…có khả năng sinh enzyme cellulase được sử

dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất thải hữu cơ, các xác bã thực vật chứa cellulose (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Protease là enzyme thủy phân các phân tử protein tạo thành các chuỗi polypeptide ngắn và axit amin Nấm sợi có khả năng phân giải mạnh protein chứa trong các xác bã

động vật thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,…Protease còn được sử

dụng nhiều trong công nghiệp bột giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

Amylase là enzyme xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực vật thành đường glucose Tổ hợp phức hệ enzyme amylase (α-amylase, β-amylase

và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucpside trong phân

tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose Các chi nấm mốc có khả năng phân

giải tinh bột là Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor,… Amylase

được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt, (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

Chitin là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên kết với nhau bởi

liên kết β-1,4-glucoside Nhiều loài nấm sợi thuộc chi Trichoderma, Glycladium,

Chaetomium,… có khả năng sinh chitinase, giúp tăng cường khả năng tiêu diệt các loài

nấm gây bệnh và chống các loài côn trùng có vỏ kitin (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

1.2 Tổng quan về enzyme amylase

1.2.1 Giới thiệu chung về amylase

Enzyme là chất xúc tác có bản chất là protein Người ta khám phá ra rằng các enzyme đã xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình chuyển hóa các cơ chất trong cơ thể sống với tốc độ nhịp nhàng, cân đối, theo những chiều hướng xác định Chúng có tính đặc hiệu cơ chất cao, xúc tác các phản ứng hóa học đặc biệt ở nhiệt độ áp suất và pH bình thường, phần lớn các chất xúc tác khác đều không có đặc tính này.Vì vậy việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme có ý nghĩa

to lớn về mặt lí thuyết cũng như thực tế

Amylase thuộc lớp enzyme thủy phân (hydrolase), chúng thủy phân các liên kết 1,4 và α-1,6 glucoside của tinh bột Các enzyme amylase từ các nguồn khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng và thành phần sản phẩm cuối (Nguyễn Trọng Cẩn, 1988)

α-Enzyme amylase có thể thu được từ nguồn thực vật, động vật và vi sinh vật Amylase có trong tuyến tụy của động vật, trong hạt nảy mầm ở thực vật, tuy nhiên nguồn chiết từ động vật và thực vật khá nhỏ, không đủ cung cấp cho công nghiệp Ngày nay người ta thu amylase chủ yếu từ vi sinh vật do những lợi thế như hiệu quả chi phí, ít thời gian, không gian cần thiết cho sản xuất nhỏ và dễ dàng sửa đổi và tối ưu hóa quy trình (Burhan và cộng sự, 2003)

Nấm mốc là một nguồn sản xuất amylase đang rất được quan tâm, với nhiều đặc

tính phù hợp ứng dụng trong sản xuất công nghiệp

1.2.2 Phân loại amylase

Amylase là tên gọi của một nhóm enzyme có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin (Nguyễn Thị Lan Hương, 2009) Các amylase chủ yếu thủy phân tinh

bột thường gặp là α-amylase, β-amylase, γ-amylase

 Enzyme α-amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC3.2.1.1)

Enzyme α-amylase là enzyme phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch

amilose và amilopectin một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào cả Việc tác dụng amylase lên hồ tinh bột làm giảm nhanh khả năng bắt màu của tinh bột với iod và độ nhớt của dịch thủy phân, amilose tạo thành maltose và maltotriose Nếu trong thời gian dài thì sản phẩm thủy phân của amilose chứa 13% glucose và 87% maltose Còn khi enzyme thủy phân amilopectin sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose (Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007) Enzyme α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột đã hồ hóa Enzyme α-amylase của nấm mốc có thể chuyển hóa 84% đến 87% tinh bột thành glucose và maltose (Xova và Erosina, 1991)

α-Enzyme α-amylase là một protein có phân tử lượng thấp thường nằm trong khoảng

từ 50.000 đến 60.000 Da Một số trường hợp đặc biệt như α-amylase từ Bacillus maceras

có phân tử lượng lớn đến 130000 Da Trọng lượng phân tử α-amylase nấm mốc thường

từ 45.000 đến 50.000 Da (Knir, 1956)

Enzyme α-amylase là enzyme chính trong đường tiêu hóa của động vật Ở người α-amylase có trong nước bọt và do tuyến tụy tiết ra Chúng cũng được sản xuất bởi thực vật, vi nấm, vi khuẩn

Đến nay, người ta đã biết rõ trình tự các chuỗi của axit amin của các loại α-amylase

nhưng chỉ có 2 loại α-amylase là taka-amylase từ Aspergillus oryzae và α-amylase từ

tụy lợn được nghiên cứu kỹ về cấu trúc bậc ba

Hình 1.2 Cấu trúc α-amylase trong nước bọt người

(https://vi.wikipedia.org/wiki/Alpha-amylase) Thủy phân tinh bột bằng α – amylase thường xảy ra hai giai đoạn:

* Giai đoạn đầu: (Giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt

và độ nhớt từ hồ tinh bột giảm tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

* Giai đoạn 2: (Giai đoạn đường hóa) thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành (Nguyễn Thị Hồng Loan, 2003)

 Enzyme β-amylase (β-1,4 glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2)

β-amylase xác tác cho sự thủy phân các liên kết α-1,4 glycoside trong tinh bột, phân cắt nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glycoside đứng cận kề liên kết α-1,6 glycoside thì

sẽ ngừng lại Tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi α-amylase và β-amylase thì lượng tinh bột bị thủy phân tới 95% (Nguyễn Thị Hồng Loan, 2003) Chúng phân giải 100% amilose và 54-58% amilopectin thành maltose (Lương Đức Phẩm, 2004)

Enzyme β-amylase ở lúa mạch có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự do có khối lượng phân tử là 59.000 Da

Hình 1.3 Enzyme β-amylase từ lúa mạch

(https://en.wikipedia.org/wiki/B-amylase#/media/File:2xfr_b_amylase.png) β-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật đặc biệt là hạt nảy mầm Vi sinh vật cũng

là một nguồn sản sinh β-amylase được quan tâm

 Enzyme γ-amylase (glucoamylase) (EC.3.2.1.3)

Có khối lượng phân tử lớn dao động từ 27.000 đến 112.000 Da tùy thuộc vào

nguồn gốc enzyme Enzyme γ-amylase thủy phân liên kết α-1,4 glycoside cuối cùng ở

đầu không khử của amylose và amylopectin, ngoài ra còn thủy phân liên kết α-1,6 glycoside Không giống các dạng amylase khác, γ- amylase hiệu quả nhất trong môi

trường axit và có độ pH tối ưu là 3 (Sivaramakrishnan và cộng sự, 2006)

Đây là enzyme đường hóa quan trọng nhất trong hệ amylase Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử trên mạch amilose và amilopectin tạo sản phẩm cuối cùng là glucose Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, dextrin và maltose thành glucose (Lương Đức Phẩm, 2004)

Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh glucoamylase đã được biết cho đến nay,

chi Aspergillus là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rất cao, đặc biệt là loài Aspergillus niger Đa số chế phẩm glucoammylase của vi sinh vật đều

hoạt động tốt ở vùng axit Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của

một số chủng vi sinh vật cũng bền ở pH kiềm Ví dụ, glucoamylase của loài Coniphora

cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH 9, glucoamylase của Mucor rouxianus

bền ở pH 8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Nhiệt độ tối thích của glucoamylase là 50–60ºC Tuy nhiên, cũng có trường hợp glucoamylase hoạt động tốt nhất ở 65–70ºC, ví dụ

như glucoamylase của loài C thermosaccharolytium Glucoamylase bị ức chế mạnh bởi

Hg+ nhưng các ion Mn2+ và Fe2+ lại có tác dụng kích thích sự hoạt động của enzyme này (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme amylase

Điều kiện hoạt động của enzyme amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau

 Nồng độ cơ chất

Khi phân giải cơ chất, phản ứng enzyme sẽ trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn đầu nếu nồng độ cơ chất thấp thì vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

Giai đoạn kế tiếp nếu vận tốc phản ứng xấp xỉ cực đại thì vận tốc phản ứng không phụ thuộc vào cơ chất

Giai đoạn tiếp theo nếu nồng độ cơ chất tiếp tục tăng cao thì hầu như vận tốc không tăng nữa mà đạt giá trị gần với vận tốc cực đại vì các enzyme đã bão hòa cơ chất (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998)

 Nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ enzyme Khi thừa cơ chất, nếu tăng nồng độ enzyme, tốc độ phản ứng tăng Khi enzyme đã bão hòa với nồng độ cơ chất thì có tăng enzyme vận tốc phản ứng vẫn không thay dổi

 Chất kìm hãm

Chất kìm hãm làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng Các chất này bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, đặc hiệu hoặc không đặc hiệu Tùy thuộc vào bản chất tạo phức và bản chất của chất kìm hãm người ta chia thành các loại chất kìm hãm sau:

- Chất kìm hãm cạnh tranh: Các chất này có cấu trúc tương tự cơ chất vì thế chúng

có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme Kết quả trung tâm hoạt động của enzyme bị chất kìm hãm chiếm mất, do đó cơ chất mất một phần khả năng tương tác làm tốc độ phản ứng giảm

- Chất kìm hãm không cạnh tranh: các chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở một vị trí không phải trung tâm hoạt động, kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác Vì thế các chất kìm hãm làm giảm hoạt động của enzyme

 Chất hoạt hóa

Chất hoạt hóa làm tăng hoạt độ của enzyme bằng cách gián tiếp hay trực tiếp

Hoạt hóa gián tiếp: nếu chất hoạt hóa làm tăng tốc độ phản ứng enzyme bằng cách loại chất kìm hãm khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia phản ứng nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme

Hoạt hóa trực tiếp: Các chất hoạt hóa thường tác dụng vào trung tâm hoạt động của enzyme làm biến đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác Nhiều ion kim loại thường có tác dụng theo kiểu này

Enzyme α-amylase là một metalloenzyme, chứa ít nhất một ion Ca2+ Ái lực của

Ca2+ với amylase mạnh hơn nhiều so với các ion khác Lượng canxi liên kết thay đổi từ một đến mười (Gupta, 2003) Ca2+ đóng vai trò là đồng tố trong quá trình thủy phân tinh bột

Theo nghiên cứu của Aty và cộng sự (2005), Na+ với nồng độ 0,1M làm tăng hoạt tính của α-amylase lên gấp đôi.Các tác giả cho rằng việc enzyme chịu ảnh hưởng của ion Na+ là do chúng được chiết xuất từ vi nấm có nguồn gốc từ biển

Ngoài các cation, nhiều anion cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme Tác dụng hoạt hóa của Cl- khá lớn và có thể xem là chất hoạt hóa tự nhiên của α-amylase Các anion hóa trị một khác như Br-, NO3- cũng có tác dụng hoạt hóa α-amylase (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998)

 pH

Giá trị pH của dung dịch enzyme có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác tổng thể

theo một số con đường khác nhau Giống như tất cả các protein, các enzyme có cấu trúc bậc 3 nguyên thể tương đối nhạy cảm với pH và nói chung, sự biến tính của các enzyme xảy ra tại các pH cực cao hay cực thấp (Nguyễn Văn Mùi, 2012)

Enzyme chỉ hoạt động trong phạm vi giới hạn pH, giới hạn có thể rộng từ 4 đến 5 đơn vị, hoặc hẹp trên 1 đơn vị pH Tuy nhiên, trong dải pH này, vận tốc của phản ứng enzyme sẽ thay đổi theo pH Trong phạm vi hoạt động sẽ có 1 khoảng pH tối ưu mà tại

đó vận tốc phản ứng enzyme đạt giá trị cao nhất

Theo Nguyễn Trọng Cẩn (1998), pH ảnh hưởng tới vận tốc phản ứng enzyme có thể do:

‐ pH làm thay đổi trạng thái ion hóa các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động của enzyme làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác

và có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme

‐ pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất, tại pH tối thích phân tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme Nhờ đó phản ứng có vận tốc cao nhất

Khoảng pH hoạt động của α-amylase thay đổi từ 2 đến 12 Enzyme α - amylase từ hầu hết các vi khuẩn và nấm có độ pH trong khoảng từ axit yếu đến trung tính Enzyme

α - amylase của nấm mốc hoạt động mạnh ở pH 6-7 (Saranraj và Stella 2013), của vi khuẩn pH 5,9-6,1 Nếu pH < 3 đa số α-amylase bị vô hoạt hoàn toàn, trừ α- amylase của

Aspergillus niger có thể chịu được pH 2,5-2,8 (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998)

Mặc dù hầu hết các β-amylase của nấm được nghiên cứu có hoạt tính tốt ở pH 5–

6 (Saranraj và Stella, 2013, Gautam, 1991), cũng có một số nghiên cứu cho kết quả khác

như Chatterjee và cộng sự (1988), β-amylase từ Emericella nidulans vuill-45 có phạm

vi hoạt động từ pH 6,5-7,5 và khoảng tối ưu ở 7–7,5 Các β-amylase từ Syncephalastrum

racemosum hoạt động được trong khoảng pH từ 4–7 và tối ưu tại pH 5 (Ray và cộng sự,

1998)

Enzyme amylase nói chung bền trên một phạm vi rộng của pH từ 4 đến 11 (Saito

và cộng sự, 1973, Fogarty và cộng sự, 1979, Vihinen và cộng sự, 1989, Khoo và cộng

sự, 1994, Hamilton và cộng sự, 1999) Tuy nhiên, amylase với sự ổn định trong một phạm vi hẹp cũng đã được báo cáo bởi Robyt và cộng sự năm (1971), Coronado và cộng

ở trong khoảng từ 40-60ºC, cũng có enzyme có nhiệt độ tối thích rất cao như những enzyme của những chủng ưa nhiệt (Đỗ Quí Hai, 2008)

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của α-amylase là liên quan đến sự phát triển của vi sinh vật (Vihinen và cộng sự, 1989) Nhìn chung, α-amylase bền nhiệt hơn các loại amylase khác, đặc tính này được cho là liên quan đến hàm lượng ion Canxi trong phân

tử (α-amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa canxi của nấm mốc 3-4 lần) Ngoài ra

độ bền nhiệt còn liên quan đến các yếu tố như chất nền và chất ổn định khác (Vihinen

và cộng sự, 1989) Enzyme α-amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả

Mặc dù không có nghiên cứu chi tiết về khả năng chịu nhiệt β-amylase từ vi nấm,

nhưng Emericella nidulans 45 cho thấy ở 70ºC hoạt tính của enzyme còn lại 70% (Kundu và cộng sự, 1970), trong khi β-amylase từ Paffia rhodozyma và Brettanomyces

naardensis ổn định ở 45ºC và 50ºC trong 60 phút (Gautam và cộng sự, 1991)

 Hồ hóa tinh bột

Khi amylase tác dụng lên tinh bột đã qua hồ hóa thì tốc độ thủy phân tăng lên đáng

kể, ví dụ tinh bột ngô khi bị thủy phân bởi amylase của tuyến tụy tạng lợn thì tăng nhanh

22 lần, của B subtilis thì tăng 323 lần, của A oryzae thì tăng nhanh 120.000 lần so với

tinh bột chưa qua xử lí

1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme amylase

Enzyme amylase có thể thu nhận từ các nguồn khác nhau như động vật, thực vật,

và vi sinh vật Trước đây, enzyme này được phân lập từ cây lúa mạch và cây lúa nước (Oboh, 2005) Tuy nhiên việc khai thác enzyme từ thực vật và động vật thường gặp khó khăn vì nguồn nguyên liệu hạn chế, hiệu suất thấp nên giá thành cao Hiện nay phần lớn ezyme đều được thu nhận từ vi sinh vật, vì có những đặc điểm nổi bật

Do vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng, phát triển và sinh sản nhanh, từ đó việc tổng hợp enzyme với cường độ mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzyme lớn Môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền thường là những phế liệu của ngành công nghiệp nên giá thành enzyme rẻ hơn và áp dụng cho các cơ sở sản xuất Vi sinh vật chịu ảnh hưởng rất lớn bởi thành phần dinh dưỡng, các tác động của môi trường, do đó người

ta có thể thay đổi thành phần dinh dưỡng hoặc các yếu tố khác để tổng hợp enzyme theo yêu cầu Vi sinh vật có thể dễ dàng thao tác bằng kỹ thuật di truyền hoặc các phương tiện khác Người ta thực hiện các biến dạng, đột biến và những thay đổi khác lên vi sinh vật để việc sản xuất amylase có thể được tối ưu hóa Ngoài ra, các vi sinh vật có thể được thay đổi để đáp ứng nhu cầu của các ngành công nghiệp đang phát triển và để có được các enzyme với các đặc tính mong muốn như khả năng chịu nhiệt chẳng hạn Enzyme amylase chịu nhiệt rất có lợi trong sản xuất công nghiệp vì chúng có thể làm giảm thiểu việc sinh ra các sản phẩm phụ và làm giảm thời gian phản ứng, do đó tiết kiệm đáng kể năng lượng Khi việc thủy phân do enzyme amylase được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, sự trùng hợp của D-glucose thành iso-maltose được giảm thiểu (Konsoula và cộng sự, 2007)

 Enzyme amylase từ vi khuẩn

Nhóm vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất để thu nhận là Bacillus spp Ví dụ, B

amyloliquefaciens và B licheniformis được sử dụng rộng rãi cho sản xuất thương mại

Các chủng vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí khác nhau như B cereus, B megaterium, và B

polymyxa Đã được sử dụng để tổng hợp β-amylases (Niziolek, 1997) Enzyme

α-amylases được sản xuất từ B licheniformis, B stearothermophilus, và B

amyloliquefaciens cho thấy tiềm năng đầy hứa hẹn trong một số ứng dụng công nghiệp

như trong các lĩnh vực như thực phẩm, lên men, dệt may và sản xuất giấy (Konsoula,

2007) B subtilis, B stearothermophilus, B licheniformis và B amyloliquefaciens được

biết đến là nguồn sản xuất α-amylase chịu nhiệt tốt

Enzyme được sản xuất bởi một số vi sinh vật ưa muối thường ổn định ở độ mặn cao và do đó có thể được sử dụng trong nhiều quá trình công nghiệp khắc nghiệt, nơi các dung dịch muối đậm đặc được sử dụng Ngoài ra, hầu hết các enzyme từ vi khuẩn

ưa muối chịu được nhiệt độ cao và ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài Amylase

từ vi khuẩn ưa muối như Chromohalobacter sp., Halobacillus sp., Haloarcula

hispanica, Halomonas meridiana và Bacillus dipsosauri đã được mô tả bởi Kathiresan

và Manivannan (2006)

 Enzyme amylase từ vi nấm

Các chủng vi nấm sinh amylase thường được phân lập từ trên cạn Nguồn nấm được sử dụng chủ yếu cho sản xuất thương mại enzyme amylase chủ yếu là các loài

Aspergillus và chỉ có một vài loài trong chi Penicillium Ví dụ, các loài phổ biến nhất

trong chi Aspergillus bao gồm các chủng Aspergillus spp., Aspergillus oryzae, A niger

và A awamori (Konsoula và cộng sự, 2007) Ngoài ra, Aspergillus fumigatus cũng đã

được sử dụng để sản xuất enzyme bằng kỹ thuật lên men chìm (Bin và cộng sự, 1999)

Đối với chi Penicillium, Penicillium fellutanum đã được sử dụng trong quá khứ gần đây

để sản xuất amylase bằng quá trình lên men chìm (Erdal, 2010) Penicillium expansum MT-1 đã được sử dụng để sản xuất enzyme bằng cách lên men trạng thái rắn Penicillium

chrysogenum được sử dụng làm nguồn vi sinh vật để sản xuất amylase bằng quá trình

lên men trạng thái rắn sử dụng các nguyên liệu khác nhau như lá ngô, rơm lúa mạch đen, rơm lúa mì và cám lúa mì (Goto, 1998)

Hình1.4 Chủng Aspergillus oryzae thường được dùng cho sản xuất amylase quy mô

công nghiệp

(https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Aspergillus_oryzae)

 Enzyme amylase từ sinh vật biến đổi gen

Các sinh vật biến đổi gen cũng đang được sử dụng để sản xuất α-amylase Có nhiều phương pháp khác nhau mà vi sinh vật có thể được điều khiển ở cấp độ di truyền để cải thiện và tối ưu hóa việc sản xuất enzyme này Để tạo ra các chủng biến đổi gen các vi khuẩn có thể bị đột biến bởi các tác nhân hóa học Ethyl methane sulphonate (EMS) đã được sử dụng để điều khiển di truyền của các chủng vi khuẩn (Haq và cộng sự, 2010)

Bacillus amyloliquefaciens UNG-16 đã bị biến đổi bằng cả EMS và phương pháp bức

xạ, dẫn đến chủng đột biến thể hiện hoạt tính cao gấp 1,4 lần lớn hơn so với chủng ban đầu (Haq và cộng sự, 2010)

1.2.5 Các ứng dụng của enzyme amyalse

Amylase là hệ enzyme thủy phân quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm amylase đã được khai thác theo tiêu chuẩn công nghiệp

và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

 Trong công nghệ rượu, cồn, bia

Trong vài chục năm gần đây, các nhà sản xuất đã sử dụng chế phẩm amylse từ A

oryzae, A awamori hoặc B subtilis để thay thế malt trong việc đường hóa tinh bột sản

xuất rượu, bia từ nguyên liệu có chứa tinh bột Việc thay thế này giúp tiết kiệm được hàng vạn tấn tinh bột loại tốt, giảm giá thành sản phẩm và rút ngắn quá trình sản xuất Người Nhật đã biết sử dụng enzyme của nấm mốc trong quá trình đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm Người Trung Quốc đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu từ cách đây 4000 năm Còn người Việt Nam

đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm (Đoàn Văn Thược, 2005) Riêng

ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang

mới biết sử dụng enzyme của nấm này thay amylase của malt để sản xuất cồn (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

amylase lại cao nên có thể đạt đến độ đường hóa cần thiết rất nhanh chóng, sau đó bị vô hoạt ngay Tuy nhiên, chế phẩm enzyme nấm mốc thường là một phức hệ enzym, trong

đó protease có thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

 Công nghiệp dệt

Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm Trong vải thô thường chứa khoảng 5% tinh bột và các tạp chất khác Để làm vải mềm, có khả năng nhúng nước, tẩy trắng và bắt màu tốt người ta thường sử dụng một lượng chế phẩm amylase (từ vi khuẩn hay nấm mốc) khoảng 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-

15 phút ở nhiệt độ 90ºC Phương pháp này không làm hại vải, lại có độ mao dẫn tốt, đồng thời đảm bảo vệ sinh Ngoài ra, amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm ở quy mô công nghiệp (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

 Trong sản xuất thức ăn gia súc

Amylase được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với các enzyme khác như protease, cellulase, pectinase,… để sản xuất các loại thức ăn dễ tiêu hóa cho gia súc, gia cầm, đặc biệt là vật nuôi còn non giúp tăng trọng nhanh, sinh sản tốt, sức đề kháng cao,…

 Trong y học và nghiên cứu khoa học

Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng liên quan đến ứng dụng của amylase Ví dụ, amylase cùng các enzyme khác, được dùng trong chữa bệnh do thiếu enzyme, khả năng chuyển hóa chất kém, bệnh về tiêu hóa, tim, thần kinh, … Ngoài ra, chế phẩm enzyme được dùng để điều chế môi trường nuôi vi sinh vật phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, chuẩn đoán và điều trị bệnh (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

1.3 Tình hình nghiên cứu enzyme amylase từ vi nấm biển

1.3.1 Tình hình nghiên cứu amylase từ vi nấm biển trên thế giới

Với sự ra đời gần đây của công nghệ sinh học, đã có sự quan tâm ngày càng tăng đối với các enzyme có tính chất mới lạ Khi so sánh với vi sinh vật trên cạn, vi sinh vật biển có môi trường sống cũng như cấu trúc di truyền khác hơn (Bonem và cộng sự 2013) Môi trường biển từ các vùng giàu dinh dưỡng đến các vị trí thưa thớt dinh dưỡng, nơi chỉ có một vài sinh vật có thể sống sót Sự phức tạp của môi trường biển liên quan đến

độ mặn cao, áp suất cao, nhiệt độ thấp và điều kiện ánh sáng đặc biệt, có thể góp phần

vào sự khác biệt đáng kể giữa các enzyme tạo ra bởi vi sinh vật biển và enzyme tương đồng từ vi sinh vật trên cạn Các enzyme này được sử dụng làm dược phẩm, phụ gia thực phẩm và hóa chất (Bonem và cộng sự 2013)

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu đã phân lập được một loạt các enzyme với các tính chất đặc biệt từ vi khuẩn biển, xạ khuẩn, nấm và các vi sinh vật biển khác, và một số sản phẩm đã được sử dụng trong các ứng dụng công nghiệp Nấm

có nguồn gốc từ biển có thể được coi là một nguồn sản xuất enzyme có lợi trong công nghiệp và xử lí môi trường Các enzyme thủy phân và oxy hóa như alginate lyase, amylase, cellulase, chitinase, glucosidase, inulinase, keratinase, ligninase, lipase, nuclease, phytase, protease và xylanase là các enzyme được sản xuất bởi nấm có nguồn gốc từ biển đang được quan tâm

Trên thế giới, việc nghiên cứu enzyme amylase từ vi nấm biển cũng đang được quan tâm Với sự phát triển của khoa học và công nghệ biển, các nhà nghiên cứu đã báo cáo ngày càng có nhiều chủng vi sinh vật từ môi trường sống biển có khả năng tạo ra

amylase Ví dụ, Mohapatra và cộng sự (1998) đã tìm ra một amylase mới từ Mucor sp liên kết với bọt biển Spirastrella sp enzyme này có pH tối ưu là 5,0 và nhiệt độ tối ưu

là 60ºC Hơn nữa, chủng nấm men biển Aureobasidium pullulans N13d sinh tổng hợp

amylase ngoại bào, cũng được phân lập từ các trầm tích biển sâu của Thái Bình Dương (Li và cộng sự, 2007) Ngoài ra, Chakraborty và cộng sự (2009) đã tìm thấy một loại α-

amylase mới từ nấm biển Streptomyces sp D1 bằng cách sử dụng môi trường chứa 2%

sucrose, 0,35% peptone và 0,15% chiết xuất mạch nha

1.3.2 Tình hình nghiên cứu amylase từ vi nấm biển ở Việt Nam

Ở Việt Nam, tiềm năng của các vi sinh vật biển hiện đang rất được quan tâm, tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

Doan và cộng sự (2016), cộng tác với các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu về các chủng nấm biển ở Côn Đảo, kết quả phân lập được 12 chủng nấm sợi có hoạt tính phân giải dầu Lê Thị Nhi Công và cộng sự (2013) nghiên cứu khả năng tạo màng sinh

học của chủng nấm men Trichosporon asahii QN B1 phân lập từ vùng ven biển Hạ

Long, Quảng Ninh

Nguyễn Đình Luyện và cộng sự (2012) nghiên cứu phân lập được 38 chủng nấm

từ các mẫu sinh vật biển Việt Nam nhằm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chúng Kết quả thu được 23/38 chủng có hoạt tính kháng khuẩn

Tuy có rất nhiều nghiên cứu về vi nấm biển nhưng mỗi nghiên cứu mang một mục đích khác nhau và các nghiên cứu về enzyme trong đó có amylase từ vi nấm biển lại chưa được chú ý mặc dù nguồn sản sinh enzyme này được đánh giá có tiềm năng cao Phần lớn các nghiên cứu enzyme từ vi nấm chủ yếu là ở trên cạn Các nghiên cứu về enzyme từ vi nấm sống trong môi trường nước chủ yếu là về rừng ngập mặn Ví dụ, Mai Thị Hằng và cộng sự (2001) khảo sát về khả năng sinh enzyme ngoại bào của 144 chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Giao Thủy Khưu Phương Yến Anh (2007) khảo sát hoạt tính enzyme celluluse và enzyme amylase của vi nấm ở rừng ngập mặn Cần Giờ Các nghiên cứu enzyme từ vi nấm biển hiện còn rất hạn chế ở Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là chủng nấm mốc Aspergillus aculeatus DM12M được lấy

từ bộ sưu tập vi nấm biển của nhóm nghiên cứu Vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học

và Môi trường, hiện được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trung tâm Thí nghệm - Thực hành, Trường Đại học Nha Trang Chủng nấm mốc này được phân lập từ mẫu nước biển ven bờ tại Vịnh Vân Phong đã được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên trình tự gen ITS1 - 5,8S rDNA – ITS2

Phạm vi nghiên cứu bao gồm nuôi cấy, bảo quản chủng nấm, thu nhận dịch enzyme amylase thô từ chủng nuôi cấy và khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (pH, nhiệt độ) đến hoạt động và độ bền của dịch enzyme này

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2018 đến 06/2018 tại Phòng thí nghiệm Vi sinh

và Sinh học phân tử, Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành, Trường Đại học Nha Trang

2.2 Hóa chất

2.2.1 Môi trường

 Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), Difco (Môi trường 1)

Tinh bột khoai tây 4 g/L

 Môi trường cảm ứng sinh enzyme amylase (Môi trường 2)

Môi trường Czapek- Dox cải tiến

Cân các thành phần môi trường trên hòa trong 1 L nước (500 ml nước biển + 500

ml nước cất) Điều chỉnh pH về 6,5, sau đó lắc đều đun sôi trong 1 phút, hấp khử trùng

ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút Chờ môi trường hạ nhiệt độ xuống còn 45-50oC sau đó

bổ sung kháng sinh Ampicillin (0,05%)

 Môi trường thích hợp sinh enzyme amylase (Môi trường 3)

Cân các thành phần môi trường trên hòa trong 1 lít nước (500 ml nước biển + 500

ml nước cất) Điều chỉnh pH về 5,5, sau đó lắc đều đem đi hấp khử trùng ở nhiệt độ

121oC trong 15 phút Chờ môi trường hạ nhiệt độ xuống còn 45-50oC sau đó bổ sung kháng sinh Ampicillin (0,05%)

Dung dịch tinh bột tan 1% (w/v): cân 1 g tinh bột hòa tan trong 90 ml dung dịch đệm phosphat ở trên, khuấy bằng máy khuấy từ gia nhiệt trong 15 phút cho đến tan sau

đó dẫn nước đến thể tích 100 ml và hạ nhiệt về nhiệt độ phòng

 Thuốc thử DNS

Dung dịch NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan trong 100 ml nước tinh khiết

Dung dịch Kali natri tartrat tetrahydrat 5,3 M: cân 1,496 g Kali natri tartrat tetrahydrat (C4H4KNaO6.4H2O) hòa tan trong 100 ml dung dịch NaOH 2M ở trên Khuấy trên máy khuấy từ gia nhiệt cho đến tan Không được để sôi

Dung dịch axit 3,5-dinitrosalicylic 96 mM: cân 2,19 g/100 mL axit 3,5- dinitrosalicylic (C7H22O11.H2O) hòa tan trong 1 ml nước tinh khiết Khuấy trên máy khuấy từ gia nhiệt cho đến tan, không được để sôi

Dung dịch thuốc thử màu: Lấy 12 ml nước siêu sạch đã ủ ở 50-70oC, bổ sung từ từ

8 ml dung dịch Kali natri tartrat tetrahydrat 5,3 M và 20 ml dung dịch 3,5- dinitrosalicylic axit 96 mM ở trên để thu được tổng thể tích 40 ml Bảo quản trong chai tối màu để tránh ánh sáng trong vòng tối đa 6 tháng

Dung dịch Maltose chuẩn 0,2% (w/v)

Cân 2 mg maltose /mL D-(+)-maltose hòa tan trong nước siêu sạch, sau đó dẫn tới

tổng thể tích 1 ml

 Các dung dịch đệm để khảo sát pH thích hợp và độ bền của enzyme amylase

 Đệm Glycine-HCl (pH 3)

Cách pha và điều chỉnh pH của đệm được tham khảo bởi Gomori (2004)

Trộn 25 ml dung dịch Glycine 0,2 M (15,01 g trong 1 lít nước cất 2 lần) với 5,7 ml dung dịch HCl 0,2 M Sau đó dẫn nước đến 100ml rồi chỉnh lại pH nếu cần

 Đệm Axetate (pH 4, 5)

Cách pha và điều chỉnh pH của đệm được tham khảo bởi Gomori (2004)

Chuẩn bị dung dịch A: axit axetic 0,2 M (11,55 g trong 1 lít nước cất 2 lần)

Chuẩn bị dung dịch B: Natri axetat 0,2M (16,4 g C2H3O2Na trong 1 lít nước cất 2 lần) Trộn x ml dung dịch A với y ml dung dịch B theo tỷ lệ như bên dưới, tổng thể tích dung dịch 100 ml

Cách pha và điều chỉnh pH của đệm được tham khảo bởi Sambrook (2001)

Dung dịch A: NaH2PO4 0,2M (27,8 g trong 1 lít nước cất 2 lần)

Dung dịch B: Na2HPO4 0,2M (53,65 g Na2HPO4.7H2O trong 1 lít nước cất 2 lần) Trộn x ml dung dịch A với y ml dung dịch B theo tỷ lệ như bên dưới, tổng thể tích 200ml

‐ Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

‐ Cân phân tích BL 3200H (Shimadzu, Nhật)

‐ Tủ âm sâu DF 9007 (Labkorea, Hàn Quốc)

‐ Tủ cấy (Telstar AV 100, Tây Ban Nha)

‐ Tủ sấy ED115 (Binder, Đức)

‐ Nồi hấp khử trùng (Sturdy industrial Co., Ltd, Đài Loan)

‐ Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc)

‐ Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)

‐ Tủ ấm Binder BF115 (Binder, Đức)

‐ Máy đo quang phổ UV-VIS DR6000 (Hach, Mỹ)

‐ Máy lắc nước 1205SW2 (Vision, Hàn Quốc)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu và bố trí thí nghiệm được sơ đồ hóa trong Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu và bộ trí nghiệm của đề tài

Nấm mốc Aspergillus aculeatus DM12M

Nội Dung 1: Khảo sát đặc điểm, hình thái

khuẩn lạc và tế bào

Nội Dung 2: Khảo sát khả năng sản sinh enzyme amylase bằng phương

pháp đo vòng phân giải cơ chất và phương pháp sử dụng thuốc thử DNS

Nội Dung 3: Khảo sát

pH tối ưu cho hoạt động

của enzyme amylase (4,

5, 6, 7, 8)

Nội Dung 4: Khảo sát

nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme amylase (30, 40, 50, 60,

70oC)

Nội Dung 5: Khảo sát độ

bền enzyme amylase đới

với pH (pH 4, 5, 6, 7, 8

trong 24 giờ ở 4ºC)

Nội Dung 6: Khảo sát độ

bền enzyme amylase đối với nhiệt độ (30, 40, 50,

60, 70oC; trong 15, 30, 45,

60, 75, 90 phút) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase

3 ngày, sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc

 Nuôi cấy chủng nấm mốc trên môi trường thạch để cảm ứng sinh tổng hợp amylase

‐ Nguyên tắc: khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung tinh bột tan, vi

nấm sinh enzyme amylase phân giải tinh bột thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn Các dạng này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, phần cơ chất bị nấm sợi phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo vòng phân giải trong suốt quanh khuẩn lạc

‐ Thực hiện:

Chuẩn bị môi trường cảm ứng sinh tổng hợp enzyme amylase (môi trường 2)

trên đĩa petri Đục 1 lỗ trên thạch có đường kính 0,5 cm, cắt chủng nấm sợi A aculeatus

cũng có cùng đường kính 0,5 cm (đã nuôi trên môi trường PDA trong 5 ngày) sau đó đặt vào lỗ thạch

Ủ ở nhiệt độ 28ºC Sau 3 ngày, lấy ra cho thuốc thử Lugol vào đĩa petri sao cho tràn đều khắp mặt đĩa, để 3 phút rồi đo đường kính vòng phân giải

 Nuôi cấy chủng nấm mốc trên môi trường lỏng để cảm ứng sinh tổng hợp amylase

Chủng nấm mốc trên môi trường PDA ở 28oC trong vòng 5 ngày (đường kính khuẩn lạc 3 – 3,5 cm).Dùng dao vô trùng cắt 1 miếng khuẩn lạc, kích thước 1/10 khuẩn lạc, nuôi lỏng trong môi trường cảm ứng sinh tổng hợp enzyme amylase (Môi trường 3) lắc 120 vòng/ phút ở 30ºC trong vòng 5 ngày

2.4.2 Bảo quản nấm mốc

Chuẩn bị: Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml trong ống nghiệm) khử trùng ở

121ºC trong 15 phút Ống nhựa nút xoay 2 ml, khử trùng ở 121ºC trong 15 phút Chuẩn

bị khuẩn lạc nấm sợi trên môi trường PDA nuôi ở 27ºC trong vòng 4 đến 5 ngày

Cách tiến hành: Dùng pipet Pasteur hút khoảng 03 ml glycerol đã vô trùng vào

ống giữ chủng Sau đó dùng dao vô trùng cắt lấy 1 miếng nhỏ môi trường chứa cả sợi

và bào tử nấm sợi cho vào ống giữ chủng Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút và dán nhãn Mẫu trước tiên phải để ở 5ºC (tạo điều kiện cho glycerol đi vào tế bào), sau đó được làm lạnh sâu ở -20ºC trong 3 giờ, sau đó chuyển sang – 80ºC

Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết các nấm sợi sinh bào tử và tế bào có vách ngăn Nhưng phương pháp này tỏ ra không thích hợp với các nấm sợi không sinh bào tử và không có vách ngăn Trong trường hợp này cần nuôi cấy nấm sợi trên môi trường thích hợp để tạo bào tử Nếu không khắc phục được thì phải tiến hành nuôi trên môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối và giữ trong glycerol 30% như trên Ảnh hưởng của ánh sáng đến quá trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thì sự thành công của phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử Ánh sáng

là một tác nhân quan trọng đối với quá trình hình thành bào tử của nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích quá trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc và kích thước khuẩn lạc (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2012)

2.4.3 Nhuộm đơn và quan sát hính thái tế bào nấm mốc

Nhỏ một giọt dung dịch Lactophenol Blue lên phiến kính Dùng que cấy lấy 1 ít sợi nấm dàn đều trên phiến kính Đậy lá kính lên mẫu vật Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi với vật kính X 100 (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2006)

2.4.4 Xác định hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp sử dụng thuốc thử DNS (axit dinitrosalicylic)

 Nguyên tắc

Enzyme amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành maltose (đường khử)

Tinh bột + H2O → maltose (đường khử)

Thuốc thử DNS (axit dinitrosalicylic) có màu vàng tươi, trong dung dịch kiềm sẽ

bị khử bởi đường khử (maltose) tạo thành 3-amino 5-nitrosalicylate có màu nâu đỏ hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 540 nm

1 đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme cần thiết giải phóng 1 mg maltose từ tinh bột trong 3 phút ở pH 6,9 ở nhiệt độ 20oC

 Dựng đường chuẩn Maltose 0,2% ( w/v)

Chuẩn bị 8 ống nghiệm có nắp đánh số từ 1-8 (ống 8 đối chứng) dùng pipet cho vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự lượng dịch maltose tiêu chuẩn: 0,05 ml; 0,2 ml; 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml; 1,0 ml; 2,0 ml; 0,0 ml

Dùng pipet bổ sung vào các ống nghiệm theo thứ tự lượng nước tinh khiết: 1,95 ml; 1,8 ml; 1,6 ml; 1,4 ml; 1,2 ml; 1,0 ml; 0,0 ml; 2,0 ml

Dùng pipet bổ sung vào các ống nghiệm mỗi ống 1ml thuốc thử đậy nắp và đặt trong water bath (100ºC) trong vòng 15 phút Lấy các ống nghiệm ra làm nguội trong nước đá đến nhiệt độ phòng

Thêm vào mỗi ống nghiệm 9 ml nước tinh khiết Lắc đều và đo quang phổ kế ở bước sóng 540 nm và ghi lại kết quả các mẫu thật và mẫu đối chứng