Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 166 28​

́ BỘY TÊ TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ DƢƠCC̣ HÀNÔỊ SOUTTHIDA VONGSAVATH GÓP PHẦN NGHIÊN CƢU HƠPC̣ KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 166.28 KHĨA ḶN TỚT NGHIỆP DƢỢC SI HÀ NỢI - 2013 BỘ Y TÊ TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ DƢƠCC̣ HÀNÔỊ SOUTTHIDA VONGSAVATH GÓP PHẦN NGHIÊN CƢU HƠPC̣ KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 166.28 KHĨA ḶN TỚT NGHIỆP DƢỢC SI Ngƣời hƣớng dẫn: PGS – TS Cao Văn Thu Nơi thƣcC̣ hiêṇ: Bô ̣môn Vi sinh - Sinh hoc ̣ Trường Đại học Dươc ̣ HàNơi HÀ NỢI - 2013 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 1.2 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.5 Các ứng dụng kháng sinh Đại cương xạ khuẩn 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Strepto 1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 1.4 Tuyển chọn , cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn 1.5 1.6 1.7 1.4.1 Chọn lọc ngẫu nhiên 1.4.2 Đột biến cải tạo giống 1.4.3 Bảo quản giống Lên men tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Đại cương 1.5.2 Các phương pháp lên men Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.6.1 Vai trò chiết tách tinh chế k 1.6.2 Các phương pháp chiết tách Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 1.7.1 phổ tử ngoại – khả kiến ( UV-VIS) 1.7.2 Quang phổ hồng ngoại (IR) 1.7.3 phổ khối ( MS) 13 1.8 Một số nghiên cứu liên quan 13 1.8.1 Phát nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những13 chất hóa học sinh Streptomyces sp ong bắp cày ……….13 1.8.2 Tối ưu hóa mơi trường lên men chủng Streptomyces Orientalis 4912 sinh vancomycin …… ………………… ……………………………… …………14 CHƢƠNG II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nuyên liệu thiết bị 15 2.1.1 Chủng xạ khuẩn 15 2.1.2 Ví sinh vật kiểm định 15 2.1.3 Các môi trường 15 2.1.4 Dung môi 17 2.1.5 Một số dụng cụ , máy móc 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống 19 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh 19 2.2.3 Sơ xác định số tính chất kháng sinh thu 19 2.3 Phương pháp thực nghiệm 19 2.3.1 Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn 19 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 20 2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên 21 2.3.4 Đột biến ánh sáng UV 21 2.3.5 Phương pháp đột biến hoá học 23 2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23 2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu 24 2.3.8 Tách thành phần kháng sinh sắc ký lớp mỏng .24 2.3.9 Thu kháng sinh thô phương pháp cất quay 25 2.3.10Tinh chế kháng sinh th 2.3.11Sơ xác định kháng CHƢƠNG III : KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHÂN XÉT 3.1Kết sàng lọc ngẫu nhiên 3.2Kết đột biến cải tạo giống lần 3.3Kết đột biến cải tạo giống lần 3.4Kết đột biến hóa học 3.5 Kết chọn môi trường lên men 3.6Kết lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh 3.7Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 3.8 Kết tinh chế kháng sinh sắc ký cột 3.9Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ LỜI CẢM ƠN Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS -TS Cao Văn Thu - Bộ môn Vi sinh – Sinh học người đa t ̃ âṇ tinhh̀ hướng dâñ từ bước tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo , cán , kỹ thuật viên giảng dạy , công tác taịBô ̣ môn Vi sinh - Sinh hoc ̣, Bộ môn Công Nghiệp Dược, Viêṇ vê ̣sinh dicḥ tê ̃ Trung ương, Bộ mơn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đa ̃ giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Nhân dip ̣ cung xin gưi lơi cam ơn đến Ban giam h cô giao trương ́ thơi gian hoc ̣ tâp ̣ taịtrương h̀ Đa h̀ Và cuối cùng lời cảm ơn gửi tới gia đình bạn bè đ suốt thơi gian thưc ̣ hiêṇ khoa luâṇ h̀ Do hạn chế thời gian, điều kiện trang thiết bị phương tiện nghiên cứu, khóa lṇ cịn cónhiều thiếu sót Tơi mong nhâṇ đươc ̣ sư ̣góp ýcủa thầy , bạn bè để khóa luận hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2013 Sinh viên Soutthida Vongsavath DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATCC American Type Culture Collection DM Dung mơi ĐB Đột biến ĐBHH Đột biến hóa học Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) IR Infrared ( hồng ngoại ) KS Kháng sinh MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể MTth Môi trường thích hợp MC Mẫu chứng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên SKLM Sắc ký lớp mỏng VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Ultra violet ( tử ngoại) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng Bảng 3.1: Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 3.2: Kết thử hoạt tính KS đột biến lần Bảng 3.3: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 3.4: Kết thử HTKS đột biến hóa học Bảng 3.5: Kết chọn môi trường lên men chìm Bảng 3.6: Kết chọn chủng lên men Bảng 3.7: Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung mơi Bảng 3.8: kết thử hoạt tính kháng sinh sau sắc kí lần Bảng 3.9: Kết chạy sắc ký cột lần Bảng 3.10: kết IR Bảng 3.11: Kết dự đoán từ phổ MS DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.2: Khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 1.3: Sơ phân loại xạ khuẩn Hình 1.4: Các khuẩn ty xạ khuẩn Hình 1.5: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh Hình 1.6: Đường cong sinh trưởng phát triển xạ khuẩn Hình P.1: Hình thử HTKS phương pháp khối thạch Hình P.3: Hình thử HTKS phương pháp giếng thạch Hình P.3: Hình thử HTKS phương pháp khoanh giấy lọc Hính P.4: Hình phát vết sắc ký phương pháp hình VSV Hính P.5: Kết đo phổ UV kháng sinh tinh khiết thu Hình P.6: Kết đo phổ IR kháng sinh tinh khiết thu Hình P.7: Kết đo phổ khối kháng sinh tinh khiết thu ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nước khí hậu nhiệt đới , tỷ lệ bệnh nhiễm trùng cấu bệnh cao , kháng sinh quan trọng kháng sinh công cụ đắc lực bác sỹ , dược sỹ phòng chữa bệnh, bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm , ngồi kháng sinh cịn dùng chăn nuôi , trông trọt công nghiệp thực phẩm Tuy nhiên thị trường dược phẩm nước ta , hầu hết kháng sinh nhập dạng thành phẩm bán thành phẩm , ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa thực hình thành Bên cạnh đó, Việt Nam nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao giới tổ chức y tế giới ( WHO ) Do đó, đẩy mạnh nghiên cứu , sản xuất kháng sinh có hiệu điều trị cao , độc tính thấp bị kháng thuốc yêu cầu tất yếu phát triển y tê Môi trường tự nhiên đa dạng nước ta điều kiện thuận lới cho sinh sôi , phát triển hệ vi sinh vật , đáng ỳ xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp kháng sinh , đặc biệt chi xạ khuẩn Streptomyces tất kháng sinh biết đến có khoảng 60% nhuồn gốc từ xạ khuẩn 55% số thuộc chi Streptomyces Nắm bắt xu hướng , chúng tơi lựa chọn dề tài “ Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166.28” đề làm khóa luận tốt nghiệp với mục tiêu sau:  Nghiên cứu cải tạo giống đề nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 166.28  Nghiên cứu điều kiện lên men , chiết tách, tinh chế kháng sinh tốt  Nghiên cứu vài đặc tính kháng sinh thu 33 3.7 Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung mơi  Mục đích : Chọn hệ dung mơi có khả tách thành phần dịch chiết tốt để chạy cột , tinh chể KS Xác định thành phần dịch chiết DMHC  Triển khai sắc ký lớp mỏng hệ dung mơi • Hệ 1: Chloroform: Methanol: Amoniac 25% • Hệ 2: Butanol: Ethanol: Dimethylformamid • Hệ 3: Butylacetat: Ethanol: Triethylamin • Hệ 4: Ethylacetat:propanol:dichloromethane Bảng 3.7 : Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi Nhận xét: Thấy hệ vết kéo theo bề ngang , hệ vết trịn, hệ vết kéo , hệ vết hình trịn , Hệ có khả tách tốt , sở chọn hệ dung môi chạy cột để tách kháng sinh 3.8 Kết tinh chế kháng sinh sắc ký cột  Mục đích : Tính chế , loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết  Dịch lọc dịch lên men gộp lại khoảng 6,5 lít, đem chiết n – butanol pH thu 850 ml dung môi hữu Lượng dung môi mang cất quay máy cất quay chân không Buchi Waterbath, thu 0,4953 (g) bột kháng sinh thô  Cho lượng bột chạy qua cột Silicagel với hệ dung mội khai triển hệ Lấy 15 phân đoạn , mỗi phân đoạn 5ml vào ống nghiệm Thử HTKS 34 phân đoạn phương pháp khoanh giấy lọc ( với VSV kiểm định B.cereus) kết thu cụ thể thể bảng 11 Bảng 3.8: kết thử hoạt tính kháng sinh sau sắc kí lần Phân đoạn 10 11 12 13 14 15 Nhân xét : Các phân đoạn tiến hánh chạy SKLM với cùng hệ DM để xác định thánh phần KS với kết bảng nhận thấy sau chạy sắc ký cột hỡn hợp có thánh phần Nhận thấy phân đoạn phân đoạn đến phân đoạn 10 , vết sắc ký phân đoạn ký có dạng vệt dài hình đuốc Chứng tỏ hệ khơng tách thành phần phân đoạn  Gộp dịch từ phân đoạn đến 10, cô chân không đến kết tinh, thu 0,2165 (g) bột, chạy cột sắc ký lần với hệ dung môi ethylacetat: methanol ( 15:1) Lấy 31 phân đoạn, mỗi phân đoạn 2,5 ml vào ống nghiệm Thử HTKS phân đoạn phương pháp khoanh giấy lọc 35 Bảng 3.9 : Kết chạy sắc ký cột lần Phân đoạn 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 36 Nhận xét : Dựa theo số liệu thử HTKS số liệu phân đoạn SKLM trình bày bảng thấy hệ sắc ký tách thành thành phần rõ Và chia thành nhóm sau :  Nhóm 1: từ phân đoạn đến 12 (có thành phần KS1)  Nhóm 2: từ phân đoạn 13 đến 24 (có thành phần KS1 KS2 hay phần xen phủ)  Nhóm 3: từ phân đoạn 25 đến 39 (có thành phần KS2) Gộp phân đoạn nhóm, đem chân không, kết tinh được: _ KS1: m1 = 0,0265 (g) Đây thành phần KS có màu nâu đỏ Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt 12,24% _ KS2: m2 = 0,0113 (g) Hiệu suất tinh chế kháng sinh 5,21% _ Hiệu suất tinh chế kháng sinh = hiệu suất KS1 + hiệu suất KS2  12,24% + 5,21% = 17,45% _ Phần xen phủ: mxf = 0,1175 (g) 37 3.9 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng sinh tinh khiết  Nhiệt độ nóng chảy kháng sinh đo : 215,5°C  Phổ tử ngoại cho đỉnh hấp thụ : 209,5nm ; 334nm; 443nm Từ dự đốn cấu trúc kháng có nối đơi liên hợp , dị tố kết hợp đặc điểm  Phổ hồng ngoại cho thấy bước songs hấp thụ cực đại cùng nhóm chức dự đốn tương ứng trình bày bảng 13 Đỉnh hấp phụ -1 (cm ) 3437 2961 2926 2857 1741 1651 1584 1464 1379 1296 1095 635  Phổ khối : Cho kết dự đoán khối lượng phân tử kháng sinh 1291,80160 đvC Trong phân tử kháng sinh có chứa nguyên tố bảng 14 ( Phổ khối đo Viện Hàn Lâm khoa học công nghệ Việt Nam ) 38 Bảng 3.11 : Kết dự đoán từ phổ MS Các nguyên tố C H N O S Na 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT ḶN: Qúa trình nghiên cứu chúng tơi đã hoàn thành mục tiêu ban đầu khóa luận tốt nghiệp rút số kết luận sau :  Tiến hành ĐB cải tạo giống theo phương pháp khác đã giúp tăng HTKS KS sinh tổng hợp chủng xạ khuẩn Streptomyces 166.28 Mơi trường lên men chìm tốt MT2dt  Kháng sinh thô thu sau chiết từ dịch lọc dịch lên men dung môi n-Butanol pH , tách tốt hệ sắc ký cột với hệ dung môi (Butylacetat : Ethanol : Triethylamin ( 1: 2: 1) ) Để thu kháng sinh tinh khiết cần tiếp tục chạy sắc ký lần với hệ dung môi ( Ethylacetat : Methanol (15 : 1) )  Có thành phần kháng sinh thô thu Hiệu suất tinh chế kháng sinh thu 17,45% : Hiệu suất tinh chế kháng sinh (KS1) 12,24% Hiệu suất tinh chế kháng sinh (KS2) 5,21%  Kháng sinh thứ ( KS1) tinh khiết thu có số đặc điểm sau:  Kháng sinh có nâu đỏ  Có phổ tác dụng rộng, vi khuẩn Gram (+) Gram(-)  Trong dung môi methanol, kháng sinh hấp thụ ánh sáng tử ngoại cho đỉnh hấp thụ λ1 = 209.5nm, λ2 = 334nm λ3 = 443 nm  Biện giải phổ hồng ngoại, sơ dự đốn kháng sinh có nhóm chức: amin, ceton, nitro, ether, có liên kết đơi, liên kết ba có halogen 0  Nhiệt độ nóng chảy kháng sinh T nc = 215,5 C  Kháng sinh có phân tử lượng 1291,80160 đvC 40 ĐỀ XUẤT : Từ kết đã thu được, đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu theo hướng sau:  - Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 166.28 (bằng UV, hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang,kỹ thuật gen …) để tạo chủng có khả siêu sinh tổng hợp kháng sinh  Nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng yếu tố thuộc môi trường lên men để tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh ; điều kiện để tăng hiệu suất kháng sinh hỗn hợp  Tiếp tục nghiên cứu điều kiện chiết tách để thu kháng sinh tinh khiết có hiệu suất cao hơn, dung mơi an toàn  Tiến hành biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( H-NMR 13 C-NMR) kết hợp với phổ khác để xác định cấu trúc kháng sinh tổng hợp  Giải trình tự gen để nhận biết phân loại chủng Streptomyces 166.28 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, trang PL129-PL131 Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm , NXB Y học Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr 39-67 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục , trang 38-40 Lê Huy Dương (2011), Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh Streptomyces 156.11, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ , Đại học Dược Hà Nội Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nâm gây bệnh trè thái nguyên , luận văn thạc sĩ học, Đại học sư phạm Thái Nguyên Từ Minh Koóng, Đàm Thanh Xuân (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y học, tập 10 Nuyễn Phương Nhuận , Nguyễn Văn Hiệu, Lê Gia Hy ( 2009 ), Nghiên cứu tối ưu môi trường lên men chủng Streptomyces Ỏientalis 4912 sinh vancomycin , Tạp chí khoa học cơng nghệ , tập 47, số , trang 25-34 11 Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách , phân chia, xác định chất dung môi hữu cơ, NXB Khoa học kỹ thuật , Hà Nội, taapj1, trang 9-27 12 Khuất Hữu Thanh (2005), sở di truyền phân tử kỹ thuật gen , NXB Khoa học kỹ thuật , Hà Nội , trang 185-191 42 13 Nguyễn văn (2009), Cộng nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục , Hà Nội, trang 14-57 14 Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, Hà Nội , trang 9-49 15 Cao Văn Thu, Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Liên Hương , Nuyễn Lệ Phi (2008), Vi sinh vật học, NXB giáo dục , Hà Nội 16 Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập Tài liệu tham khảo tiếng Anh 17 David A Hopwood (2007), Streptomyces in nature and medicin, Oxford university press, United States of America 18 Donald L.Pavia, Gary M Lampman, George S.Kriz (1996), Introduction to Spectrocopy, Thomson Learning, Washington, USA 19 Kino T, Hatanaka H, Hashimoto M, Nishiyama M, Goto T, Okuhara M, Kohsaka M, Aoki H, Imanaka H (1987), FK-506, “A novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces I Fermentation, isolation, and physico-chemical and biological characteristics”, The Journal of antibiotics, vol XL , pages 1249 – 1255 20 Kekuda, T.R.P., K.S Shobha and R Onkarappa, (2010) Fascinating diversity and potent biological activities of Actinomycete metabolites, J Pharm Res., page 250-256 21 Poulsen M, Oh DC, Clardy J, Currie CR (2011), Chemical analyses of wasp- associated Streptomyces bacteria reveal a prolific potential for natural products discovery, Department of Bacteriolodi, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, United States of America [pubmed] 43 Hình P.1: Hình thử HTKS phƣơng pháp khối thạch Hình P.2: Hình thử HTKS phƣơng pháp giếng thạch 44 Hình P.3 : Hình thử HTKS phƣơng pháp khoanh giấy lọc Hính P.4 : Hình phát vết sắc ký phƣơng pháp hình VSV 45 Hính P.5: Kết đo phổ UV kháng sinh tinh khiết thu 46 Hình P.6: Kết đo phổ IR kháng sinh tinh khiết thu 47 Hình P.7: Kết đo phổ khối kháng sinh tinh khiết thu ... “ Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166. 28” đề làm khóa luận tốt nghiệp với mục tiêu sau:  Nghiên cứu cải tạo giống đề nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. .. để thực nghiên cứu 31 3.5 Kết chọn môi trƣờng lên men  Mục đích : Chọn mơi trường lên men để Streptomyces 166. 28 sinh tổng hợp kháng sinh tốt  Tiến hành lên men chìm Streptomyces 166. 28 chủng... Nhận xét : Lên men chìm chủng Streptomyces 166. 28 MT2dt có hoạt tính kháng sinh manh Vì chọn MT2dt làm môi trường lên men cho nghiên cứu 32 3.6 Kết lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh  Mục